Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

该程序的总体目标是通过区室化微流控装置目视检查和表征癌细胞迁移。这是通过首先解离在无血清培养基中生长的脑肿瘤干细胞的预先存在的神经球来实现的。第二步是制造双层 SU 8 母版，并使用具有分隔设计的软光刻模具 A-P-D-M-S 印章。

接下来，组装微流控装置并加载脑肿瘤干细胞。最后，使用一体化显微系统完成脑肿瘤干细胞迁移的长期延时成像。最终，结果表明，脑肿瘤干细胞在通过超受限空间迁移过程中表现出形态学阶段的旋转序列。

与现有质量（如 Transwell Boyton Chamber）相比，该技术的主要优点是微型装置允许目视检查迁移过程、细胞的受控放置以及因子的精确递送。因此，micro foric 技术具有可靠、高效且具有成本效益的单细胞选择和导航等特点。该技术的意义延伸到癌症转移和复发的治疗，因为高度迁移细胞的单细胞分析可以确定潜在的未来化疗靶点。

虽然这种方法可以深入了解癌症系统的迁移行为，但它也可以应用于其他系统，例如胚胎发育、免疫反应、伤口愈合和器官再生。从 BTSC 衍生的神经矛的细胞悬液开始。将细胞混合在 15 mL 锥形管中，并以 900 RPM 离心 5 分钟，但不要更快。

吸出 super natin。然后将它们在 0.5 毫升预热的 Accutane 中在 37 摄氏度下孵育 5 到 10 分钟，让神经球松动。孵育后，用 P 100 移液器轻轻敲击 10 至 20 次，机械破碎细胞。

然后加入 1.5 毫升干细胞培养基以中和 Accutane 离心机，以 1300 RPM 的速度将细胞悬液重悬 5 分钟，并将细胞重悬于 1 毫升干细胞培养基中。用血细胞计数器检查细胞密度，并将密度调整为每微升 20， 000 个细胞。要开始制作 SU 8 母版，请使用 Adobe Illustrator 准备两个照片蒙版，并使用 Image Setter 进行激光打印透明胶片。

第一层光掩模由两个基准标记和一系列微通道组成，第二层光掩模具有座位室和接收室。用异丙醇清洁两层面膜，并让它们自然干燥。现在用 3 微米厚的 SU 8 光刻胶旋涂手柄晶圆，然后进行软烘烤。

然后将第一层照片蒙版置于紧密接触的 uv 中，曝光照片，抵抗并使其固化。然后进行后烘烤并显影固化的晶圆。用透明胶带覆盖手柄晶片的基准标记区域。

然后用 250 微米厚的光刻胶旋涂晶圆。然后，撕下胶带，露出标记物以用于对齐目的。放置第二层光刻胶并对齐基准标记。

然后 UV 曝光和固化第二层照片蒙版，然后进行后烘烤和显影。现在通过气相沉积对 SU 8 母版进行处理，以减少表面粘性。将晶片放入装有几滴 Tri Chloro cline 溶液的干燥液中，在真空下放置至少 1 小时。

然后，母版将准备好用于与母版一起成型 PDMS。首先，以 10 比 1 的比例充分混合预聚物基料和固化剂。然后将混合物放入干燥液中进行真空脱气，直到没有气泡。

将混合物倒在面膜上，再次脱气。如果引入新的气泡，则在 90 摄氏度的水平热板上固化模具两个小时。冷却至室温后，轻轻松开 PDMS stamp。

因此，培养通道被雕刻在 PDMS 中，并准备好组装微流体装置。母版可重复使用进行成型，直到它破裂或磨损。当母版变得粘稠时，可以重新涂抹防粘涂层。

首先通过 PDMS stamp 在微流体设备中制作入口和出口。使用活检孔穿刺，将 PDMS 印章浸泡在 70% 乙醇中 30 分钟，然后用去离子水冲洗 10 分钟，以清洁 PDMS 印章。通过高压灭菌灭菌并完成 PDMS 标记的交联反应。

现在将 PDMS 印章放在涂有聚 L 赖氨酸的玻璃盖玻片上。然后，通过储液槽入口用层压板溶液填充腔室，并在 37 摄氏度下孵育过夜，从而为该设备涂覆层压板。第二天，从设备中吸出层压板。

然后用干细胞培养基淹没装置两次来清洗装置。现在将 11 μL 解离的细胞加载到其中一个接种储液槽中 如果需要，使用真空抽吸将细胞压入接种室。然后将另外 7 微升细胞加载到相邻的固定储液槽中。

五分钟后，座水箱和接收水箱将被介质淹没。现在将 0.5 至 1 毫米厚的无菌 PDMS 片材放在设备上。PDMS 与自身的自然表面粘附将密封设备，一旦密封，即可用于运输、孵化和显微成像。

运行 45 分钟，预平衡生物 IM。为了稳定其温度、水分和空气供应，请在样品室中加入几盘水以获得适当的湿度。将准备好的设备加载到显微镜的样品室中。

使用微型镊子将设备居中。现在使用 Biot 软件设置焦点位置点和时间点，并在必要时开始延时录制。培养 5 天后，更换培养基。

中播种的 BTC 通过相位图像连续记录。在座室中 5 天，纺锤形细胞保持在迁移前阶段。当它们接近微通道入口时，一些细胞膨胀并产生粘附突起。

只有一个单元能够占据入口并探索迁移方向。一旦单元确定了迁移方向，它就会继续以稳定的高速穿过整个微通道。在微通道结束时，该单元继续探索接收室的开放空间，然后最终进入接收室。

通过观察具有两秒成像间隔的细胞，迁移能力似乎主要是由类似于 OID 细胞的 blabbing 活动产生的。在尝试该程序时，重要的是要记住该设备的设计非常灵活，以至于可以纵微通道尺寸以实现所需的细胞迁移程度。观看此视频后，您应该对如何创建适合培养目标细胞的独特区室微流控装置有很好的了解，然后进行长期延时成像以定性和定量地定义这些细胞的迁移特征遵循此程序。

可以应用其他方法，如下一代测序或 DNA 微阵列，以回答其他问题，例如高度迁移的癌细胞在遗传上有多大差异。