Name: 癌症干细胞迁移的使用进行划分的微流控芯片和活细胞成像的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习利用微流控芯片和活细胞成像技术观察脑肿瘤干细胞迁移行为。该方法可实时追踪细胞形态变化，为研究肿瘤转移机制和开发靶向治疗策略提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PAC 部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）T32 奖学金对威斯康星大学干细胞培训项目（P. A. Clark）的资助。JSK 部分得到了 HEADRUSH 脑肿瘤研究教授职位、Roger Loff 纪念脑胶质母细胞瘤研究基金以及威斯康星大学基金会/神经外科脑肿瘤研究与教育基金的支持。JCW 和 YH 部分得到了美国国立卫生研究院国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）资助项目 1R01EB009103-01 的支持。

1. BTSC 细胞解离
BTSC 来源于在无血清干细胞培养基中作为神经球培养的预先存在的细胞系，其培养方法此前已有描述10, 11。
<ol>
 <li>制备源自BTSC神经球的细胞悬液。将源自BTSC的神经球收集至15 ml锥形管中，在900 rpm条件下离心5分钟。过快的离心速度可能导致神经球剪切或损伤。吸除上清液后，将神经球培养物重悬于0.5 ml预热的Accutase溶液中。在37°C孵育5–10分钟，使神经球松散。使用P100移液器轻轻吹打10–20次以机械解离细胞，随后加入1.5 ml干细胞培养基以中和Accutase活性。</li>
 <li>将BTSC在1300 rpm条件下离心5分钟，然后重悬于1 ml干细胞培养基中。</li>
 <li>从悬液中取出50 μl分样，转移至微量离心管中用于细胞计数。向Eppendorf管中加入50 μl台盼蓝染液，混匀后将悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。</li>
 <li>根据细胞计数结果，如需要，可向BTSC悬液中添加额外的干细胞培养基，调整至活细胞密度为20,000个细胞/μl培养基。</li>
</ol>
2. 双层SU-8模具的制备及PDMS印章的成型（见图1）
我们采用光刻和软光刻技术制备SU-8母版和PDMS印章，这是微流控器件组装的关键步骤。与标准流程12略有不同，我们的SU-8母版由两层构成：在工艺早期，第一层（底层）浇铸出高3 μm的微通道；第二层（上层）则形成高250 μm的接种腔室和接收腔室。为了确保两个培养区域（微通道与腔室）之间正确连接，这两层必须精确对准位置。然而，第二层的厚度和不透明性足以阻挡基准标记/光学对准器观测到底层结构。为此，我们设计了远程定位的基准标记掩模，使得在旋涂第二层时可以选择性地遮蔽第一层中的这些标记。因此，两层结构特征可集成于同一母版中，并可用于PDMS印章的浮雕 molding 制备。
<ol>
 <li>设计并制备两张光刻掩模。第一张掩模包含两个对准标记和一组微通道（400 μm 长，10–50 μm 宽），用于第一层；第二张掩模包含播种腔和接收腔（2 mm 长，600 μm 宽），用于第二层。两张掩模均使用 Illustrator（Adobe，加利福尼亚州）设计，激光打印至透明胶片（Thin Metal Parts，科罗拉多州），并用异丙醇清洗后自然晾干。</li>
 <li>根据供应商提供的产品说明书，使用 su-8 光刻胶（MicroChem，马萨诸塞州）制备第一层。首先，在手柄晶圆（WRS Materials，加利福尼亚州）上旋涂 3-μm 厚的 su-8（5）光刻胶，随后进行前烘。然后通过紧贴式紫外曝光和固化，使用对应的掩模进行曝光，再经过后烘和显影处理。</li>
 <li>旋涂第二层 250 μm 厚的 su-8（2100）。为防止厚光刻胶遮挡第一层的对准标记，在旋涂第二层前，预先用透明胶带覆盖这些区域。旋涂完成后，将胶带撕去，暴露出对准标记以供后续对准使用。</li>
 <li>使用第二张掩模对第二层进行紫外曝光。在对准标记暴露后，可直接利用光学掩模对准仪将其与第二张掩模上的标记对齐。随后对第二层光刻胶进行紧贴式紫外曝光和固化，再进行后烘和显影。</li>
 <li>对制得的模具母版进行防粘涂层处理。为便于脱除固化的 PDMS，可通过蒸气沉积法对 su-8 母版进行硅烷化处理，使其表面形成防粘涂层。具体操作为：将母版置于真空干燥器中，加入数滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷溶液，在真空条件下静置至少一小时。</li>
 <li>使用母版对 PDMS 进行 molding。将 PDMS Sylgard 184（Dow Corning，密歇根州）的预聚体基质与固化剂按 10:1 的比例充分混合，放入真空干燥器中脱气，直至无可见气泡。将混合物浇注于母版上，若引入新的气泡则再次脱气。将模具置于水平加热板上，在 90 °C 下固化 2 小时。冷却至室温后，轻轻剥离 PDMS 印模。此时，细胞培养通道已成型于 PDMS 中，可进行器件组装。母版可重复使用，直至出现裂纹或磨损；当表面重新出现粘附性时，需再次进行防粘涂层处理。</li>
</ol>
3. 微流控装置的组装与细胞培养（图2）
为了培养细胞，需将带有微结构的PDMS印章固定在玻璃盖玻片上，以形成封闭的通道。同时需设置进样口和出样口，用于加入培养基或细胞。此外，还需对玻璃基底和PDMS印章进行清洗及其他必要处理，以确保其具备细胞相容性。
<ol>
 <li>使用活检打孔器通过PDMS印章制作储液池。我们选择其直径为6 mm。这些储液池具有两个用途：一是用于储存细胞生长所需的额外营养液；二是便于移液器加样和真空抽吸操作。</li>
 <li>将PDMS印章浸泡在70%乙醇中30分钟，然后用去离子水冲洗10分钟。目的是清除在制造过程中可能引入的有机残留物以及未交联的PDMS污染。其他研究中曾采用更强烈且更彻底的清洗方法，如有机溶剂萃取13和索氏萃取14，但在BTSC培养中我们发现这些步骤并非必要。</li>
 <li>使用高压灭菌器（121°C，35分钟）对PDMS印章进行灭菌。此步骤可进一步完成PDMS的交联反应。从本步骤开始至步骤3.6，所有操作均需在无菌条件下进行。</li>
 <li>将PDMS印章放置于预先涂覆多聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上15-17。然后通过在通道中加入层粘连蛋白溶液并在37°C下孵育过夜，对装置进行层粘连蛋白包被。随后从装置中吸出层粘连蛋白溶液，并用干细胞培养基清洗装置。</li>
 <li>将步骤1中制备的细胞悬液加入储液池和通道中。在其中一个接种储液池中加入11 μl解离后的细胞。必要时可使用真空抽吸将细胞强制导入接种室。在相邻的接种储液池中额外加入7 μl细胞。注意：平均细胞密度为20,000个细胞/μl培养基。五分钟后，在接种储液池和接收储液池中加入培养基以充满整个区域。</li>
 <li>在顶部覆盖一层0.5–1 mm厚的预灭菌PDMS薄膜。两片PDMS之间自然形成的表面粘附作用将使细胞培养装置密封，从而可用于转运、培养及显微成像。</li>
</ol>
4. 使用 BioStation IM（Nikon Instruments Inc, Melville, USA）对 BTSC 迁移进行长期延时成像。
将相机、软件和培养箱全部集成于一个设备中，该显微系统可实现对细胞培养连续数天无干扰的成像。此外，其独特的电机设计在点位访问功能中移动物镜，同时保持样品台静止不动，从而便于对平行实验进行成像，并在高通量分析中追踪细胞运动。
<ol>
 <li>预先将 Biostation IM 平衡 45 分钟，以稳定温度、湿度和空气供应。在样品室中放置多个含水培养皿以维持适当的湿度。</li>
 <li>将含有细胞的装置放入显微镜的样品室中，并使用微型镊子将其居中定位。</li>
 <li>在 Biostation 软件中设置焦距、位置点和时间点，然后开始延时成像。</li>
</ol>

5. 代表性结果：
使用分区化微流控装置对癌细胞迁移进行肉眼观察与表征的示例如图3和图4所示。所用细胞系为BTSC。在当前实验设置下，可对细胞培养进行长达5天（图3）的连续相位成像，成像频率可高达每2秒一次（图4）。超过5天后，需更换培养基以补充营养并清除代谢废物。通过长期延时成像，我们根据形态学变化识别出细胞迁移过程中的六个连续阶段。如图3所示，我们将这些阶段描述为：（i）迁移前阶段，（ii）启动阶段，（iii）路径探索阶段，（iv）巡航阶段，（v）目的地探索阶段，以及（vi）迁移后阶段。在接收腔中，纺锤形细胞处于阶段（i），类似于实体瘤中的细胞，能够生长、分裂并逐渐迁移。当它们接近微通道入口时，少数细胞进入阶段（ii），此时细胞展开并形成黏附性突起。通常仅有一个细胞能够占据入口并进入阶段（iii），在此阶段探索迁移方向。一旦细胞确定迁移方向，便进入阶段（iv），以稳定且高速的状态穿过整个微通道。到达微通道末端后，细胞进入阶段（v），探索接收腔的开放空间，随后进入阶段（vi）。在微通道中，迁移动力主要由细胞出芽（blebbing）活动产生，如图4所示，类似于变形虫样细胞的运动方式。细胞出芽及膜形变过程在此均被完整记录。
<img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="光刻工艺示意图；在带有光刻胶的硅片上进行紫外光曝光，用于微加工。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 微流控装置的制备示意图。整个过程在3英寸硅衬底晶圆上通过改进的软光刻技术进行。第一层制作出3 μm高的微通道和对准标记。随后旋涂250 μm厚的SU-8，同时用透明胶带覆盖对准标记，以确保后续光刻对准时掩模对准器可识别标记，避免厚光刻胶遮挡视线。由此可在第二层制作腔室结构，并与第一层实现精确对准。最终从所获得的模具上复制出PDMS印章。
<img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="微流控装置示意图；PDMS 微通道、细胞培养腔室；细胞接种、培养基流动。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 装置组装与细胞接种过程示意图。由 PDMS 和玻璃盖片封闭形成的三维培养空间，包含培养腔室、储液池和微通道。接种腔室中填充细胞培养液，而接收腔室初始时填充无细胞培养基。连接两者的微通道为细胞从接种侧向接收侧迁移提供迁移路径。
<img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="显示细胞从接种室迁移至接收室的PDMS微通道流动示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. BTSC细胞通过微通道的迁移过程。上图：延时成像快照显示单个细胞（以绿色高亮）从接种侧迁移超过400 μm到达接收侧。整个迁移过程约持续2天，期间伴随一系列细胞形态学变化。比例尺为40 μm。下图：迁移六个阶段的示意图。迁移前（i）：在接种室中，纺锤形且具有分裂能力的细胞逐渐相互沿同一方向迁移。靠近微通道入口的细胞通过极化细胞体并伸出片状伪足相互竞争。启动（ii）：迁移能力最强的细胞占据通道入口，而其他竞争细胞则退缩。路径探索（iii）：迁移细胞转变为低极性的阿米巴样模式。该迁移模式具有极强的运动性，可通过膜泡状突起向各个方向探索迁移路径。巡航（iv）：一旦确定迁移路径，细胞会通过维持一个较大的前向突起，转变为适应性的阿米巴样模式。由此，细胞保持高运动性的同时，也具备稳定的方向和速度。目的地探索（v）：到达路径末端时，细胞运动减慢，并形成丝状伪足以探索接收室中可能的侵袭靶点。迁移后（vi）：进入接收室后，细胞转变为星状，仍保持高运动性，但无明确迁移方向。
<img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig4.jpg" alt="昆虫运动分析，示意图，箭头标记，方向性运动，生物力学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 时间推移成像的快照显示 BTSC 细胞出泡活动及膜变形的周期：(A–B) 起始阶段；(B–D) 扩展阶段；(D–F) 回缩阶段。箭头和曲线分别表示膜变形的方向和位置。快照每 8 秒采集一次。

<ol><li>Carke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Stem+Cells-Perspectives+on+Current+Status+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22AACR+Workshop+on+Cancer+Stem+Cells.+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions.</a> AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).</li>
<li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer cell invasion.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15, 87-96 (2005).</li>
<li>Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+Cancer%3A+Cancer+Stem+Cells+versus+Clonal+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution.</a> Cell. 138, 822-829 (2009).</li>
<li>Karnoub, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+within+tumour+stroma+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 449, 557-557 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+Devices%3A+New+Tools+for+Studying+Cancer+and+Cancer+Stem+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Tumor+Cell+Cytoskeleton+Organization+on+Invasiveness+and+Migration%3A+A+Microchannel-Based+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).</li>
<li>Irimia, D., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+migration+of+cancer+cells+under+conditions+of+mechanical+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement.</a> Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).</li>
<li>Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).</li>
<li>Clark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cancer+stem+cells+exhibit+decreased+dependence+on+exogenous+growth+factors+for+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).</li>
<li>Regehr, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).</li>
<li>Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Dynamic+Microtubule+Invasion+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines.</a> Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Vitzthum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+exchange-mediated+pH%28i%29+regulations+in+neuronal+soma+and+neurites+in+compartmentalized+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices.</a> Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).</li>
<li>Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+signaling+pathways+in+brain+tumor-derived+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells.</a> Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).</li>
<li>Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hierarchy+of+Self-Renewing+Tumor-Initiating+Cell+Types+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma.</a> Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).</li>
<li>Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+Stem+Cell+Lines+Expanded+in+Adherent+Culture+Have+Tumor-Specific+Phenotypes+and+Are+Suitable+for+Chemical+and+Genetic+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens.</a> Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).</li>
<li>Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The biology of cancer stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).</li>
<li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的微流控装置和图像记录技术可实现对细胞迁移过程中细胞形态的可视化表征。与现有的传统方法相比，该微流控平台具有成本低、通量高和设计灵活等优势。所展示的显微可视化系统可用于长期活细胞迁移过程的研究与记录。镜头电机化功能使得在不干扰样本的情况下，以高图像分辨率追踪多条迁移路径成为可能。
在装置组装过程中，为便于聚-D-赖氨酸（PDL）包被（步骤 3.4），聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章会暂时性地与玻璃盖玻片键合。实现良好的密封对于本方案的成功至关重要。装置制备过程中引入的污染，例如印章中的气泡或基底上的灰尘/碎屑，可能破坏键合效果并导致液体泄漏。因此，以无尘方式处理装置对于防止装置失效非常重要。在进行 PDL 包被前，玻璃盖玻片需经硝酸处理，PDL 溶液需经离心处理，以去除灰尘/碎屑。若不具备洁净室条件，我们发现使用透明胶带、酒精冲洗和水浴对清除 PDMS 印章上的灰尘/碎屑非常有帮助。在 PDMS 印章与玻璃盖玻片接触后，用镊子轻轻敲击印章有助于实现密封。
可通过干细胞培养基中的成球培养法，从人手术室标本中富集脑肿瘤干细胞（BTSCs），该方法类似于正常神经干细胞的培养方法10。以此方式富集的BTSCs表现出类似干细胞的特性，例如表达干细胞标志物（CD133、nestin）、向多种神经谱系（胶质细胞和神经元）分化，以及在原位免疫缺陷小鼠模型中仅需100个细胞即可启动肿瘤形成18。尽管目前对于BTSCs的纯化与维持仍存在一些争议1, 19-21，但成球培养的BTSCs能更好地保持亲本肿瘤的表型和基因型22-24。
这种分隔的空间模拟了细胞迁移的生理环境。在我们的装置中，脑肿瘤干细胞（BTSC）通过调节细胞形态，表现出穿越尺寸受限空间的强迁移能力。我们对细胞形态变化的表征揭示了一种六阶段序列中的模式转换，可能为BTSC侵袭邻近脑组织提供一种新的、更详细的描述模型。在早期阶段，细胞获得显著的极性，并产生黏附性突起，从而有效地将自身锚定在微通道内。一旦细胞在微通道中占据位置，便会转换为巡航模式，并在整个微通道迁移过程中维持该模式。在此阶段，BTSC保持高运动性和一致的方向性，同时节约能量。有趣的是，一个微通道似乎一次仅允许一个细胞进入巡航状态；当单个细胞进入此阶段时，其他细胞会从微通道中撤退。这种机制可能有助于确保肿瘤扩散的有效性，并防止微通道内营养物质的过度消耗。在完成穿越微通道的迁移后，细胞重新表现出多向突起的倾向，并进一步探索侵袭靶点或新的迁移路径。这种具有空间分隔的微流控装置为体外研究BTSC对脑实质的浸润提供了一种新颖的微环境构建方法。
该方法可轻松适用于其他肿瘤类型来源的肿瘤干细胞（CSC）和迁移性细胞系的研究。在配备有培养箱和组织培养技术的现代生物学实验室中，均可开展在微流控装置中培养细胞的实验。只要具备SU-8模具母版，经过基本的软光刻技术培训后，即可完成PDMS浇铸和装置组装。此外，通过整合其他功能模块（如梯度混合器、表面图案化、流体控制和微电极），该平台还可拓展用于其他应用。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;高糖DMEM培养基</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11965</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>火腿&amp;rsquo;s F12</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>31765</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>B27添加剂（不含维生素A）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（PSA）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15240</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF），人重组</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），人重组</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>肝素钠盐（源自猪肠黏膜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1027-250KU</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>层粘连蛋白（天然小鼠）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR005</td><td>脑肿瘤干细胞（BTSC）培养所需材料</td></tr><tr><td>干细胞培养基</td><td></td><td></td><td>&lt;ul&gt;&lt;li&gt;30 % Hams F12 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;70% DMEM&lt;/li&gt;&lt;李&gt;1% 抗生素-抗真菌剂&lt;/li&gt;&lt;李&gt;2% B27（不含维生素A）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;EGF（20 ng/mL）和 bFGF/肝素（20 ng/mL bFGF，5 mg/mL 肝素）：混合各组分，使用前经无菌过滤&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）/肝素</td><td></td><td></td><td>&lt;ul&gt;&lt;li&gt;分装浓度 20 &amp;#x03BC;g/ml&lt;/li&gt;&lt;李&gt;对于25 &amp;#x03BC;g：向25 mL中加入1.25 mL浓度为5 mg/mL的肝素 &amp;#x03BC;bFGF。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;对于250 &amp;#x03BC;g：向250中加入1 mL 5 mg/mL肝素溶液 &amp;#x03BC;g bFGF。转移至15 mL锥形管，加入11.5 mL浓度为5 mg/mL的肝素至锥形管中。 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;储存为50 &amp;#x03BC;升或250 &amp;#x03BC;-80℃下分装保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td></td><td></td><td>&lt;ul&gt;&lt;李&gt;分装浓度 20 &amp;#x03BC;g/ml&lt;/li&gt;&lt;李&gt;对于200 &amp;#x03BC;g：向200中加入1 mL无菌DMEM（Gibco 11965-118） &amp;#x03BC;g EGF。转移至15 mL锥形管，加入9 mL DMEM。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;500 &amp;#x03BC;g：向200加入1 mL无菌DMEM（Gibco 11965-118） &amp;#x03BC;g EGF。转移至50 mL锥形管，加入24 mL DMEM。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;储存为50 &amp;#x03BC;升或250 &amp;#x03BC;-80 下分装保存&amp;#x00B0;C. &lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td>肝素</td><td></td><td></td><td>&lt;ul&gt;&lt;李&gt;分装浓度 5 mg/ml&lt;/li&gt;&lt;李&gt;称取100 mg肝素。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;将100 mg肝素加入20 mL（70%）DMEM-（30%）F12-（1%）PSA（14 mL DMEM，6 mL F12，200 &amp;#x03BC;L PSA&lt;/li&gt;&lt;李&gt;无菌滤器&lt;/li&gt;&lt;李&gt;储存为50 &amp;#x03BC;升或250 &amp;#x03BC;-80 下分装保存&amp;#x00B0;C&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 光刻胶</td><td>MicroChem 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅衬底晶圆</td><td>WRS 材料</td><td>3P01-5SSP-INV</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>道康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>50 &amp;#x03BC;PBS缓冲液中以达到最终浓度 g/ml</td></tr><tr><td>Biostation IM</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用分区化微流控装置和活细胞成像评估癌干细胞迁移

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

在过去的40年中，美国在癌症研究方面投入了超过2000亿美元，但仅使死亡率下降了5%。改善患者预后的重大障碍之一，在于对与侵袭性癌细胞浸润、转移及治疗耐药相关的细胞迁移机制理解不足1。多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme, GBM）是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤2，正是这一难题的典型代表。尽管已采用标准的手术、放疗和化疗手段，患者的中位生存期仍仅为15个月，主要原因在于GBM对邻近脑组织的侵袭性强以及癌症快速复发2。异常细胞迁移机制与肿瘤微环境之间的相互作用，可能是区分癌细胞与正常细胞的关键因素3。因此，要改进针对GBM的治疗策略，必须更深入地理解癌细胞的迁移机制。近期研究表明，GBM中的一小部分细胞亚群——脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell, BTSC）——可能在治疗耐药和复发中起关键作用。目前，关于BTSC迁移能力的潜在机制才刚刚开始被阐明1,4。
由于视觉检测和几何操作的局限性，传统的迁移实验5仅能对整体细胞群体进行定量分析。相比之下，微流控装置由于可与现代显微镜技术兼容并能精确控制微环境6-9，因而能够实现单细胞水平的分析。
我们介绍了一种利用分区化微流控装置对脑肿瘤干细胞（BTSC）迁移进行详细表征的方法。这些由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的装置将组织培养环境划分为三个相互连接的区域：接种室、接收室和连接微通道。我们对装置进行了优化，使两个腔室均能容纳足够的培养基，从而在4至5天内无需换液即可维持BTSC的活性。将具有高度迁移能力的BTSC最初接种于接种室中，其在通过连接微通道迁移至平行的接收室后得以分离。该迁移过程模拟了癌细胞在脑组织间质空间中的扩散。在数天内持续记录细胞迁移过程中的活细胞相位图像。因此，可将高度迁移性的BTSC分离出来，进行再培养并进一步分析。
对微流控系统进行区室化设计可成为研究脑肿瘤干细胞（BTSCs）及其他癌症干细胞迁移行为的多功能平台。通过结合梯度发生器、流体操控模块、微电极及其他微流控组件，这些装置还可用于药物筛选和疾病诊断6。分离出具有强侵袭性的迁移细胞亚群，将有助于深入探究其潜在的分子机制。

介绍了一种用于研究癌症干细胞迁移的分区化微流控装置。该新型平台可构建可存活的细胞微环境，并实现对活细胞运动的显微可视化观察。通过分离出高迁移活性的癌细胞，可用于研究其侵袭性浸润的分子机制，有望为未来开发更有效的治疗策略提供依据。

在过去40年中，美国在癌症研究方面投入了超过2000亿美元，仅使死亡率下降了5%。一个主要的……

本实验的总体目标是通过一种分区式微流控装置，对癌细胞的迁移进行直观观察和表征。首先，将已在无血清培养基中培养的脑肿瘤干细胞神经球解离；第二步，利用软光刻技术制备具有分区结构的双层SU-8模具，并以此制作PDMS印章。接下来，组装微流控装置并接种脑肿瘤干细胞。最后，使用一体化显微系统实现对脑肿瘤干细胞迁移的长期延时成像。最终结果表明，脑肿瘤干细胞在通过超限域空间迁移时，呈现出一系列循环往复的形态学阶段。与现有的Transwell Boyton小室等方法相比，该技术的主要优势在于微装置能够实现对细胞迁移过程的可视化观察、细胞的可控定位以及因子的精确递送。因此，微流控技术具备可靠、高效且成本低廉的单细胞筛选与导向特性。该技术的应用前景涵盖癌症转移与复发的治疗，因为对高迁移性细胞的单细胞分析可能揭示潜在的未来化疗靶点。尽管该方法可为癌症系统的迁移行为提供研究依据，但也可应用于其他系统，如胚胎发育、免疫反应、伤口愈合以及器官再生。首先从BTSC来源的神经球细胞悬液开始。将细胞收集至15毫升锥形管中，在900 RPM条件下离心5分钟，但不可更快。吸去上清液。然后将神经球置于0.5毫升预热的Accutase中，在37摄氏度孵育5至10分钟，使其解离。孵育结束后，用P100移液器轻轻吹打10至20次，机械性地分散细胞。然后加入 1.5 毫升干细胞培养基以中和 Accutase，将细胞悬液在 1300 RPM 条件下离心五分钟，并用 1 毫升干细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板检测细胞密度，并将密度调整至每微升 20,000 个细胞。开始制备 SU-8 模具母版时，使用 Adobe Illustrator 设计并结合图像绘图仪将图案激光打印至透射胶片上，制备两张光刻掩模。第一层光刻掩模包含两个对准标记和一组微通道，第二层光刻掩模则具有固定腔和接收腔。用异丙醇清洁两层掩模，并使其自然晾干。接着，在手柄晶圆上旋涂一层厚度为三微米的SU-8光刻胶，随后进行前烘。然后将第一层光刻掩模与紫外光紧密接触，对光刻胶进行曝光并使其固化。随后进行后烘并显影已固化的晶圆。用透明胶带覆盖手柄晶圆上的对准标记区域。然后在晶圆上旋涂250微米厚的光刻胶。之后，剥离胶带以露出用于对准的标记。涂覆第二层光刻胶，并对准基准标记。然后对第二层光刻胶掩模进行紫外曝光并固化，接着进行后烘和显影。通过蒸镀法对SU-8模具进行硅烷化处理，以降低表面黏性。将晶圆放入干燥器中，并加入数滴三氯硅烷溶液，在真空条件下放置至少一小时。随后即可使用该模具对PDMS进行 molding。首先，将预聚体基质与固化剂按10比1的比例充分混合，然后将混合物置于干燥器中进行真空脱气，直至看不到气泡为止。将混合物倒入模具中，并再次脱气。如果引入了新的气泡，则将模具置于水平的加热板上，在 90 摄氏度下固化两小时。待其冷却至室温后，轻轻取下 PDMS 印模。因此，细胞培养通道已雕刻在PDMS上，可随时用于微流控装置的组装。只要未出现裂纹或磨损，该模具可重复用于成型。当模具表面变粘时，可重新涂覆防粘涂层。首先通过PDMS印章在微流控装置上制备进样口和出样口。使用穿刺活检钻孔器打孔后，将PDMS印章浸入70%乙醇中30分钟以进行清洁，随后用去离子水冲洗10分钟。通过高压灭菌法对PDMS印章进行灭菌并完成交联反应。现在将PDMS印章放置在涂有多聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上。然后通过储液池入口向腔室中注入封片溶液，对装置进行封片处理，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天，从装置中吸除封片溶液。然后用干细胞培养基将装置冲洗两次。现在将11微升解离的细胞加入其中一个接种储液池中。如有需要，可使用真空抽吸促使细胞进入腔室。随后，向相邻的沉降储液池中再加入7微升细胞。五分钟后，座位区和接收储液区将充满培养基。现在将一片厚度为0.5至1毫米的无菌PDMS膜放置在装置上。PDMS与自身表面的自然黏附性会密封该装置，一旦密封完成，即可用于运输、孵育和显微成像。通过运行45分钟使生物素化装置IM预平衡。为稳定其温度、湿度和空气供应，在样品室中加入数个盛水的培养皿以达到适当的湿度。将制备好的装置放入显微镜的样品室中。使用微型镊子将装置置于中心位置。然后使用 Biot 软件设置焦距位置点和时间点，必要时开始延时成像记录。培养五天后，更换培养基。在装置中接种的 BTCs 通过相差成像被持续记录。在培养腔室中培养五天期间，梭形细胞保持在迁移前阶段。当细胞接近微通道入口时，少数细胞发生伸展并产生黏附性突起。只有一个细胞能够占据入口并探索迁移方向。一旦细胞确定了迁移方向，便会以稳定且较高的速度穿过整个微通道。在微通道末端，细胞会先探索接收室的开放空间，然后最终进入其中。通过以每两秒一次的成像间隔观察细胞，发现细胞的迁移动力主要来源于类似于OID细胞的出芽样活动。在进行该操作时，需要注意该装置的设计具有高度灵活性，可通过调整微通道的尺寸来实现所需的细胞迁移程度。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建一种独特的可区室化微流控装置，用于培养您感兴趣的细胞，并在此基础上进行长期延时成像，从而对这些细胞的迁移特性进行定性和定量分析。其他方法，如下一代测序或DNA微阵列，也可用于回答其他问题，例如高迁移性癌细胞在遗传上存在怎样的差异。

evaluation-cancer-stem-cell-migration-using-compartmentalizing

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

癌症干细胞迁移的使用进行划分的微流控芯片和活细胞成像的评价

我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置，证明了表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞（NSCs）的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统，特别是在细胞来源稀少（如人神经干细胞）且实验周期至关重要的情况下。...

利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

在本视频中，我们通过趋化迁移实验板对脑肿瘤干细胞进行迁移实验，以分析目标药物对活体脑肿瘤干细胞迁移的影响。活细胞成像技术有助于在实验过程中对细胞迁移进行可视化观察和定量分析。...

脑肿瘤干细胞（BTSC）迁移实验用于药物处理研究：一种体外活细胞成像技术，用于分析药物处理对BTSC迁移的影响

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

微加工通道中细胞迁移的研究

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。...

一种可定制的细胞迁移测量装置

本研究报道了两种用于分析细胞侵袭和迁移的不同方法：Boyden小室实验和 体外...

细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较

本文介绍了活细胞成像技术，用于在不同处理条件下，随时间定量测量胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移和侵袭能力。...

活细胞成像实验用于研究胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移与侵袭

介绍了一种基于HMCA的成像板，用于进行侵袭实验。该成像板可促进三维（3D）肿瘤类球体的形成，并可检测癌细胞向细胞外基质（ECM）中的侵袭。侵袭实验的定量通过半自动分析实现。...

基于水凝胶微室阵列（HMCA）培养板的癌细胞侵袭分析与抗转移药物筛选

本方案描述了一种集成化方法，可在单一平台上实时研究癌细胞的迁移与侵袭，为细胞运动性及形态学研究提供了一种易于重复且高效省时的选择。...

使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

本文介绍了一种制备和培养血脑屏障转移性肿瘤微环境的实验方案，并利用共聚焦成像和人工智能（机器学习）对其状态进行定量分析。...

利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。...

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

学习利用微流控芯片和活细胞成像技术观察脑肿瘤干细胞迁移行为。该方法可实时追踪细胞形态变化，为研究肿瘤转移机制和开发靶向治疗策略提供可靠工具。

利用分区化微流控装置和活细胞成像评估癌干细胞迁移

探索更多视频