Name: 使用荧光和放射性示踪剂制造和标记微气泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习脂质微泡制备与一锅法放射性标记技术，实现超过95%标记效率且无需纯化。该方法保持微泡理化特性，适用于多种配方，为癌症成像和治疗研究提供可追踪的多模态微泡工具。

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我们感谢多伦多安大略省大学健康网络时空靶向与辐射反应放大（STTARR）项目的 Deborah Scollard 和 Teesha Komal 提供的技术服务与指导。我们还感谢 Mark Zheng 和 Alex Dhaliwal 博士在共聚焦显微镜实验期间提供的技术协助，以及多伦多安大略省先进光学显微镜设施提供的相关设备。我们谨此致谢以下资助机构：加拿大卫生研究院、特里·福克斯研究所、加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大创新基金会、玛格丽特公主癌症基金会、加拿大研究主席计划、麦克劳克林中心、范尔奖学金计划、安大略省研究生奖学金计划、加拿大前列腺癌基金会以及彼得伯勒 K. M. 亨特慈善基金会。

作者声明无利益冲突。

目前的脂质微泡放射性标记方案可实现&#62;95% 的放射化学纯度、&#62;95% 的螯合效率，并在无需任何标记后纯化的前提下保留微泡的理化性质。这些成果是以往现有标记方法所未能达到的。由于省去了纯化步骤，放射性核素（本例中为铜-64）可更快投入使用，从而减少因放射性衰变导致的无效活度损失。微泡性质的保持，结合铜-卟啉螯合物已知的稳定性33，更能确保后续的放射性成像或治疗所反映的是目标微泡的特性，而非游离放射性核素或经纯化处理后改变性质的微泡群体的特性。
本方案也是首个整合了并行的&#34;冷&#34;标记与关键表征技术的方法，以确保微泡理化性质的保留。事实上，这是首个对微泡的尺寸、产率和稳定性进行系统表征的放射性标记微泡方案。理解这些性质对于放射性标记微泡的应用至关重要。必须掌握微泡的尺寸、气体体积和产率，才能确定微泡的剂量，而剂量又直接影响微泡-聚焦超声（FUS）治疗的安全性和有效性。例如，微泡-FUS 血脑屏障（BBB）开放存在微泡剂量/气体体积的上限，超过该限值可能导致FUS后出血和炎症，带来安全隐患<sup class="...

微泡是一种微米级的超分子诊疗剂，其核心为气体，外层由蛋白质、聚合物或多数情况下的脂质壳包裹以维持稳定图1A）。当注入血液后，微泡可维持气/液界面，在其气体核心溶解前的数分钟内可通过超声检测到1,2因此，微泡的首次临床应用是作为实时超声成像的对比剂3治疗性聚焦超声（FUS）的发明拓展了微泡的临床应用。在低频FUS刺激下，微泡发生振荡，产生从短暂的血管通透性增加到局部组织消融等一系列可调控的靶向机械力4,5因此，在过去20年中，微泡联合聚焦超声（microbubble-FUS）已被用于血脑屏障（BBB）开放、肿瘤（如胰腺癌、脑瘤及肝转移性癌症）的药物和成像探针递送、神经退行性疾病治疗以及肿瘤消融。6,7,8,9,10,11.
微泡诊疗工具的发展正不断朝着新颖而令人振奋的方向推进。传统的微泡-聚焦超声（FUS）递送应用依赖于在给予治疗剂或成像载荷的同时联合使用商用微泡。目前，人们日益关注通过深入理解微泡壳层与生物体之间的相互作用、探索定制的非商用微泡配方，以及开发将载荷直接负载于微泡壳层上的一体化诊疗型微泡，来增强微泡-FUS的递送能力12,13,14。事实上，约40%的脂质微泡药物递送研究采用了此类壳层负载型微泡15。除了成像和药物递送外，微泡-FUS在增强癌症放射治疗效果方面也展现出潜力16，并可通过声动力疗法激活原本无害的壳层负载试剂的抗肿瘤作用17,18。
通过在微泡外壳上标记放射性示踪剂，可更战略性地推进微泡在癌症应用中的传统与拓展方向。在一体化载药微泡领域，此类放射性标记能够：1）实现对载药微泡外壳在靶向与非靶向组织中生物分布的金标准定量评估；2）建立药代动力学结构-活性关系，从而指导微泡组分的最优选择，以最大化靶向递送效率；3）为一体化载药系统的战略性、合理化的影像引导应用与治疗规划提供依据（例如组织靶点类型、剂量测定、药物选择以减轻非靶向安全性问题，以及相较于传统联合治疗模式的效用评估）。15,19在临床前阶段，对微泡壳层去向的深入理解也有助于阐明微泡-聚焦超声（FUS）更广泛的作用机制。例如，已有研究表明，微泡壳层中的脂质向靶细胞转移可影响FUS介导的声孔效应12,20因此，理解并优化这种转递过程可为涉及声孔效应的临床前及临床微泡-聚焦超声治疗提供重要依据（体外 转染、药物递送、肿瘤消融、辐射增敏和声动力治疗20,21,22,23,24,25). 双模超声与放射成像设施还可实现仅使用单一显像剂即可对聚焦超声血管开放及治疗过程进行监测（例如血脑屏障开放动力学），而无需采用传统的双显像剂设计26同理，脂质微泡的放射性标记可作为一种一体化单剂微泡-FUS/放射治疗替代方案，取代微泡-FUS与放射性药物共递送平台。27.
微泡的不稳定性为这类标记带来了不容忽视的挑战。目前所有已有的放射性标记策略均受限于已知会影响微泡稳定性和尺寸的纯化方法，其中一些方法还存在标记效率低下和标记不稳定的问题28,29,30,31,32。纯化步骤的要求还导致实验流程更加耗时。结合使用半衰期较短的放射性同位素（例如 18F t1/2 1.8 h28,29，99mTc t1/2 6 h32，68Ga t1/2 1 h31），这会导致因放射性同位素衰变而产生的效率损失，并限制放射性成像和治疗规划的时间窗口。总体而言，这些局限性可能导致获得的放射性成像时间缩短且缺乏代表性、药代动力学数据不准确，以及肿瘤部位放射性同位素递送效率低下。
本研究通过利用卟啉强大的稳定金属螯合能力，克服了上述局限性。卟啉是一类有机杂环大分子，具有高度共轭的平面环结构和一个可容纳多种金属的中心配位位点。其中包括半衰期较长的放射性同位素铜-64（t1/2 12.7 h），该同位素可用于正电子发射断层扫描（PET）和γ计数分析33。当与脂质骨架偶联时，卟啉可被快速整合至超分子结构中，并高效、稳定地螯合铜-64，同时保持未标记母体颗粒的原有特性，且在血清中具有良好的稳定性33,34。此外，卟啉本身具有荧光活性，在纳米和微米颗粒中可发生模块化的自猝灭现象，当颗粒破裂时荧光得以恢复；这一特性为PET和γ计数提供了互补的检测手段，有助于实现整体和显微水平上的壳层命运分析（图1A）15。
通过使用卟啉-脂质作为螯合剂，利用这些特性开发出一种新型的一步法、无需纯化的微泡放射性标记方法（图1B，C) 克服了现有微泡放射性标记方法相关局限性的技术。该方案实现了 &gt;95% 的铜-64螯合效率，无需标记后纯化，且保持微泡的理化性质。可轻松整合到脂质微泡激活前的“自下而上”制备过程中。图1B）。该方法具有多功能性，可成功应用于不同酰基脂质链长度（C16至C22）、电荷类型（中性与阴离子）及卟啉脂质组成（1 mol%、10 mol%、30 mol%）的定制化或商业化微泡制剂，生成兼具放射性和荧光活性的微泡。其适应性还可拓展至卟啉以外的分子。该“一锅法”方案可经修改，使用其他市售的螯合剂（如二乙烯三胺五乙酸（DTPA）-脂质）和荧光染料（如DiI）。此外，也可通过“掺入”（spiking）策略对预先制备的微泡制剂进行标记。因此，该方法可实现定制化、可追踪（放射性、荧光性或双模放射/荧光活性）微泡的制备，有助于推动微泡-聚焦超声（FUS）在机制研究、成像及治疗应用中的发展。下述方案详细说明了脂质微泡的制备、一锅法放射性标记的操作流程、必要的放射性标记效率及理化性质表征，以及可能的方案优化。
<img alt="卟啉脂质微泡形成示意图；荧光、超声、放射性标记过程设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：微泡制备及放射性标记方案。（A）以焦脱镁叶绿酸-a-脂质形式存在的卟啉脂质在本方案中作为多模态螯合剂。作为与铜-64螯合的单体（i），其具备正电子发射断层扫描（PET）及成像能力。其荧光在颗粒形态下（微泡（ii）及其溶解后产生的纳米后代（iii））被淬灭，而在颗粒破裂后（iv）恢复荧光。（B）本报告所述的脂质膜水合/活化方案，用于从头开始生成脂质微泡；（C）在脂质悬浮液形成与微泡活化之间整合一步法放射性标记。该图经Rajora等15许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>华盛顿大学医学院，马林克罗特放射学研究所</td><td>N/A</td><td>小体积订购&amp;lt;10 &amp;micro;L) 溶于 0.1 N HCl</td></tr><tr><td>乙酸&amp;nbsp;</td><td>任何公司</td><td></td><td>&amp;ge; 95% 纯度</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>任何公司</td><td></td><td>纯度： &amp;ge; 98%</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>任何公司</td><td></td><td>可测量至 0.1 mg</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>任何公司</td><td></td><td>可加热至69 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>CC光圈 - 30微米</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A36391</td><td>颗粒直径范围：0.6–18 μm</td></tr><tr><td>CC电解液</td><td>贝克曼库尔特</td><td>8546719</td><td>Isoton II 稀释液</td></tr><tr><td>CC 软件</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤装置（0.5 mL，30,000 MWCO）及配套的微量离心管</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0.5 mL</td></tr><tr><td>15 mL 带盖离心管</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>任何公司</td><td></td><td>纯度： &amp;ge; 99.8%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>库尔特计数器</td><td>贝克曼库尔特</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e 库尔特计数器</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR 微型盖玻片</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td>任何公司</td><td></td><td>确保未氧化</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>比色皿-石英，1 cm光程</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>比色皿 - 用于CC测量的10 mL塑料比色皿</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A35471</td><td>库尔特计数器 Accuvette ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>任何公司</td><td></td><td>可通过超纯水净化系统获得</td></tr><tr><td>DiI（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）</td><td>任何公司</td><td></td><td>粉末状</td></tr><tr><td>剂量校准仪</td><td>任何公司</td><td></td><td>能够读取铜-64</td></tr><tr><td>DPPA（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸钠盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>DPPC（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000]（铵盐））</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>DTPA-脂质（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-二乙烯三胺五乙酸（铵盐））</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>γ计数器</td><td>任何公司</td><td></td><td>能够读取铜-64</td></tr><tr><td>伽马计数管推入式管帽</td><td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>12 mm试管用带法兰插头盖</td></tr><tr><td>伽马计数管</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL，75 x 12 mm，PS</td></tr><tr><td>玻璃烧杯 - 250 mL</td><td>任何公司</td><td></td><td>可耐受高达 100 的温度 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>玻璃干燥烘箱</td><td>任何公司</td><td></td><td>可加热至 80 oC</td></tr><tr><td>玻璃微量注射器 - 25、50、100、1000 &amp;micro;L</td><td>任何公司</td><td></td><td>与有机溶剂兼容</td></tr><tr><td>20 mL 玻璃闪烁瓶</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&amp;reg; 闪烁小瓶，硼硅酸盐玻璃，带螺口盖，含纸浆衬垫</td></tr><tr><td>玻璃小瓶 - 0.5 打兰</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR 小瓶，1/2 dr，带黑色酚醛螺旋盖和聚乙烯覆面纸浆衬垫</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td>纯度：&amp;nbsp; &amp;ge; 99.0%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>刻度移液管/移液枪</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热/搅拌板</td><td></td><td></td><td>配备温度探头以实现自动温度控制</td></tr><tr><td>盐酸 - 0.1 N</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTLC 板</td><td>安捷伦</td><td>A120B12</td><td>&amp;nbsp;iTLC-SA 色谱纸</td></tr><tr><td>实验室组织样本</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养基真空过滤装置</td><td>任何公司</td><td></td><td>0.22 微米孔径，PES 膜，500 mL 漏斗容量</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>任何公司</td><td></td><td>纯度：&amp;nbsp; &amp;ge; 99.8%，HPLC 级，符合 ACS 规格</td></tr><tr><td>非无菌微量离心管 - 1.5 mL</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌微量离心管 - 1.5 mL</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 - p1000，p200，p20，p10</td><td>任何公司</td><td></td><td>确保已校准</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost Plus 预清洁载玻片</td></tr><tr><td>针头 - 18 G</td><td></td><td></td><td>无菌的</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>不含氯化钙和氯化镁的改良型DPBS，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>纯度：&amp;nbsp; &amp;ge; 99.8%</td></tr><tr><td>PFP 系列</td><td>任何公司</td><td></td><td>直径1/4英寸的塑料软管，截取约50厘米长</td></tr><tr><td>PFP 调节因子</td><td>Swagelok</td><td>SS-1RF4 和 SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 标准液 4 和 7</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p1000、p200、p10 移液器吸头——非无菌</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p1000、p200、p10 移液器吸头——无菌</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 塑料注射器</td><td>任何公司</td><td></td><td>无菌的</td></tr><tr><td>丙二醇</td><td>BioShop</td><td>PRO888.500</td><td>纯度：&amp;nbsp; &amp;ge; 99.5%</td></tr><tr><td>焦磷酸脂质</td><td>N/A</td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>橡胶头镊子</td><td>任何公司</td><td></td><td>建议使用细尖头与平头/方头边缘的混合工具</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 - 1 N</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 - 10 N</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>任何公司</td><td></td><td>可实现410 nm激发和600-850 nm发射</td></tr><tr><td>荧光光谱法软件</td><td>Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>任何公司</td><td></td><td>一次性、塑料、无菌</td></tr><tr><td>注射器滤器 - 0.2 微米孔径</td><td>任何公司</td><td></td><td>膜材料：聚醚砜（PES）或其他适用于乙酸铵/乙酸和磷酸盐缓冲液（PBS）的材料</td></tr><tr><td>试管 - 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器/真空</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>在方案中称为机械式试管振荡器</td></tr><tr><td>称量纸</td><td>任何公司</td><td></td><td>为避免产品损失，建议将称量纸裁剪为 3x3 cm 的正方形</td></tr></tbody></table>

制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

微泡是具有脂质外壳的充气颗粒，已从血管超声造影剂发展为革命性的癌症治疗平台。当与治疗性聚焦超声（FUS）结合使用时，微泡可安全且局部地克服生理屏障（例如血脑屏障），将药物递送至原本难以触及的癌症病灶（如胶质母细胞瘤和胰腺癌），并用于治疗神经退行性疾病。微泡-FUS的治疗手段正朝着新的方向发展，包括与放射治疗的协同联合应用、多模态成像技术，以及从微泡外壳实现一体化的药物装载与递送。
使用放射性示踪剂标记微泡是建立这些扩展性诊疗功能的关键。然而，现有的微泡放射性标记策略依赖于已知会干扰微泡理化特性的纯化方法，使用半衰期较短的放射性同位素，且并不总能实现稳定的螯合。这些因素共同导致了微泡放射成像准确性以及肿瘤部位放射性同位素递送效率的不确定性。
本方案描述了一种新型的一锅法、无需纯化的微泡标记方法，可在实现&#62;95% 放射性核素螯合效率的同时，保持微泡的理化性质。该方法具有良好的通用性，可成功应用于不同酰基脂质链长度、电荷以及螯合剂/探针（卟啉、DTPA、DiI）组成的定制型和商业化微泡制剂。该方法既可在从头制备微泡的过程中灵活应用，也可用于已制备好的微泡制剂，实现荧光及多模态荧光/放射性性质的模块化定制。因此，这种灵活的方法能够制备出可追踪的（放射性、荧光或放射/荧光双活性）定制化多模态微泡，有助于推动微泡-聚焦超声（FUS）在机制研究、成像和治疗应用中的发展。

制备放射性标记微泡时的关键可量化结果是放射化学纯度和放射性标记效率。本方案分别采用薄层色谱法（iTLC）和经过验证的离心程序对这两项指标进行表征。图2A显示，在模拟商用微泡的配方中，当载体脂质被1 mol%、10 mol%或30 mol%的吡咯脂质取代时，平均放射化学纯度和标记效率均达到或超过95%。其中，1 mol%和10 mol%吡咯脂质配方需要更高浓度的脂质悬浮液（0.15 mL vs 1 mL）才能达到上述数值。本方案实现的高放射化学纯度和螯合效率，使得标记后无需进行纯化步骤。
对于由C16、C18和C22链长脂质组成且整体表面电荷为中性或阴离子的替代配方，这一现象同样成立（图2B）。这些变体以30 mol%的焦磷酸脂质组分进行装载，该比例基于先前确定的上限，可维持平均微泡尺寸及可接受的微泡产率（&gt;1 × 109 微泡·mL-1，以及限制 &gt;8 µm 在最大化热脂质及其可激活荧光与金属螯合能力的同时生...

本方案概述了脂质微泡的制备方法，以及一种兼容的“一锅法”微泡放射性标记技术，该方法标记效率超过&gt;95%，无需纯化步骤，且能保持微泡的理化特性。该方法适用于多种不同的脂质微泡配方，可根据需要定制，以制备放射性标记和/或荧光标记的微泡。

微泡是具有脂质外壳的充气颗粒，已从血管超声造影剂发展为革命性的癌症治疗手段……

微泡是充满气体的超声敏感性颗粒，具有独特的癌症成像和治疗能力。通过构建以应用为导向的可示踪微泡，可战略性地拓展其不断发展的应用前景。为促进实现这一目标，我们开发了一种脂质微泡制备方案，可定制化地制备无标记、放射性标记、荧光标记以及多模态微泡。实现高效且稳定的微泡放射性标记是一项非同寻常的挑战。脂质微泡较为脆弱，因此在制备后进行放射性标记时，若涉及加热、长时间处理或纯化步骤，可能会干扰其理化特性及稳定性。另一方面，制备前放射性标记则需要专用设备，并会增加辐射暴露风险。我们通过开发一种新的杂交方案来克服这些挑战，该方案在微泡激活之前、但脂质悬浮液形成之后进行放射性同位素螯合。这种“一锅法”策略首次实现了高效、无需纯化的微泡放射性标记，同时保持了微泡颗粒的理化性质。该方案另一个关键优势在于其通用性：既可在从头定制微泡制备过程中整合使用，也可适用于市售的预制微泡脂质悬浮液。该方法可成功应用于多种不同的微泡脂质和螯合剂组合，因而能够制备出具有特定功能的放射性、荧光性或三模态微泡。这些特性共同实现了对微泡脂质外壳的多模态示踪，有助于深入理解其作用机制，并推动以微泡为核心的超声治疗在多个领域的应用发展，包括微泡药代动力学研究、多模态成像、治疗方案设计以及协同治疗的实现。[旁白] 开始使用微量移液器时，沿小瓶中选定的微泡脂质膜边缘加入一毫升 AA-PGG 溶液，避免产生气泡。将瓶盖部分盖住瓶口，留出足够空间插入全氟戊烷（PFP）导管。将 PFP 气体通入小瓶液面上方顶空区域 20 秒，然后盖紧瓶盖。将小瓶下半部分浸入 70 至 80 摄氏度的水浴中加热一分钟。随后在 69 摄氏度的超声水浴中超声处理小瓶 30 秒。超声结束后，擦拭小瓶并使其冷却至室温。用 PFP 气体重新填充小瓶顶空区域，然后盖紧瓶盖，并用 Parafilm 膜密封瓶口边缘。在结晶皿中设置 60 摄氏度水浴，将磁力搅拌子放入皿中，并将结晶皿置于温控加热搅拌板上。将温度探针插入水中以监测温度，并调节搅拌速度，形成微弱但可见的漩涡。使用镊子将装有氯化铜（以 0.1 N 盐酸形式存在的铜-64）的密封小瓶转移至活度计中，记录铜-64 的活度及测量时间。再用镊子将小瓶从活度计中取出，放入铅容器中。为计算单位为兆贝可每毫升（MBq/mL）的数值，将活度计读取的活度除以铜-64 溶液的体积。打开脂质悬液小瓶瓶盖，并将其固定在小瓶架上。然后使用镊子打开铜-64 小瓶瓶盖。用微量移液器吸取相当于 40 至 250 兆贝可活度的铜-64 溶液，转移至脂质悬液中。使用带扁平橡胶头的镊子，上下翻转放射性脂质悬液至少五次，使铜-64 充分混入悬液中。当小瓶直立时，轻轻弹击瓶盖，同时稳定小瓶。小心地部分打开瓶盖，插入连接 PFP 气体的针头。向小瓶顶空区域通入 PFP 气体 20 秒，然后盖紧瓶盖并用 Parafilm 膜密封。使用活度计测量小瓶的放射性活度，并记录时间。接下来，将小瓶放入泡沫小瓶架中，使小瓶下半部分暴露于热源。将泡沫架浸入 60 摄氏度的搅拌水浴中，加热一小时。在此期间，准备 iTLC 薄层色谱条：将玻璃微纤维色谱纸裁剪成条状，并在 80 摄氏度的玻璃干燥烘箱中加热以活化。一小时后，从水浴中取出小瓶，用纸巾擦拭瓶口边缘。使用带橡胶头的镊子上下翻转小瓶。当小瓶直立时，轻轻弹击瓶盖，同时稳定小瓶。移除 Parafilm 膜，擦拭瓶盖周围以去除残留水分。取 1 至 2 微升脂质悬液，点样于已活化的 iTLC 色谱条底部中央一厘米处。让点样斑点自然干燥。使用微量移液器向 10 毫升试管底部加入 200 微升 iTLC 展开剂。将试管置于铅容器中。将点样后的 iTLC 色谱条放入试管中，展开至展开剂前沿距色谱条顶端约一厘米处。随后，用镊子取出已展开的色谱条，垂直持握。在与伽马计数器兼容的 5 毫升塑料管上方，将色谱条剪成三段。向各管中插入推盖。使用伽马计数器测量各含色谱条的试管及一个空白对照管中的铜-64 活度。记录每分钟计数（CPM），并从其他读数中减去空白管的计数，以校正本底辐射。然后根据校正后的每分钟计数计算放射化学纯度。接下来，打开放射性标记脂质悬液小瓶的瓶盖，向悬液中加入 8.89 微升 1 N 氢氧化钠溶液。盖紧瓶盖并翻转混匀小瓶，轻轻敲击瓶身以去除瓶盖空腔中残留的悬液，然后用 PFP 气体填充顶空区域。将小瓶置于机械振荡器上，以 4,530 转每分钟（RPM）振荡 45 秒，生成乳白色的微泡悬液。待其自然冷却至室温后，轻柔地倒置小瓶以重新悬浮微泡悬液。将小瓶平放于台面，静置两分钟。在此期间，将 1 毫升塑料注射器装配 18 号针头，并通过反复抽吸和排出空气的方式排出注射器内空气。两分钟后，迅速打开小瓶瓶盖，从小瓶底部吸取 400 至 550 微升悬液。小心擦拭针头边缘，将微泡悬液转移至微量离心管中。盖紧管盖后，使用活度计测量最终微泡产物的放射性活度，并记录时间。将测得的活度值除以倾取体积，得到单位为兆贝可每毫升（MBq/mL）的活度浓度。首先，取 10 至 200 微升微泡悬液，加入适配的 0.5 毫升、30,000 分子量截留的微量离心过滤装置中，置于配套的微量离心管内。在室温下以 12,000 × g 离心 10 分钟。接着，使用剪刀剪断微量离心管与其管盖之间的连接。将管盖放入标记为“CAPS”的 20 毫升闪烁液小瓶中。将过滤装置转移至标记为“TUBE 2”的新微量离心管中。将含有上清液的第一支微量离心管放入标记为“TUBE 1”的 20 毫升闪烁液小瓶中。向 TUBE 2 中的过滤装置加入 200 微升重蒸水。再次以 12,000 × g 离心 10 分钟。最后一次转移过滤装置后，向 TUBE 3 中的过滤装置加入 200 微升蒸馏水并进行离心。离心结束后，剪下离心管的管盖，将其加入管盖闪烁液小瓶中，并将过滤装置转移至新标记为“UNIT”的 20 毫升闪烁液小瓶中。将 TUBE 3 放入新的 20 毫升玻璃闪烁液小瓶中。盖紧五个闪烁液小瓶，并准备一个空的、加盖的闪烁液小瓶作为空白对照。使用伽马计数器测量六个闪烁液小瓶中的铜-64 活度。从其他小瓶的测量值中减去空白对照的计数。计算放射性标记或螯合效率。

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Cancer Research

癌症研究

使用荧光和放射性示踪剂制造和标记微气泡

制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。...

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

本文所述方案可用于表征用于超声触发药物递送应用的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 体外 和 体内...

用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

本文介绍了一种将表达绿色荧光蛋白的胰腺癌细胞（PANC-1 GFP）原位植入Balb-c Ola...

胰腺癌荧光原位小鼠模型

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内...

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

腹腔镜胰十二指肠切除术（LPD）相较于开腹胰十二指肠切除术可能具有更多优势，包括术后早期活动、减少胃排空延迟以及更短的住院时间。然而，LPD 在技术上具有挑战性，且目前尚无标准化操作流程，尤其是在胰腺吻合方面。本文介绍一种在 LPD 术中进行胰腺吻合的标准化技术：改良 Blumgart...

腹腔镜胰十二指肠切除术联合改良Blumgart胰肠吻合术

非整倍性会导致基因组不稳定，最终产生具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞。本文提供了一种简单便捷的方法，用于分离停止分裂的具有复杂核型的非整倍体细胞。...

生成与分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞

本实验方案的目的是演示前列腺癌细胞的前列腺内注射，随后进行阉割。在具有临床相关性的肿瘤微环境和免疫健全宿主的背景下，建立依赖雄激素及去势抵抗性前列腺癌的原位临床前模型，对于研究该疾病至关重要。...

一种用于雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的生物发光与荧光同基因小鼠原位模型

本文介绍了一种用于在细胞水平上进行中至高通量蛋白质磷酸化事件分析的实验方案。磷酸化流式细胞术是一种强大的方法，可用于表征信号转导异常、鉴定和验证生物标志物，以及评估药物效应动力学。...

采用荧光细胞条形码技术的磷酸化流式细胞术用于单细胞信号通路分析与生物标志物发现

本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。...

荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

多重荧光免疫组织化学是一种新兴技术，可在完整的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中实现多种细胞类型的可视化。本文提供了成功进行七色多重染色的指导原则，包括抗体和试剂优化、切片制备、实验设计以及避免常见问题的建议。...

优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

学习脂质微泡制备与一锅法放射性标记技术，实现超过95%标记效率且无需纯化。该方法保持微泡理化特性，适用于多种配方，为癌症成像和治疗研究提供可追踪的多模态微泡工具。

制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

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