上皮癌细胞无支架 3D 培养物中的异多细胞基质细胞驱动侵袭

对于被诊断患有乳腺或胰腺实体瘤的患者，疾病进展事件（如转移或治疗耐药）与不良结果之间存在很强的相关性。已知控制组织稳态和纤维化的细胞分子机制也控制实体瘤进展。我的实验室对了解这些机制感兴趣，以便我们能够更好地开发疗法和诊断措施来帮助患者。

主要的实验挑战之一是迫切需要能够捕捉生理和病理生理过程中细胞间相互作用的 3D 癌症模型，然后通过了解这些相互作用，可以了解对疾病的更多见解，从而开发新的治疗策略。我们的方案将提供一种经济高效且可重复的 3D 细胞培养方法，可复制体内组织微环境特征。我们的方案将提供一种简单快速的无支架和基于支架的 3D 细胞培养方法，我们可以量化异质细胞相互作用。

我们发现了一种高效配制 3D 球状体培养物的方法，该方法可以与无支架模型一起使用，也可以与基于支架的系统合并以测量细胞侵袭和行为。首先，打开紫外线灯对生物安全柜内部消毒 15 分钟。打开生物安全柜窗扇以稳定气流并打开真空吸液系统。

用 70% 乙醇清洁真空吸液系统的内罩表面和管道。在微珠浴中将细胞培养基、PBS 和 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 加热至 37 摄氏度。现在，在显微镜下检查细胞以确认 70% 至 80% 的汇合度。

使用真空抽吸器，从铺板的细胞中吸出并丢弃培养基。用 2 毫升 PBS 洗涤剩余的培养基一次，然后在洗涤后吸出并丢弃 PBS。接下来，使用微量移液器向细胞培养皿中加入 1 毫升胰蛋白酶，并将板放入 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中 5 分钟。

现在，在板中加入 PBS 中的一毫升大豆胰蛋白酶抑制剂以灭活胰蛋白酶。为了分散细胞簇，使用 P-1000 微量移液器移液液体混合物。从板底部收集细胞悬液，并将其转移到 15 mL 锥形管中。

在室温下以 100 G 离心试管 5 分钟，然后使用真空抽吸器弃去上清液。让分子荧光探针在 37 摄氏度回火的珠浴中加热至室温 15 分钟。使用微量移液器，将细胞重悬于两毫升相应的工作细胞追踪染料培养基溶液中。

将试管在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育。孵育 30 分钟后，在室温下以 100 G 离心试管 5 分钟。然后，使用真空吸液吸出并丢弃上清液。

使用微量移液器将沉淀彻底重悬于一毫升含 10% FBS 的 DMEM 中。现在，收集 10 微升细胞悬液并将其转移到含有等体积台盼蓝的微管中。混合细胞后，将 20 μL 细胞台盼溶液添加到细胞计数室载玻片中。

将玻片插入自动细胞计数仪中以确定细胞数。从两个读数计算平均总活细胞数。为每种细胞类型制备浓度为 6.67 倍 10 的 3 个细胞/毫升的工作细胞原液，相当于每 300 微升 2， 000 个细胞。

使用微量移液器，将 3 次技术重复所需的体积加上 1 次额外的体积转移到微管中。用移液管充分混合后，将 300 微升样品转移到 U 形底部超低附件 96 孔微孔板的孔中。将 96 孔板放入 37 摄氏度的培养箱中。

使用相差显微镜每 24 小时对球状体生长和形态进行一次成像，最长可达 96 小时。打开成像和自动培养箱设备。在成像软件的任务管理器中创建新的成像方案，以捕获与 BJ-5ta 成纤维细胞共培养的 BT-474 球体的 48 小时生长，以及分别用细胞追踪剂染料染色的蓝色、橙色和深红色染色的 EA.hy926 内皮细胞。

在冰桶中装满冰块，以保持基底膜提取物溶液低温，然后将溶液放在冰上。使用多通道移液器，从培养皿中吸出大约 170 微升培养基。获得放大镜和迷你灯箱以仔细观察小球体。

将 96 孔球状体板放在灯箱上，并将放大镜放在头顶上方。将 P-200 移液器设置为 30 微升，并收集基底膜提取物以产生三个微滴。确保 96 孔板平放，并将移液器垂直放置在球体上方。

现在，在不接触孔底的情况下释放液滴。将板放入 37 摄氏度的培养箱中 20 分钟。孵育后，每孔用额外的 50 μL 基底膜提取物溶液覆盖球状体，并在 37 摄氏度下孵育板 30 分钟。

然后，使用微量移液器向每个孔中加入 100 μL 细胞培养基。接种后 72 小时，与 EA.hy926 和 THP-1 或 BJ5-ta 和 THP-1 共培养的 MCF-10A、MCF-10Ca1H 和 BT-474 细胞与单一培养的上皮球体相比，球体面积显著增加。相比之下，与单一培养相比，共培养的 MDA-MB-468 细胞的球状体面积显着降低。

在球体建立之前将细胞跟踪染料应用于 BT-474 致瘤上皮细胞和基质细胞表明，基质细胞，包括 EA.hy926 和 BJ-5ta，在中央 BT-474 球体的周边形成出芽结构。铺板后 24 小时，基底膜覆盖在与基质细胞共培养的 BT-474 致瘤上皮细胞上，证明侵袭性结构的形成。