Name: 用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 学习多模态光学成像平台用于细胞代谢研究，结合多光子荧光、二次谐波和受激拉曼散射技术，实现无标记生物正交成像。该方法可同步可视化代谢、形态和分子组成，助力疾病与衰老机制研究。

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感谢 Gloria Pryhuber 博士及其 HuBMAP 团队成员提供人肺组织切片。感谢 Kun Zhang 博士提供人脑组织。同时感谢 Gen-Sheng Feng 博士提供小鼠肝脏样本。本研究得到以下资助：NIHU54DK134301、NIH R01GM149976、NIH U01AI167892、NIH R01HL170107、&#160;NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIH U54CA132378、加州大学圣地亚哥分校启动资金、斯隆研究奖学金以及 CZI DAF2023-328667 奖项。

1. 无标记多模态成像实验
注意：本方案重点介绍无标记多模态成像的设置与采集流程。
<ol>
	<li>多模态显微镜的搭建（图1A）和系统校准
	<ol>
		<li>预热激光器，并等待约15-20分钟。</li>
		<li>接通控制单元和显示器的电源，顺序如下：控制箱 | 触摸屏控制器 | 主激光器遥控交流适配器 | 副激光器遥控交流适配器。</li>
		<li>打开硅光电二极管探测器和锁相放大器的电源。</li>
		<li>配置泵浦激光束和斯托克斯激光束。设置激光系统，配备一个 泵浦光束 可调范围从 780 nm 至 990 nm，5 - 6 ps 脉冲宽度，以及 80 MHz 重复频率。该 斯托克斯激光束 具有固定的波长 1,031 nm 与一个 6 ps 脉冲 和 80 MHz 重复频率。确保泵浦光束和斯托克斯光束均处于低功率状态（至少 20 mW），以便在准直板上可见。</li>
		<li>在光路中（激光盒后方）放置一个对准板，以检查泵浦光和斯托克斯光束的空间重叠情况，并调节反射镜，直至两个光斑在对准板中心完全重合。 
		注意：尽管泵浦光与斯托克斯光的光束已大致重叠，但进一步精细调节两束激光的空间重叠可获得最佳的受激拉曼散射（SRS）信号。</li>
		<li>空间重叠后，通过首先点击 PSD（位置敏感探测器）进行精细调节 OPO 控制 软件。使用该 六角扳手 仔细调节光学镜1（OM1），同时观察PSD显示的X-Y位置变化，以使偏移中心的程度最小。随后，为进行更精确的调节，使用 六角扳手 直到位置指示器在PSD显示上居中为止。 
		注意：OM1 和 OM2 是OPO腔内的两面镜子，用于调节激光准直。</li>
		<li>最后，通过调节两个聚光镜居中螺丝，将虹彩光圈的图像移至视野中心，以实现聚光镜的居中。 
		注意：视野光圈可限制进入物镜的光束直径，从而排除杂散光，提高图像对比度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无标记多模态成像采集步骤
	<ol>
		<li>将油滴加到高数值孔径（1.4 NA）油浸聚光镜上，并将显微镜载玻片安装到涂油的聚光镜上。最后，在载玻片上放置一大滴水，用于25倍水浸物镜。确保显微镜牢固安装且不可移动，然后调节z轴载物台以调整焦距，直至在25倍水浸物镜下观察到生物样本的明场图像。</li>
		<li>按正确顺序开始成像过程：MPF、SHG 和 SRS，以避免光漂白，从而影响 MPF 的图像质量和精确分析。为快速切换 MPF 和 SHG，需从泵浦光束切换至固定的斯托克斯光束。 
		注意：将泵浦激光器从 800 nm（NADH 和 FAD 自发荧光）调节至 791.3 nm（CH3 拉曼位移）可能需要1-2分钟。</li>
		<li>选择每种模式的图像分辨率（512 × 512 像素）和合适的停留时间。对于平均帧数高于3的多光子荧光（MPF）和二次谐波（SHG）模式，使用8 µs/像素；对于受激拉曼散射（SRS）模式，使用40 µs/像素，平均帧数为2。 
		注：平均帧数是指在保存前需要进行平均的图像数量。</li>
		<li>为了通过多光子荧光（MPF）获取自发荧光信号，关闭斯托克斯激光束，将泵浦激光器调至800 nm以激发NADH和黄素。将FVOPT滤光立方体安装至光路中，其中NADH和黄素的检测波长分别为460 ± 10 nm和515 ± 10 nm。样品上的激光功率约为15 mW。</li>
		<li>使用SHG获取胶原纤维信号。关闭泵浦激光束，仅使用斯托克斯激光束，并将功率设置为500 mW。仅采集与515 nm滤光片相关的通道。</li>
		<li>使用受激拉曼散射（SRS）获取蛋白质和脂质的空间分布。保持两束激光开启，并调节激光频率，使其与每种分子的特定振动模式相匹配。 
		注意：通常使用 791.3 nm 作为 CH 的检测波长3，797 nm 用于 CH2787 nm 用于检测不饱和脂质，794.6 nm 用于检测饱和脂质。因此，样品上的功率约为 40 mW。</li>
		<li>为获取SRS超光谱图像数据集，打开OPO控制软件进行选择 扫查，将波长范围设置为 780 nm 至 806.5 nm，并选择一个 堆叠编号 的 至少 60然后，采集高光谱图像序列。 
		注意：所得数据集包含60幅图像，每幅图像代表在特定拉曼位移（从2,700 cm⁻¹）处的空间分布-1 至 3,150 cm-1）。高光谱采集时间取决于图像的视场（FOV）和扫描时间，对于512 × 512的图像，采集时间大约在5分钟至8分钟之间。对于更大的图像，应尽量缩短样品在激光下的暴露时间，以避免光损伤，光损伤可能在暴露2小时后发生（具体时间取决于样品厚度和视场大小）。</li>
		<li>将所有相同感兴趣区域（ROIs）的图像保存在同一文件夹中。图像格式为 Olympus .oir 文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 图像分析
<ol>
	<li>使用图像处理软件打开所有保存的原始图像，为图像显示分配颜色并添加比例尺。同时使用该软件生成NADH和饱和脂肪酸（SFAs，2,880 cm-1）图像的二值掩膜，用于光学氧化还原比和脂质不饱和度分析。 
	注意：确保掩膜强度仅包含0和1。</li>
	<li>使用自行编写的Python脚本进行后续分析（代码可在&#160;https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis 获取）。&#160; 
	注意：该脚本设计用于处理对照组和癌症样本中的多个感兴趣区域（ROIs）。脚本的主要功能仅需两个输入：对照组和癌症图像文件夹的文件路径。
	<ol>
		<li>遍历文件夹，匹配具有相同基名的图像（例如，&#34;roi_1_flavin.tif&#34;、&#34;roi_1_nadh.tif&#34;、&#34;roi1_mask.tif&#34;）。</li>
		<li>对于每组匹配的图像，让脚本执行比值分析，并基于这些计算生成新的比值图像。 
		光学氧化还原比的计算公式为：黄素 / (NADH + 黄素)。 
		&#8203;脂质不饱和度的计算公式为：USFAs / (SFAs + USFAs)，其中USFAs代表不饱和脂肪酸。</li>
		<li>所有来自图像的比值数据随后存储于pandas DataFrame中以便于操作。执行单因素方差分析（one-way ANOVA），并使用matplotlib配合样式&#34;ggplot&#34;或seaborn绘制柱状图或箱形图以实现定量分析。</li>
		<li>利用2,930 cm-1（CH3）和2,850 cm-1（CH2）图像生成相减图像（CH3 - CH2）。然后在RGB颜色空间中将CH2图像与CH3 - CH2图像结合，使用模拟H&amp;#38;E染色的自定义查找表（LUT），生成数字组织学图像46。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在获取高光谱SRS图像后，使用自行编写的Python脚本进行k均值聚类，基于光谱相似性对图像进行分割（代码可在&#160;https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis 获取）。&#8203;
	<ol>
		<li>使用tifffile包加载.tiff图像堆栈。将SRS高光谱图像堆栈（x, y, 光谱）重塑为二维数组（像素, 光谱）。</li>
		<li>使用scikit-learn包将k均值算法应用于该二维数组，并设定聚类数量。</li>
		<li>将得到的聚类标签重新塑形为原始图像的维度，生成分割图。</li>
		<li>为每个聚类分配唯一颜色，生成一幅假彩色图像，以表示组织内不同的生化成分。</li>
		<li>使用matplotlib绘制每个聚类的光谱图，包含均值（实线）和标准差（阴影区域）。</li>
		<li>遵循MATLAB中惩罚化参考匹配SRS（PRM-SRS）协议，利用SRS高光谱图像数据集实现空间无标记脂质亚型检测47。</li>
		<li>整理图像并以300 dpi的.tif格式保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该多模态系统是一种强大的成像平台，可用于全面可视化来自多种生物来源和病理状态样本的分子环境。利用不同无标记成像模式的优势在于能够获取互补信息，并针对在单一无标记成像技术中可能难以甚至无法检测的特定分析物。具体而言，本文提到的三种非线性成像技术（SRS、MPF 和 SHG）可分别用于量化大分子组成、通过光学氧化还原比评估能量动态，以及提供包括细胞外基质成分和形态在内的结构信息6,48,49。此外，与单独使用每种成像模式相比，采用集成化的显微成像系统可实现图像的即时配准，并缩短样本保存时间。我们已利用该方法成功进行了活细胞成像，这可能是由于其光暴露程度低于共聚焦荧光显微镜；根据上述方案，通过选择特定时间点依次获取各模态图像。除了各自的技术优势外，该多模态平台还可通过无标记方式对不同生物标志物进行测量，从而从多个角度全面反映生物状态。
通过多光子荧光成像（MPF）对自发荧光蛋白进行无标记成像主要致力于氧...

光学生物医学成像在推动我们对生物结构与功能的理解方面发挥了关键作用。该技术通过调控激发光并检测光与组织相互作用产生的信号来生成图像。约1590年，汉斯·詹森（Hans Janssen）和扎卡里亚斯·詹森（Zacharias Janssen）研制出首台复式显微镜，其在镜筒内使用了两个凸透镜，可实现最高达30倍的放大倍数1。经过数个世纪的发展，现代光学显微镜如今已能达到1–3 nm的分辨率2,3。除了提供高分辨率外，先进的成像系统还具备更深的组织穿透能力、更高的成像效率以及对样品更小的损伤，因而特别适用于活细胞和活体组织成像。无标记成像技术具有显著优势，因其可在不干扰细胞内过程或破坏样品完整性的前提下获取生物信息。
多光子荧光（MPF）显微技术，特别是双光子荧光显微技术，已广泛应用于无标记成像。与依赖线性单光子吸收和发射的传统荧光显微技术不同，MPF激发涉及多个光子的同时吸收，其总能量足以激发单个荧光分子4,5。这些光子通常位于红外光谱范围内，其能量仅为单光子激发所需能量的一半或更低。由于该非线性过程具有较长的波长以及在焦点处的局域化激发，因而散射更少、组织穿透更深，并且光毒性更低。
通过检测内源性代谢底物（如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD））的自发荧光信号，无标记多光子荧光（MPF）显微技术能够捕获细胞的代谢信息。这些辅酶具有不同的激发和发射光谱，其荧光强度比值（即氧化还原比（NADH/FAD））可反映细胞的氧化状态。自Britton Chance于1979年首次提出氧化还原比概念以来，研究人员已陆续提出其他比值形式，包括NAD(P)H/FAD、NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H)以及FAD/(FAD + NAD(P)H)6,7,8,9。通过MPF成像对这些光学氧化还原比进行定量，可深入揭示代谢动态变化。例如，MPF成像可根据癌细胞与正常细胞之间代谢状态的差异对其进行区分，显示出其在癌症诊断中的应用潜力10,11,12。然而，基于MPF的自发荧光检测也存在局限性。其他内源性荧光分子（如角蛋白）可能贡献荧光信号，导致光谱串扰和信号解读不准确13。此外，氧化还原比仅能反映细胞整体的氧化还原状态变化，无法区分来源于不同细胞区域（如胞质或线粒体）的NADH，也无法区分NADH与NAD(P)H，因为二者在450 nm处具有相似的光谱峰，从而导致荧光强度信号重叠14。
二次谐波产生（Second Harmonic Generation, SHG）是一种非线性光学过程，20世纪80年代首次在生物医学领域得到验证，现已被广泛用于细胞结构的无标记成像15,16。与多光子荧光（MPF）类似，SHG涉及从超快脉冲激光器中同时吸收两个相同能量的光子，这些光子被重新组合并发射出一个频率为入射光两倍的新光子，从而检测到二次谐波信号。这种非线性光学相互作用仅发生在非中心对称材料中，这些材料具有非零的二阶电极化率，可诱导产生用于生成二次谐波信号的极化效应17,18。因此，SHG特别适用于无需外源性荧光染料即可对纤维状蛋白和纤维结构（如胶原蛋白、肌球蛋白和微管蛋白）进行成像15,17,19,20。纤维化组织和胶原蛋白在丰度、刚性、排列方向及结构上的异常，在炎症和癌症等多种疾病状态下普遍存在，这使得SHG成为某些疾病状态高效且无创检测的有前景工具21,22,23。SHG成像在肿瘤学研究中的广泛应用，包括乳腺癌、卵巢癌和皮肤癌的研究，凸显了其在基础研究和潜在临床应用中的关键作用24,25,26,27。
不同的分子具有不同的振动能级，当受到入射光激发时会引起不同程度的非弹性散射，这一现象最早由C. V. Raman于1928年首次描述28。自那时起，拉曼效应已被广泛应用于光学显微镜中，用于检测分子和组织成分，而无需外源性标记。受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman Scattering, CARS）均可相干地激发分子振动，并利用光的非线性相互作用产生比传统自发拉曼光谱更强的信号。SRS现象最早于1962年被报道29。2008年，该机制被整合到三维多光子成像中，通过分子振动跃迁引起的泵浦光束和斯托克斯光束强度变化，实现对特定化学物质的选择性检测30。该方法可最大限度地减少非共振背景干扰，产生比CARS更纯净的强度信号。SRS成像在多重和高光谱成像方面表现出色，能够同时检测多种化学键，并可在具有较大穿透深度的样本中实现分子组成的高分辨率可视化。尽管SRS成像是一项相对较新的技术，但其在临床诊断和代谢研究中已证明有效，适用于体内（in vivo）和体外（in vitro）研究30,31,32,33,34,35,36。例如，SRS可通过量化脂质与蛋白质的比例，区分脑肿瘤浸润组织与皮层及白质，从而以无标记、非侵入的方式界定肿瘤边界37,38。此外，通过检测经重水（D2O）处理样本中的碳-氘键，SRS可对通常被视为衰老相关和癌症相关疾病标志的代谢改变进行定量评估，从而实现对蛋白质合成、脂质生成及其他大分子代谢过程的定量测量31,33,34,35,36。SRS具备以高时空分辨率追踪代谢物的能力，使其成为疾病研究与诊断的有力工具，并具有更广泛临床应用的潜力。
多模态成像已成为生物医学研究中一种强大的方法，通过整合两种或多种成像技术，能够在同一样本中更全面地理解复杂的生物系统。2018年，一种无需标记的自体荧光-多谐波（SLAM）显微技术被提出，该技术整合了双光子荧光（2PF）、三光子荧光（3PF）、二次谐波生成（SHG）和三次谐波生成（THG）39。该方法有助于同时可视化肿瘤微环境中的细胞相互作用、动态过程以及各个组分。SLAM显微技术对样本的干扰极小，且所需的激光功率较低，能够实现深层组织成像，并为活体监测提供更安全的方法40。另一种多模态方法结合了内源性荧光光谱、漫反射光谱和拉曼光谱，已被开发用于手术过程中对癌症的原位检测41。此外，最近设计的一种多模态非线性内窥成像系统，整合了受激拉曼散射（CARS）、SHG和双光子荧光（TPF），已展现出在亚微米和亚细胞空间分辨率下对生物样本成像的能力42。联合使用2PF与SRS显微技术同样已被用于组织、细胞和细胞器的高分辨率活体成像42,43,44,45。这些新兴的多模态成像技术充分利用了各单一模态的优势，显著提升了分辨率、穿透深度和图像采集效率，因而展现出在临床和外科应用中的巨大潜力。
这种多模态方法相较于单模态成像正日益受到青睐，因为它在提供更广泛测量范围的同时，克服了单一技术所固有的局限性。如前所述，MPF通过检测内源性荧光来反映代谢变化，SHG可用于对生物样本中胶原等非中心对称结构进行成像，而SRS则主要通过检测蛋白质和脂质中高密度的化学键，基于其振动模式产生特征性的拉曼信号。由于这些成像模态具有相干特性，并共享非线性光学性质的基本原理，因此可整合至同一显微镜系统中，利用超短脉冲激光器，实现对局部区域多种生物标志物的同时获取，从而更全面地揭示生物过程44,45。本文概述了一种用于生物医学研究的多模态成像平台的实施方案，该平台整合了MPF、SHG和SRS三种成像技术。

<table><tbody><tr><td>460 nm 滤光片组</td><td>Olympus</td><td></td><td>OCT-ET 460/50M32</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 欧姆终端器</td><td>Mini Circuits</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>直流电源</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高数值孔径油浸聚光镜</td><td>Olympus</td><td>6-U130</td><td></td></tr><tr><td>高光密度短通滤光片</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>950 nm</td></tr><tr><td>倒置激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>picoEmerald 激光系统</td><td>Applied Physics &amp;amp; Electronics, Inc.</td><td></td><td>&amp;nbsp;同步脉冲泵浦光束（可调波长 720&amp;ndash;990&amp;thinsp;nm，脉宽 5&amp;ndash;6&amp;thinsp;ps，重复频率 80&amp;thinsp;MHz）和斯托克斯光（波长 1032&amp;thinsp;nm，脉宽 6&amp;thinsp;ps，重复频率 80&amp;thinsp;MHz）</td></tr><tr><td>SI 光电二极管探测器</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>触摸面板控制器</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VF-300 Compresstome&amp;nbsp;</td><td>Precisionary</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

Multimodal Optical Imaging Platform for Studying Cellular Metabolism

光学成像技术因其能够以高空间分辨率获取生物样本的形态学和功能信息，在生物医学研究中至关重要。这些光学过程利用光子与细胞、组织或器官内分子之间的多种光-分子相互作用，例如散射、吸收、发射和倍频产生。尽管传统的生物医学成像历来侧重于单一模态的应用，但近期研究表明，这些不同的技术可提供互补的信息，其联合输出能够更全面地揭示衰老过程、疾病发展以及细胞生物学基本机制中的分子变化。
近几十年来，无标记光学成像技术不断进步，使得对细胞及亚细胞环境的详细研究成为可能。例如，多光子荧光（MPF）不仅能够实现靶向蛋白质成像，还可通过内源性荧光辅酶定量代谢活性，兼具高穿透深度和空间分辨率。二次谐波生成（SHG）可用于成像细胞外基质中的胶原蛋白等结构，而受激拉曼散射（SRS）则能在亚细胞分辨率下原位绘制化学键分布和分子组成。
我们开发了一种多模态成像平台，该平台整合了多光子荧光（MPF）、二次谐波生成（SHG）和受激拉曼散射（SRS）三种成像模式。将这些成像模式集成于单一平台，能够从细胞、组织、器官乃至整体生物体的相同位置获取多维度信息，从而促进对细胞代谢、细胞外基质结构与分子组成之间复杂关系的深入探究。该多模态系统具备亚细胞分辨率和深层组织穿透能力， 原位 活细胞/组织成像，以及无需位置调整、设备切换或后期分析配准的无标记检测与即时共定位。本文介绍了一种利用该多模态平台进行无标记成像的实验方案，并展示了其在表征细胞代谢及细胞与组织中分子异质性方面的应用，可用于衰老与疾病研究。

图 2 中的图像代表了按照本方案获取FAD和NADH自发荧光以及蛋白质、总脂质、不饱和脂质和饱和脂质四个SRS通道结果的典型示例。此处我们还按照方案中所述，通过RGB颜色融合生成了伪组织学图像。MPF和SRS通道的成像数据将生成后续用于比值分析的图像文件。图 3 中人肺组织的示例展示了此类分析结果。在按照方案完成图像采集后，我们采用基于Python或ImageJ的图像分析方法，利用不同通道间的比值来提供定量的代谢信息。如图 3 中脂质不饱和度和光学氧化还原比图像所示，比值分析可生成反映相对代谢活性和分子组成分布情况的彩色图谱。我们已利用这些测量结果，对特定组织、病理状态或不同生物学因素引起的代谢通路及脂质含量变化进行了观察。如图 4 所示，通过比较氧化应激和脂质不饱和度的平均值及其在二维显微图像中的分布，可实现对健康组织与肿瘤组织的定量比较。
对...

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。

光学成像技术在生物医学研究中至关重要，因其能够从生物样本中获取形态学和功能学信息……

我们的研究利用多模态显微镜来测量多种病理状态下分子和代谢的差异，并可视化其空间异质性。这种多模态光学成像方法使我们能够从多个角度识别病理生理变化。多模态光学显微技术的应用范围正在不断扩大，特别是在临床领域，微型内窥镜的发展为临床成像开辟了新的途径。目前实验面临的主要挑战在于将所有硬件设备相互整合的复杂性，这也是我们采用自行搭建的显微镜系统的原因之一。通过使用我们的多模态光学成像平台，我们在无标记生物正交疾病研究方面取得了显著进展，包括对不同乳腺癌亚型的分类以及对果蝇和小鼠大脑中脂质代谢的分析。利用这种无标记的多模态光学成像技术，我们能够同时可视化代谢过程、形态结构和分子组成，为研究疾病及衰老过程提供了强有力的工具。首先，预热激光器并等待约15至20分钟。依次打开控制箱、触摸面板控制器、主激光器遥控器的交流适配器和副激光器遥控器的交流适配器，然后打开硅光电二极管探测器和锁相放大器。设置激光系统，使其泵浦光束的波长可在780纳米至990纳米范围内调节，脉冲宽度为5至6皮秒，重复频率为80兆赫兹。斯托克斯激光束的波长应固定为1031纳米，脉冲宽度为六皮秒，重复频率为80兆赫。确保泵浦光束和斯托克斯光束均处于低功率状态，至少20毫瓦，以便在准直板上可见。在高数值孔径油浸聚光镜上涂抹浸油。将显微镜载玻片安装到油浸聚光镜上，并在载玻片上放置一大滴水，用于25X水镜物镜观察。调节Z轴载物台，调整焦距，直至在25X水镜物镜下可见生物样本的明亮明场图像。按正确顺序开始成像过程，以避免光漂白。在MPF和SHG之间快速切换时，需从泵浦光束切换至固定的斯托克斯光束。将图像分辨率设置为512×512像素。MPF和SHG的像素驻留时间均设为8微秒，平均帧数设为3帧以上。对于SRS模态，使用每个像素40微秒、平均帧数为2的设置。为获取MPF的自发荧光，需关闭斯托克斯激光束。将泵浦激光器调谐至800纳米，以激发NADH和黄素。使用SHG获取胶原纤维信号。关闭泵浦激光束，仅使用功率为500毫瓦的斯托克斯激光束。利用SRS获取蛋白质和脂质的空间分布。保持两束激光开启，并调节激光束频率以匹配每种分子的特定振动模式。为获取受激拉曼散射（SRS）高光谱图像数据集，选择“suite”模式并将波长范围设置为781.3纳米至806.5纳米。选择不少于60层的图像层数，并采集高光谱图像堆栈。将相同感兴趣区域的所有图像保存在同一文件夹中，并确保图像格式为 Olympus OIR 文件。自发荧光和受激拉曼散射成像成功获取了人体肺组织的代谢和结构信息。通过光学氧化还原比率和脂质不饱和度比率的比值分析，提供了人体肺组织中代谢活性和分子组成的空间分布。对健康组织与肿瘤组织之间氧化应激水平和脂质不饱和度的定量比较揭示了其代谢状态的差异。

multimodal-optical-imaging-platform-for-studying-cellular-metabolism

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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一种基于mtPA-GFP的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

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多模态成像与光谱纤维束微内窥镜平台用于无创、 体内 组织分析

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芳香族氨基酸调控的细胞代谢生物正交化学成像

此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。...

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一种多模态成像框架推动无标记活体乳腺癌细胞表型分析

光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）是一种能够成像光学吸收对比度的新兴技术 体内 以细胞级分辨率和高灵敏度进行成像。本文提供了光声显微镜（OR-PAM）实验操作的可视化指南，包括系统配置、系统校准、典型实验流程 体内...

三维光学分辨率光声显微成像

在许多成像场景中，超声的光学检测并不实用，因为它通常需要稳定的环境条件。我们展示了一种适用于易变环境下的超声光学检测技术，该技术具有微型化和高灵敏度的特点，适合在受限场景下进行光声成像，例如...

用于医学成像应用的宽带超声光学检测器

学习多模态光学成像平台用于细胞代谢研究，结合多光子荧光、二次谐波和受激拉曼散射技术，实现无标记生物正交成像。该方法可同步可视化代谢、形态和分子组成，助力疾病与衰老机制研究。

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

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