速度更快，高分辨率，MTPA-GFP基于线粒体融合含量的收购多个单元格的动力学数据，在并行使用共聚焦显微镜

以下实验的总体目标是同时测量多个细胞的高分辨率 3D 图像中的线粒体融合。这是通过首先在感兴趣的细胞中表达线粒体光敏 GFP 来实现的。接下来，GFP 在每个细胞中线粒体群体的一小块区域被光激活。

然后每 15 分钟收集每个细胞的 6 个光学切片，直到达到信号平衡，以评估线粒体融合的程度，最终稀释线粒体靶向光激活物，基于荧光信号定量的接受线粒体融合的细胞中的 GFP 强度可以评估。该技术的主要优点是它是自动化的，因此可以更快地收集多个细胞的高分辨率数据。虽然这种方法将使用 INS one 细胞进行演示并提供对糖尿病的见解，但它可以应用于其他细胞类型，以研究衰老以及代谢和神经退行性疾病中的整个线粒体融合。

这种方法的视觉演示至关重要，因为成像自动化步骤在其他地方没有描述。将 INS one 细胞培养至 80% 汇合后，用 0.05% 胰蛋白酶分离培养物，并将重悬的细胞接种到顶部 poly de 赖氨酸涂层的盖玻片底部成像板上。培养两天后，将线粒体基质靶向腺病毒光激活 GFP 添加到平板中。

然后在细胞培养 24 小时后，更换培养基并让细胞再生长两天。在成像当天，向成像板中加入 7 至 15 纳摩尔的 TMRE，并平衡培养物至少 45 分钟。在此期间，在显微镜平衡后打开 5% 二氧化碳、培养箱和显微镜。

在 acquisition 选项卡下，单击 show manual tools。打开成像设置面板，然后选择通道模式并切换。跟踪 Light Path 面板中的每一帧。

选择 LSM 和通道模式。然后从标本图标向上选择面板底部的后 MBS six 90 plus 和 MBS 4 88，检查 TPMT 以启用明场或 DIC 通道的可视化。通过将 GFP 染料的范围设置为 490 至 540 纳米和 TMRE 染料的范围设置为 580 至 700 纳米来完成光路参数的调整。

最后，打开采集模式，在帧大小、下拉菜单和平均数字菜单中设置一个 512 x 512 像素的扫描区域，并设置四个 x 的平均值。现在使用物镜，用卤素灯聚焦细胞。将针孔打开到最大并扫描以找到表达 GFP 的亮绿色光激活细胞。

选择一张任意激光功率照片，激活单元，然后通过它拍摄 Z 系列光学切片，看看激活是否足够。然后将成像 488 纳米激光器调整为低功率，而不完全最大化探测器增益，以保持良好的信噪比。确保信号不饱和后，确认 photo activat GFP 信号与 TMRE 信号共定位。

最后，打开针孔并增加检测器的增益，然后找到一个新的 photo activat GFP 表达细胞并指定缩放因子。然后设置 Z 系列范围以收集 6 个切片并保存成像方法。现在打开左侧面板中的 multitime 窗口。

选择保存面板，然后单击 选择图像文件夹 以指定保存文件的位置。然后在采集面板中，选择刚刚保存的成像方法在扫描配置下拉菜单中。接下来，选择 Z 堆栈中标记的 Z 中间。

现在打开 blocks 面板并选择每个位置的 single block。然后单击 add blocks for each interval to measured，打开定时面板，选择 weight interval，然后在 weight interval in the weight interval before block at first location only 框中键入零。选择位置面板后，选择移动焦点以加载位置之间的位置，并在编辑位置列表下单击移动到 LO 或下一个 LO 时加载扫描配置，选择全部清除，然后在漂白面板下选择多个位置电动阶段，单击漂白框并在配置下拉菜单中指定配置文件。

然后在主软件的漂白窗口中，将适当的照片激活方法保存在该区域的面板中。选择此特定单元格的 ROI，并通过选择 add current region to ROI list （将当前区域添加到 ROI 列表窗口） 将此 ROI 添加到多次。请务必在 ROI 下拉菜单中选择相同的位置。

最后，对于要随时间跟踪的 10 个单元格中的每个单元格，执行以下序列。首先，找到一个单元时，在位置面板中指示其载物台位置，并在采集面板中指定其特定的扫描配置方法。请务必为所有块指定扫描配置。

然后在主区域面板中，选择要进行照片激活的感兴趣区域。接下来，在 bleach 面板中，保存 ROI 并将其加载到 ROI 窗口中。然后擦除主区域窗口中的 ROI 并重置扫描。

缩放到一个，最后找到下一个单元格并设置缩放。对接下来的 9 个单元格重复该过程后，检查每个阶段位置和所有块是否指定了适当的扫描配置，以及每个位置的第一个块是否对应于相应的照片激活方法，而其余块包含模拟方法。然后为光激活 GFP 信号主要与红色 TMRE 信号共定位的细胞选择 run。

减去 photo activat GFP 图像中的背景，然后配置区域测量值以报告平均强度。然后将 ZS 堆栈的每个切片的数据导出到 Excel 文件。省略没有信号的平面后，将每个时间点的 ZS 堆栈强度除以初始光激活强度，得到 INS 一个单元中原始信号的百分比。

信号强度每 15 分钟显着降低一次，持续一小时，直到线粒体融合达到平衡。如这些投影图像所示，在典型的线粒体融合测定中每 15 分钟定量一次 6 个光学切片。在这些测定中，使用非常低浓度的 TMRE 来帮助靶向光激活 GFP 光激活并监测细胞健康状况。

请注意，细胞几乎完全共定位绿色的光激活 GFP 和红色的 TMRE 信号，并且染料的 cos 染色表明线粒体在低毫摩尔浓度下是活跃的并且没有去极化。棕榈酸酯片段线粒体并抑制线粒体融合。因此，从棕榈酸酯处理细胞的这些光学切片中可以看出，线粒体是碎片化的，并且基质靶向光激活剂 GFP 的信号强度没有像在正常条件下那样变化，如上图所示。

因此，图中所示光激活 GFP 信号的稀释可能是由于线粒体融合而不是裂变。在设置此方法时，请记住选择 GFP 和 TMRE 共定位细胞以光激活足够的 GFP 来维持信号，但不要太多，以免错过线粒体融合事件并在光学切片内收集整个线粒体体积确定线粒体网络会发生什么。在没有某些调节蛋白或信号分子的情况下，该测定可以在许多实验组中进行，其中基因沉默或用各种试剂处理细胞。量化线粒体融合和统计分析参数的能力允许研究疾病状态下的线粒体动力学，并能够开发治疗方法。