Name: 速度更快，高分辨率，MTPA-GFP基于线粒体融合含量的收购多个单元格的动力学数据，在并行使用共聚焦显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习利用光激活GFP技术同时测量多个细胞内线粒体融合的高分辨率方法。本技术通过自动化成像流程，可快速收集INS-1细胞的三维动态数据，为研究糖尿病等代谢疾病中的线粒体动力学提供高效工具。

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感谢塔夫茨大学神经科学研究中⼼（P30 NS047243，Jackson）、由波⼠顿⼤学医学园区埃⽂斯跨学科⽣物医学研究中⼼⽀持的线粒体亲和⼒研究协作组（mtARC）、Link Medicine Corporation 以及蔡司公司对本研究的⽀持。

1. 图像板制备
<ol>
 <li>在含有10%标准胎牛血清、1%青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中培养INS1细胞， 50 μM 2-巯基乙醇，5 mM NaHCO₃3，2 mM HEPES、2 mM 丙酮酸和 11 mM 葡萄糖培养至 80% 汇合度。</li>
 <li>用0.05%胰蛋白酶消化INS1细胞培养物，并将其接种至多聚-L-赖氨酸包被的培养板中D-赖氨酸包被的盖玻片底成像板（30-40% 汇合度）。</li>
 <li>待培养板中细胞达到60–80%融合度（约2天）后，加入线粒体基质靶向（COXVIII）的腺病毒PA-GFP，感染24小时（MOI=5）。更换培养基，继续培养细胞2天，随后进行成像。</li>
 <li>成像当天，向成像板中加入 7–15 nM TMRE，并平衡至少 45 分钟。</li>
 <li>在此期间，打开培养箱（此处使用的是载台式培养箱），并让显微镜平衡至 37 °C 约1小时。打开5% CO₂2.</li>
</ol>
2. 蔡司LSM 710共聚焦显微镜的成像参数
<ol>
 <li>显微镜平衡后，在“采集”选项卡中点击“显示手动工具”，打开成像设置面板，选择“通道模式”，并设置每个“帧”切换一次轨道。</li>
 <li>在光路面板中，选择 LSM 和通道模式。从样本图标自下而上进行设置，依次选择“后端”、“MBS 690+”和“MBS 488”。在面板底部选择“T-PMT”，以启用明场或微分干涉差（DIC）通道的观察。</li>
 <li>完成光路参数调节，将 GFP 染料的检测范围设置为 490–540 nm，TMRE 染料的检测范围设置为 580–700 nm。</li>
 <li>在采集模式中，使用 512 × 512 像素的扫描视野，平均次数为 4 次，并选择一个缩放倍数（出于校准目的，建议保持一致）。</li>
</ol>
3. 优化成像参数
<ol>
 <li>使用平场复消色差 100 倍（1.4 数值孔径）物镜，通过卤素光源而非荧光光源对细胞进行调焦，以保护线粒体免受光毒性损伤。</li>
 <li>使用最大开放针孔并进行扫描，筛选出绿色荧光更强的 PA-GFP 表达细胞。</li>
 <li>确定激活 PA-GFP 所需的最低双光子激光功率，并优化成像参数，确保信号不会使探测器饱和。通过若干 z 轴层析序列检查 PA-GFP 信号是否与 TMRE 信号共定位。若 TMRE 信号丢失，表明线粒体去极化或存在光毒性，此类细胞不应用于后续分析。</li>
 <li>选取一个表达 PA-GFP 的细胞，并设定缩放倍数。</li>
 <li>设置 z 轴层析范围以采集 6 层切片（该范围需适用于全部 10 个细胞，除非在每个位置单独设定特定的 z 轴焦点）。</li>
 <li>保存每个细胞的成像方法（细胞 1、细胞 2 等）。</li>
</ol>
4. 调整程序的自动化部分，并指定您将追踪的10个细胞以进行1小时线粒体融合测定
<ol>
 <li>在多时间窗口的左侧面板中，选择“保存”面板，并指定文件的保存位置。</li>
 <li>在“采集”面板中，加载为细胞1在扫描配置中保存的采集方法，并勾选z堆栈选项框。同时选择“标记Z- z堆栈的中间位置”。</li>
 <li>在“区块”面板中，选择“在每个位置单个区块”。对需要测量的每个时间间隔点击“添加区块”。</li>
 <li>在“定时”面板中，选择“等待间隔”，并在“仅在第一个位置区块前等待间隔”中输入“0”。区块2-4在此部分设置为“15 min”。</li>
 <li>在位置面板中，选择“在位置间移动焦点至加载位置”以及“当点击‘移至位置’或‘下一位置’时加载扫描配置”。在“编辑位置列表”下选择“清除全部”，然后选择“多位置电动载物台”。</li>
 <li>在“漂白”面板下，点击“漂白”选项框，并在“配置”下拉菜单中指定主软件窗口中设定的配置文件。随后，在“漂白”窗口中保存适当的光激活方法。在区域面板中，为此特定细胞选择感兴趣区域（ROI），并通过选择“将当前区域添加到ROI列表”窗口将该ROI添加至多时间序列。务必在“ROI”下拉菜单中选择相同的位置。</li>
</ol>
为了确保时间控制准确，并使每个细胞具有15分钟的时间间隔，需要保存两种方法。在区块列表中，第一个区块将采用“真实”的光激活配置，其余区块则采用不使用双光子激光的“模拟”配置。第一个区块也是唯一一个没有延迟（BKIntv=0）的区块。因此，该方法以一次基线扫描开始，随后进行一次光激活扫描；其余每个区块均设置900秒的BkIntv，在每个时间点均执行两次扫描，如同在0秒时一样，以保持时间上的一致性。
<ol start="7">
 <li>对需要随时间追踪的每个细胞（共10个），执行以下步骤： 
 找到一个表达PAGFP的细胞——保存其成像方法 
 位置面板——标记载物台位置，指定成像方法 
 主要ROI面板——选择一个待光激活的感兴趣区域；漂白面板——保存特定的ROI，并将其加载至ROI框中： 
 清除ROI，并将扫描缩放倍数重置为1 
 找到下一个细胞并设置缩放倍数 
 对其余9个细胞重复上述过程</li>
</ol>
检查每个成像位置及所有区块是否均已关联适当的成像方法（扫描配置）。同时确保每个位置的第一个区块对应正确的光激活方法，其余区块则包含一个“虚拟”方法。最后，选择“运行”。
5. 分析 PA-GFP 信号强度
<ol>
 <li>对于光激活GFP信号与红色TMRE信号共定位的细胞，在PAGFP图像中扣除背景（此处我们使用Metamorph软件）。</li>
 <li>然后将数据导出至Excel，并计算每个时间点z轴层叠图像的平均荧光强度。丢弃无信号的光学切片。</li>
 <li>通过计算原始光激活信号所占百分比，测量每个z轴层叠图像中的信号稀释程度。</li>
</ol>
每个数据点均被扫描并记录两次，从而获得每个时间点的重复 z 堆栈信息。请检查 z 堆栈数值是否一致，若不一致，则表明存在问题（例如聚焦不准、细胞移动）。
6. 代表性结果
当一个被激活的PA-GFP线粒体与一个未激活的PA-GFP线粒体发生融合事件时，线粒体基质中的PA-GFP会与未标记的基质混合，并在更大的区域内被稀释，从而导致信号强度下降（图1A）。在INS1细胞中，信号强度每15分钟显著下降一次，直至线粒体融合达到平衡（约1小时）。请注意，图1B中的细胞表现出PA-GFP与TMRE信号几乎完全共定位。在这些实验中，使用极低浓度的TMRE（15 nM），以帮助靶向PA-GFP的光激活，同时用于监测细胞状态。含有大量去极化线粒体的细胞，其PA-GFP与TMRE信号共定位不完全，不应进行分析，因为这表明细胞可能受到光毒性影响或处于濒死状态。
在INS1细胞中，线粒体融合的平衡时间通常为1小时，此时约有15%的线粒体体积被激活。有时，即使仅照射很小的区域，由于线粒体高度网络化，大部分线粒体也会被光激活，这种情况下很难检测到进一步的融合。其他类型的细胞可能表现出不同的平衡时间，应通过更短的时间间隔和更长的观察周期进行测试，以表征其线粒体动态。为了抑制线粒体融合，可将细胞置于脂毒性环境中。已有研究表明，0.4 mM棕榈酸可导致线粒体断裂并抑制线粒体融合9。该效应如图2所示，线粒体呈现碎片化，但mtPAGFP的信号强度变化不如正常条件下（图1）明显。因此，PA-GFP信号的稀释很可能是由于线粒体融合而非分裂所致。对于其他细胞类型，我们建议使用其他已知方法诱导线粒体断裂，例如沉默对线粒体融合至关重要的OPA114。
<img alt="荧光显微镜，随时间变化的蛋白质定位，光谱分析，延时成像过程。" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 在线粒体融合实验中，光激活后PA-GFP信号随时间逐渐稀释的典型情况。A. 由于线粒体融合事件导致PA-GFP蛋白扩散至越来越大的区域，其荧光信号逐渐减弱，如每15分钟采集一次的6个光学切片投影图像所示。B. TMRE与PA-GFP共染表明线粒体仍处于活性状态，并未发生去极化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="荧光显微镜图像、蛋白质定位、细胞组分的时间推移、实验结果。" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用 0.4 mM 棕榈酸抑制线粒体融合可减少 PA-GFP 的稀释。 A. 6 个光学切片的投影显示线粒体较短，且随时间推移信号强度保持不变。 B. PA-GFP 与 TMRE 的共定位表明线粒体未发生去极化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

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<li>Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+mitochondrial+fusion+events+in+pancreatic+beta-cells+and+cardiac+cells+unravel+potential+control+mechanisms+of+its+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).</li>
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</ol>

本文的制作与免费访问由 Zeiss, Inc. 赞助。

如果在光激活后每15分钟进行一次成像，该方法可同时观察约10个细胞。实际成像的细胞数量取决于在培养皿中定位并标记表达mtPAGFP的细胞的速度，以及设置所有软件参数的速度。为了使自动化运行顺畅，应使用细胞分布均匀的单层，因为指定的z轴层扫描范围将适用于所有细胞。
初始光激活区域的大小将决定平衡所需的时间。为了能够测量线粒体融合，重要的是仅光激活网络的10-20%，以便随时间监测信号向网络其余部分的扩散。如果被光激活的网络区域过大，可能会导致完全融合发生得过快，从而无法捕捉到该事件。
必须极其谨慎地调节双光子激光器的激光功率以及TMRE的浓度，以避免导致线粒体去极化的光毒性。确保mtPAGFP信号与TMRE信号共定位有助于评估光毒性及细胞整体健康状况8,15。应避免使用落射荧光光源照射。在寻找表达mtPAGFP的细胞时，扫描过程中应将针孔开至最大，并使用低功率488 nm激发光。将双光子激光功率调节至足以光激活PA-GFP，从而在1小时内持续检测到信号，但又不会使任何细胞信号过饱和，这一过程可能较为困难8。然而，应在该优化步骤中投入足够时间，因为一旦自动程序启动，若需中途停止、重新选择更多细胞后再继续，过程将十分繁琐。
为了质量控制，获取微分干涉差（DIC）图像（或透射光图像）以监测细胞的聚焦情况非常有帮助，同时也是检测扫描过程中浸油内是否产生气泡的有效方法；由于载物台的移动，这种情况有时会发生。
尽管使用这种mtPAGFP方法可获取线粒体基质蛋白从光激活的线粒体向未标记线粒体单向移动的数据，但该技术也可用于研究其他过程。例如，可将特定荧光染料连接到膜蛋白上，以观察其在融合事件中的特异性移动，ABCD-me即为一例，其融合发生的时间尺度与可溶性基质蛋白的混合不同15。

<table><tbody><tr><td>COXIII-腺病毒PA-GFP</td><td>Dr. Lippincott-Schwartz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于mtpa-gfp的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

线粒体融合在线粒体钙稳态、生物能量学、自噬及质量控制中发挥关键作用。在活细胞中，可通过光转化线粒体基质靶向的光激活型绿色荧光蛋白（mtPAGFP）来定量融合过程，即选择部分线粒体进行光转化，随后通过观察光转化分子在整个线粒体群体中达到平衡的速率，来评估融合活性。迄今为止，此类测量主要采用单细胞时间序列方法，对单个细胞在一小时内荧光信号的再分布进行量化。本文中，我们对先前发表的基于mtPAGFP和低浓度TMRE（15 nm）的活细胞方法进行了规模化和自动化改进。该方法包括：对线粒体网络的一小部分进行光激活，每隔15分钟采集一次高分辨率的共聚焦光学切片图像序列，持续1小时，并量化信号强度的变化。根据若干因素（如寻找表达PAGFP细胞的难易程度以及光激活区域的信号强度），可在每15分钟的时间间隔内采集约10个细胞的数据。该改进显著提高了该检测方法的时间效率，同时保留了高分辨率的亚细胞定量能力以及捕捉线粒体在其天然细胞结构环境中动态行为所需的动力学参数。
线粒体动力学在多种细胞过程中发挥重要作用，包括呼吸作用、钙离子调节以及细胞凋亡1,2,3,13。线粒体网络的结构影响线粒体的功能及其与细胞其他部分的相互作用。线粒体网络持续经历分裂与融合，呈现出从高度融合到更为碎片化的多种形态。有趣的是，阿尔茨海默病、帕金森病、腓骨肌萎缩症2A型以及常染色体显性视神经萎缩已被证实与线粒体形态改变相关，特别是表现为网络碎片化4,10,13。通常情况下，线粒体在发生碎片化后会去极化，其累积将导致细胞功能受损18。研究表明，线粒体分裂可向细胞发出向凋亡发展的信号，同时也可能提供一种机制，用于分离去极化和失活的线粒体，从而维持整个网络的稳健性14。相反，线粒体融合则促进基质蛋白、溶质、线粒体DNA（mtDNA）以及电化学梯度的共享，并且似乎能够抑制细胞向凋亡进程发展9。线粒体的分裂与融合如何影响细胞稳态并最终影响生物体功能，仍需进一步研究，因此持续开发和优化获取这些现象相关信息的方法十分必要。
现有的线粒体融合检测方法已揭示了线粒体生理学的多种机制，每种方法均有其独特优势。杂交PEG融合检测法7将两种不同标记的细胞群体（mtRFP和mtYFP）混合，通过分析融合后多核细胞中荧光探针的混合与共定位程度来评估融合情况。尽管该方法已提供了有价值的信息，但并非所有细胞类型均可发生融合，且诱导融合的条件需使用可能干扰正常融合过程的毒性药物。最近，一种无细胞体系的技术被开发出来，利用分离的线粒体通过荧光素酶检测法来观察融合事件1,5。该方法使用两种人类细胞系，分别靶向表达Renilla荧光素酶的氨基端或羧基端片段，并连接亮氨酸拉链以确保混合后发生二聚化。从每种细胞系中分离线粒体并诱导其融合。该融合反应可在生理条件下、无需细胞质成分的情况下发生，但需要能量供应、适宜的温度以及线粒体内膜电位。有趣的是，研究发现细胞质成分可调节融合程度，表明细胞信号通路调控线粒体融合过程4,5。该检测方法将非常适用于高通量筛选，以鉴定参与融合机制的组分以及可能影响线粒体动态的药理学化合物。然而，仍需进一步开展更详细的全细胞线粒体检测，以补充该体外检测体系，从而在细胞环境中观察这些过程。
一种用于监测全细胞线粒体动态的技术已应用一段时间，该技术基于线粒体靶向的光激活型绿色荧光蛋白（mtPAGFP）6,11。在表达mtPAGFP后，对线粒体网络的一小部分（10–20%）进行光激活，并利用时间延时共聚焦成像每15分钟记录一次荧光信号在整个线粒体网络中的扩散情况，持续1小时。每一次融合事件都会导致信号强度的稀释，从而可定量分析融合速率。尽管融合与分裂在细胞中持续发生，但该技术仅能监测融合过程，因为分裂不会引起PAGFP信号的稀释6。与低浓度TMRE（在INS1细胞中为7–15 nM）共标记可实现对线粒体膜电位的定量分析。当线粒体处于超极化状态时，会摄取更多的TMRE；而当其去极化时，则会丢失TMRE染料。去极化的线粒体不再具备足够的膜电位，通常融合效率降低甚至完全无法融合。因此，利用低浓度TMRE可追踪处于活跃融合状态的线粒体9,15。缺乏TMRE信号的去极化线粒体积聚可能是光毒性或细胞死亡的征兆。较高浓度的TMRE会使线粒体对激光极为敏感，因此必须格外注意避免TMRE过量标记。若研究重点为线粒体去极化效应，可采用稍高浓度的TMRE并结合更强的激光照射，以可控方式诱导线粒体去极化（Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010）。为确保TMRE引起的毒性不构成问题，我们建议将加载了TMRE（3–15 nM）的细胞暴露于实验中拟使用的成像参数下（例如连续采集7组、每组6个光学切片），并在2小时后评估细胞健康状态。若观察到线粒体过度碎片化且细胞出现死亡，可考虑使用其他线粒体标记物替代TMRE，例如dsRED或MitoTracker Red。
mtPAGFP 方法揭示了其他方法无法观察到的线粒体网络行为的细节。例如，我们现在知道线粒体融合可以是完全的或瞬时的，其中基质内容物可以在不改变整体网络形态的情况下混合。此外，我们还知道融合发生的概率与接触持续时间及细胞器尺寸无关，但受细胞器运动性、膜电位以及先前融合活动历史的影响8,15,16,17。
在本论文中，我们描述了一种扩增先前发表的使用 mtPAGFP 和 15 nM TMRE8 实验方案的方法，旨在同时检测多个细胞，提高数据采集的时间效率，同时不牺牲亚细胞分辨率。这一目标的实现得益于自动显微镜载物台和可编程图像采集软件的应用。蔡司公司的 Zen 软件允许用户标记并追踪多个表达 mtPAGFP 的特定细胞。每个细胞均可在特定兴趣区域进行光激活，并可在指定时间间隔内连续采集共聚焦光学切片，同步监测 mtPAGFP 信号和 TMRE 信号。其他共聚焦系统也可用于执行本实验方案，前提是具备可编程的自动载物台、含 CO2 的培养箱，以及用于光激活 PAGFP 的手段，例如多光子激光器或 405 nm 激光二极管。

通过追踪光转化的基质靶向GFP在随时间变化的线粒体网络中的平衡情况，来测量线粒体融合。迄今为止，每次仅能对一个细胞进行长达一小时的动力学分析。我们提出了一种可同时测量多个细胞的方法，从而加快了数据采集过程。

一种基于mtPA-GFP的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

线粒体融合在线粒体钙稳态、生物能量学、自噬和质量控制中发挥关键作用。融合的量化在……中进行

以下实验的总体目标是并行测量多个细胞高分辨率三维图像中的线粒体融合。首先在目标细胞中表达线粒体靶向的光激活GFP，随后在每个细胞的线粒体群体中选择一个小区域进行GFP光激活。随后，每15分钟采集每个细胞的六个光学切片，直至信号达到平衡，以评估线粒体融合的程度。最终可通过荧光信号的定量分析，评估发生线粒体融合的细胞中靶向线粒体的光激活GFP荧光强度的稀释情况。该技术的主要优势在于其自动化特性，因此可更快速地获取多个细胞的高分辨率数据。尽管本方法将以INS-1细胞为例进行演示，并为糖尿病研究提供见解，但它同样适用于其他细胞类型，用于研究衰老以及代谢性和神经退行性疾病中的线粒体融合过程。该方法的可视化演示至关重要，因为目前尚未在其他地方描述成像自动化步骤。将INS-1细胞培养至80%融合度后，用0.05%胰蛋白酶消化细胞，将重悬的细胞接种到预先用多聚赖氨酸包被的盖玻片底部成像培养板中。培养两天后，向培养板中加入线粒体基质靶向的腺病毒编码的光激活GFP。细胞培养24小时后，更换培养基，继续培养两天。成像当天，向成像板中加入7至15纳摩尔的TMRE，并将培养物平衡至少45分钟。在此期间，开启5%二氧化碳、培养箱以及显微镜，待显微镜达到平衡状态后进行后续操作。在采集选项卡下，单击显示手动工具。打开成像设置面板，然后选择通道模式并切换。在光路面板中跟踪每一帧。选择激光扫描显微镜（LSM）和通道模式。然后从样本图标开始自下而上进行设置：在面板底部选择后置MBS六90加和MBS 4 88，勾选TPMT以启用明场或微分干涉差（DIC）通道的可视化。通过将GFP染料的波长范围设置为490至540纳米，TMRE染料的波长范围设置为580至700纳米，完成光路参数的调整。最后，打开采集模式，在帧尺寸中设置512×512像素的扫描区域，在下拉菜单中将平均次数设为4次。现在使用物镜，通过卤素光源对细胞进行聚焦。将针孔开至最大，进行扫描以寻找亮绿色的光激活GFP表达细胞。选择一个任意激光功率下的照片，激活细胞，然后对该细胞进行Z轴系列光学切片扫描，以确认激活是否充分。随后将成像用488纳米激光调节至低功率，同时不要将探测器增益完全调至最大，以保持良好的信噪比。在确认信号未达到饱和后，验证光激活GFP信号是否与TMRE信号共定位。最后，打开针孔，增加探测器的增益，找到一个新的光激活GFP表达细胞，并设定缩放倍数。然后设置Z轴扫描范围以采集六层图像，并保存成像方法。现在打开左侧面板中的多时间窗口。选择保存面板，然后点击“选择图像文件夹”以指定文件的保存位置。接着，在采集面板中，从扫描配置下拉菜单中选择刚刚保存的成像方法。随后，选择Z堆栈中标记的Z中间位置。现在打开区块面板，并在每个位置选择单个区块。然后，针对每个需要测量的时间间隔点击添加区块，打开时间控制面板，选择“weight interval”（加权间隔），接着仅在“第一个位置前的区块加权间隔”框中输入零。选择位置面板后，在“编辑位置列表”中选择“在位置之间移动焦点至加载位置”以及“当点击移至 LO 或下一个 LO 时加载扫描配置”，然后选择“清除全部”，再在漂白面板中选择“多位置电动载物台”，勾选漂白框，并在配置下拉菜单中指定配置文件。然后在主软件的漂白窗口中，于区域面板内保存相应的光激活方法。选择该特定细胞的 ROI，并通过选择“将当前区域添加到 ROI 列表”窗口，将此 ROI 添加至多时间点序列中。务必在 ROI 下拉菜单中选择相同的位置。最后，针对需要随时间追踪的每个细胞（共10个），执行以下步骤序列。首先，当找到一个细胞时，在位置面板中指示其在载物台上的位置，并在采集面板中指定其特定的扫描配置方法。务必为所有区块指定扫描配置。然后在主区域面板中，选择需要进行光激活的感兴趣区域。接下来在漂白面板中，保存该 ROI 并将其加载到 ROI 窗口中。随后在主区域窗口中删除该 ROI，并重置扫描。放大至一倍，最终找到下一个细胞并设置放大倍数。重复此过程，完成接下来九个细胞的操作后，检查每个阶段位置及所有区块是否均已指定适当的扫描配置，并确认每个位置的第一个区块对应于适当的光激活方法，其余区块则包含模拟方法。随后，选择那些光激活GFP信号大部分与红色TMRE信号共定位的细胞进行运行。对光激活的GFP图像进行背景扣除，然后设置区域测量以报告平均强度。接着将每个Z轴层切片的数据导出至Excel文件。在剔除无信号的层面后，将每个时间点的Z轴层堆栈强度除以初始光激活强度，从而获得INS一个细胞中原始信号的百分比。在线粒体融合达到平衡之前，信号强度每15分钟显著下降一次，持续一小时。如典型的线粒体融合实验中，对六个光学切片进行投影成像，并每15分钟定量分析一次，结果如图所示。在这些实验中，使用极低浓度的TMRE有助于靶向光激活GFP，并用于监测细胞状态。请注意，绿色的光激活 GFP 与红色的 TMRE 信号几乎完全共定位，且染料的共染结果表明，在低毫摩尔浓度下，线粒体仍处于活性状态，并未发生去极化。棕榈酸盐会断裂线粒体并抑制线粒体融合。因此，如本图中经棕榈酸盐处理细胞的光学切片所示，线粒体呈现碎片化，且基质靶向的光激活 GFP 信号强度的变化较之正常条件下明显减弱，如前一张图所示。因此，本图中观察到的光激活 GFP 信号稀释很可能是由于线粒体融合而非分裂所致。在建立该方法时，需注意选择 GFP 与 TMRE 共定位的细胞进行光激活，以确保激活足够的 GFP 信号维持检测，但又不能过度激活，以免错过线粒体融合事件，同时应确保在光学切片范围内采集完整的线粒体体积，以确定线粒体网络在特定调控蛋白或信号分子缺失情况下的变化。该检测可在多个实验组中进行，通过基因沉默或使用不同处理剂来研究特定基因或分子的作用。通过定量分析线粒体融合能力及统计学参数，可研究疾病状态下的线粒体动态变化，并推动相关治疗策略的开发。

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科研

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生物学

速度更快，高分辨率，MTPA-GFP基于线粒体融合含量的收购多个单元格的动力学数据，在并行使用共聚焦显微镜

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学习利用光激活GFP技术同时测量多个细胞内线粒体融合的高分辨率方法。本技术通过自动化成像流程，可快速收集INS-1细胞的三维动态数据，为研究糖尿病等代谢疾病中的线粒体动力学提供高效工具。

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