Name: 使用定制缓冲液中的微珠打浆，然后进行 NGS 工作流程进行分枝杆菌 DNA 提取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习使用微珠打浆和磁珠纯化技术从结核分枝杆菌样本中提取DNA的方法。该流程适用于下一代测序应用，可在资源有限的环境中实现快速、可靠的DNA提取。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01AI153213 国家过敏与传染病研究所（NIAID）。

本研究在加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）进行，经机构生物安全委员会批准（BUA #BU198320-01GBUA/BABB），并遵循UCSF的研究伦理准则。我们获得了由Discovery Life Sciences在经机构审查委员会批准的免除知情同意协议下收集的、来自患有非结核性呼吸道疾病个体的剩余痰液样本。
1. 缓冲液的制备
<ol>
	<li>自定义Triton缓冲液（表1）：配制100 mL自定义Triton缓冲液时，先将2 mL 5 M NaCl、1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8）、1 mL Triton X-100和0.2 mL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）混合，再加入超纯水定容至100 mL。使用前经滤膜除菌。最终缓冲液含有100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA和1% Triton X-100。</li>
	<li>低EDTA TE缓冲液（表2）：配制100 mL低EDTA TE缓冲液时，将1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8）与0.02 mL 0.5 M EDTA混合，再加入超纯水定容至100 mL。最终缓冲液含有10 mM Tris-HCl和0.1 mM EDTA。</li>
</ol>
2. 裂解管的制备
<ol>
	<li>使用手术刀片，在1.5 mL螺口管的拐点稍下方小心地将其底部切下。</li>
	<li>将P1000吸头的尖端剪去，在末端附近切出一个V形缺口，然后将已制备好的螺口管底部嵌入该缺口内。参见图1以查看刮勺的示意图。</li>
	<li>在无菌容器（例如储液槽或培养皿）中装入0.1 mm氧化锆-硅酸盐珠，使用制备好的刮勺将一勺珠子（约200 mg）分装至1.5 mL螺口管中。</li>
</ol>
<img alt="使用移液器和P1000吸头进行培养皿实验设置的示意图，用于实验室液体操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图1"> 
图1：自制珠子分配勺。 该勺子设计用于将约200 mg的0.1 mm氧化锆珠轻松转移至处理管中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 输入样本的制备
注意：所有样品制备操作均应根据您所在机构的生物安全规程进行。我们强烈建议在II级生物安全柜（BSC）内操作传染性材料，以最大限度降低气溶胶暴露风险。
<ol>
	<li>细菌细胞培养
	<ol>
		<li>将约 5 mL 的 M. tuberculosis 培养物（MGIT 培养或浑浊的液体培养物）加入 15 mL 圆锥形离心管中，在最大速度（≥ 3,000 x g）下离心 10 分钟。</li>
		<li>使用 10 mL 血清移液管，小心吸除上清液，仅保留约 500 µL，注意不要扰动沉淀。再用 P1000 移液器吸除剩余上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>用移液器反复吹打，将沉淀重悬于 350 µL 自制 Triton 缓冲液中。如需（例如将样本转移至 BSL-3 实验室外处理），应按照标准操作程序对样本进行灭活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>痰液样本制备
	<ol>
		<li>将 1–5 mL 痰液样本（自发或诱导咳痰）转移至无菌的 50 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DTT 液化
	<ol>
		<li>向痰液样本中加入四倍体积的 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）（体积可根据实际情况调整）。若使用商用试剂，请遵循生产商提供的稀释说明。</li>
		<li>充分涡旋振荡 30 秒，在室温（20–25 °C）孵育 7 分钟，再次涡旋振荡 30 秒。</li>
		<li>重复步骤 3.3.1 和 3.3.2 一次；对于黏稠度极高的样本，可进行最多 5 次孵育-涡旋循环。</li>
		<li>在最大速度（≥ 3,000 x g）下离心 10 分钟。使用 10 mL 血清移液管小心弃去上清液，仅保留约 500 µL，注意不要扰动沉淀。再用 P1000 移液器吸除剩余上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于 350 µL 自制 Triton 缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NALC-NaOH 液化
	<ol>
		<li>按照生产商提供的说明配制和稀释 NALC-NaOH 溶液。</li>
		<li>向痰液样本（自发或诱导咳痰，体积可变）中加入四倍体积的 NALC-NaOH 溶液。</li>
		<li>涡旋振荡 30 秒，在室温（20–25 °C）孵育 7 分钟。重复步骤 3.4.1 和 3.4.2 一次。对于黏稠度极高的样本，可进行最多 5 次孵育-涡旋循环。</li>
		<li>加入 PBS 至 50 mL 刻度线，短暂涡旋混匀。在最大速度（≥ 3,000 x g）下离心 10 分钟。</li>
		<li>使用 50 mL 血清移液管，小心弃去上清液，仅保留约 500 µL，注意不要扰动沉淀。再用 P1000 移液器吸除剩余上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于 350 µL 自制 Triton 缓冲液中。如需（例如将样本转移至 BSL-3 实验室外处理），应按照标准操作程序对样本进行灭活。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA 的提取
<ol>
	<li>将灭活的细菌悬液（来自步骤3的350 µL）转移至一个新的、标记清楚的1.5 mL螺旋盖离心管中，管内含有约250 µL的0.1 mm氧化锆-硅酸盐珠。</li>
	<li>以6.5 m/s的速度进行珠磨裂解，每次45秒，两次运行之间休息2分钟。共重复三次，完成三个珠磨循环。</li>
	<li>以最大速度（≥ 12,000 x g）离心2分钟，然后将150 µL上清液转移至另一个标记清楚的新离心管中。注意避免转移珠子或细胞碎片。</li>
	<li>将纯化磁珠在室温下平衡30分钟，并充分涡旋振荡，以确保使用前完全重悬。</li>
	<li>加入180 µL（1.2倍体积）的纯化磁珠，通过移液器上下吹打10次进行混合。室温孵育2分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，静置约2分钟直至溶液澄清。使用P200移液器小心弃去上清液，避免扰动磁珠。</li>
	<li>保持离心管仍在磁力架上，沿与磁珠相对的管壁加入500 µL新鲜配制的70%（v/v）乙醇。静置30秒。</li>
	<li>重复步骤4.5至4.7，共进行两次洗涤。最后一次洗涤结束后，用P10移液器吸除残留乙醇，并短暂干燥磁珠约2分钟。</li>
	<li>当磁珠沉淀变为不透明后，立即从磁力架上取下离心管，加入20 µL低EDTA Tris缓冲液重悬。切勿让磁珠完全干燥开裂。</li>
	<li>通过移液或涡旋振荡混合，确保所有磁珠均处于溶液中。室温孵育5分钟。</li>
	<li>将离心管放回磁力架，静置约2分钟直至溶液澄清。将洗脱的DNA转移至一个新的、标记清楚的离心管中，用于后续分析。吸取时避免带入磁珠，提取的DNA体积应< &lt;20 µL。</li>
</ol>
5. 分枝杆菌DNA的qPCR定量
<ol>
	<li>为了使用定量PCR检测分枝杆菌atpE（Rv1305）基因中99个核苷酸来定量分枝杆菌DNA，请在冰上为每个样本配制10 µL反应体系，其中包含5 µL通用探针预混液（2x）、0.4 µL正向引物（5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3'，10 µM）、0.4 µL反向引物（5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3'，10 µM）、0.2 µL TaqMan探针（5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3'，10 µM）、2 µL DNA模板以及2 µL无核酸酶水（表3）。</li>
	<li>按照以下热循环条件运行反应：95 °C初始变性60 s，随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性10 s和60 °C退火延伸30 s（在此处采集信号，升温速率为2.11 °C/s；表4）。 
	注意：本实验采用VIC标记的TaqMan探针，在QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统上进行qPCR检测。</li>
	<li>所有样本、标准品和对照均需设置技术重复三次。使用纯化的M. tuberculosis DNA系列稀释液生成标准曲线，并利用分析软件进行相对定量分析。</li>
	<li>将获得的相对定量结果导出为CSV格式，并使用R Studio（版本2024.09.1+394）进行可视化处理，绘制箱线图以比较不同DNA提取方法的得率。</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
<li>Oh, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Method+of+RNA+Extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中，我们介绍了一种可靠且经过验证的方案，通过珠磨法结合磁珠纯化，提取高质量的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，适用于后续的分子生物学及高通量测序（NGS）应用。
该方法相较于现有的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA提取方案具有多项优势。传统的苯酚-氯仿提取法通常需要数天时间，且会引入有害化学物质，而本方法可在60分钟内完成，产生的有害废弃物极少。该方法在试剂获取方面具有灵活性——缓冲液可从多家供应商购买，也可由实验室自行配制，从而降低对单一供应商的依赖。即使是磁珠本身，也可在具备中等复杂条件的实验室中合成20。尽管商业化的磁珠可能获得更高的提取得率，但该方法具有高度可适配性，使实验室能够在保持性能的同时优化成本。总体而言，该方法快速、可重复，并在多次实验及不同批次样本中均表现出稳定的一致性。因此，该方法适用于直接从痰液样本进行靶向下一代测序（NGS）检测，以及对培养分离株进行全基因组测序（WGS）。
...

提取高质量的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA对于利用靶向下一代测序（NGS）和全基因组测序（WGS）检测耐药结核病（TB）至关重要，但这一环节常被忽视。我们开发了一种标准化的实验方案，旨在为临床NGS应用提供稳定且高质量的DNA，包括Deeplex-MycTB（GenoScreen）等靶向NGS方法以及全基因组测序。目前，世界卫生组织（WHO）已推荐将这些方法用于耐药结核病的诊断。值得注意的是，尽管WHO推荐了基于NGS的诊断策略，但并未明确规定支持这些策略的具体DNA提取方案。本方法不仅可用于WHO认可的检测技术，也可用于依赖高质量分枝杆菌DNA的新兴技术。
提取的难点源于结核分枝杆菌（M. tuberculosis）独特的细胞壁结构，其由分枝菌酸和脂质组成，使得细胞极难破裂。目前发表的提取方法在裂解方式（如超声处理、化学法、加热法和珠击法）和DNA提取方法（如苯酚-氯仿提取法、乙醇沉淀法、CTAB法以及基于柱和磁珠的方法）方面存在显著差异，导致DNA的得率、纯度和质量各不相同1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。此外，不同研究团队很少采用相同的DNA提取方法，且对成功标准的衡量方式也各不相同。这使得确定最佳方法变得困难，因为最优方案取决于具体的分子应用类型。例如，利用长读长测序技术分析痰液中结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的结构变异，相较于仅靶向rpoB小片段区域的商业化诊断工具，需要更高品质的DNA和更精确的聚合酶。多个因素进一步增加了DNA提取成功的难度。可提取的DNA量取决于样本类型、细菌数量以及是否存在干扰物质（如共提取的非分枝杆菌DNA和PCR抑制剂）。即使是技术层面的因素，例如实验人员移液操作的精确性，也可能影响结果。在临床环境中常见的低菌量样本或高污染DNA样本中，现有方法往往表现不佳17,18,19。
在定制缓冲液中进行珠击破碎，随后采用珠清洁纯化流程，相比其他方法具有显著优势。该方法操作简便、流程快速，可减少操作者依赖性带来的变异，并保持DNA完整性，适用于下游的高通量测序（NGS）应用。这种标准化方案特别适用于临床实验室，有助于在采用世界卫生组织（WHO）推荐的NGS药物耐药性检测及全基因组测序（WGS）各类应用时，获得可靠且可重复的结果。

<table><tbody><tr><td>0.1 mm 氧化锆-硅酸盐珠</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>用于珠击步骤以裂解分枝杆菌细胞的珠子</td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>裂解后用于DNA纯化的磁珠</td></tr><tr><td>EDTA（0.5 M，pH 8.0）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>自定义Triton/低EDTA缓冲液组分</td></tr><tr><td>Fastprep 24</td><td>MPbio, USA</td><td>116004500</td><td>以6.5 m/s进行珠击的设备</td></tr><tr><td>正向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制合成</td><td>引物序列：AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O（水，分子生物学级）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2819-1</td><td>自定义Triton/低EDTA缓冲液组分</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe</td><td>New England Biolabs</td><td>M3004</td><td>用于分枝杆菌DNA定量的qPCR试剂</td></tr><tr><td>MycoPrep 试剂盒</td><td>BD</td><td>SKU/REF 240863</td><td>BD MycoPrep 标本消化试剂，用于NALC-NaOH痰液处理</td></tr><tr><td>NaCl（氯化钠，5 M 溶液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9759</td><td>自定义Triton/低EDTA缓冲液组分</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2272</td><td>痰液处理</td></tr><tr><td>反向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制合成</td><td>引物序列：GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>TaqMan 探针</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制合成</td><td>探针序列：AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl（1 M，pH 8.0）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>自定义Triton/低EDTA缓冲液组分</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28314</td><td>自定义Triton/低EDTA缓冲液组分</td></tr></tbody></table>

使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌dna并进行下一代测序工作流程

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

结核病是一种致命性疾病，其致病菌Mycobacterium tuberculosis对抗生素产生耐药性，进一步恶化了治疗效果。通过测序技术精确且快速地识别耐药性，有助于制定个体化治疗方案，从而改善结核病患者的预后。DNA提取方法对下游分子检测至关重要，但由于Mycobacterium具有坚韧的细胞壁、许多临床样本中细菌载量较低，以及痰液基质成分复杂，使得提取过程面临挑战。目前已报道多种M. tuberculosis DNA提取方法，但尚无公认的金标准。此外，其中很少有方法被证明具有稳定的重复性，且许多方法不适用于资源有限且结核病负担较高的地区。因此，实验室常自行修改操作流程，导致方法间存在显著差异。本文介绍一种经济、快速且标准化的分枝杆菌DNA提取方案，适用于临床痰液样本及培养物，所提取DNA可用于qPCR检测，建议在临床诊断实验室中推广应用。

我们对培养的样本和 M. tuberculosis 和 M. tuberculosis 加 spiked 痰液样本（每种条件 n = 3）。使用培养的 M. tuberculosis H37Rv mc² 7901，我们将输入量标准化为 8.4 x 106 每50 µL含细胞数相当于200 GU的1 mL MGIT培养物。对于痰液实验，我们使用来自非结核性呼吸道疾病患者的混合痰液（商业获取），分别加入两种不同浓度的细菌（50,000，约相当于痰涂片1+等级；10,000条杆菌，约相当于痰涂片稀少等级），以评估该方法在不同细菌载量下的检测性能。
我们采用定制的TaqMan qPCR检测单拷贝基因，以评估DNA得率（图2）。在所有样本中均检测到结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，包括纯培养物和加标痰液样本，重复实验之间的差异较小；然而，在仅添加10,000个细胞的加标痰液样本中，其定量结果存在较大变异。
<p ...

本方案表明，珠击法结合DNA捕获磁珠纯化可快速、稳定地从结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）样本中提取DNA，是适用于下一代测序应用的有效方法。

使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌DNA并进行下一代测序工作流程

结核病是一种致命性疾病，其致病菌结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对抗生素产生耐药性，使病情进一步恶化……

我们的诊断学研究致力于在资源有限的环境中提高结核病耐药性的检出能力，重点关注检测的速度和实用性。在结核病诊断领域，目前已有一些更为全面的基因型检测方法，甚至出现了多种新型快速表型检测技术，并且一直有努力推动这些检测方法更接近临床诊疗现场。然而，仍存在诸多实际应用中的障碍。从试剂到基础设施再到物流，资源方面的挑战仍然是重大障碍。除了像Cepheid Xpert检测这样技术上较为成熟的检测方法外，在不同环境中实现操作流程的标准化十分困难。因此，本研究所详细描述的结核分枝杆菌（MTB）DNA提取，便是这一问题的典型例证。迫切需要扩大基于测序的结核病诊断技术的应用，但许多实验室仍然缺乏可靠的方法来提取高质量的DNA。我们的目标是分享一种简单、实用且适用于资源有限的即时检测环境的方法。本文介绍了一种设计用于资源有限环境的简单且低成本的实验方案。该方法已通过NGS应用验证，并与自动化液体处理系统兼容。首先，将氯化钠溶液、Tris盐酸盐缓冲液、Triton X-100和EDTA混合，配制Triton缓冲液。搅拌混匀，并加入超纯水至终体积为100毫升。使用前对缓冲液进行过滤除菌。接着，通过混合1毫升1摩尔的Tris-HCl和20微升0.5摩尔的EDTA，配制100毫升低EDTA的Tris-EDTA缓冲液。混匀后用超纯水定容至终体积100毫升。然后对缓冲液进行过滤除菌。制备裂解管时，使用手术刀片在1.5毫升螺口管的拐点下方小心地将管底切除。剪去P1000移液器吸头的尖端，并在其末端附近制作一个V形楔口。将螺口管的切口底部楔入V形移液器吸头中，制成一个勺状工具。用无菌容器盛装0.1毫米的氧化锆硅酸盐珠。使用制备好的勺具，将约200毫克的珠子转移至1.5毫升螺口管中。在制备细菌细胞培养物时，将5毫升结核分枝杆菌培养物转移至15毫升锥形离心管中。以最大速度离心10分钟。然后使用10毫升血清移液管小心移除上清液，仅保留约500微升，注意不要扰动沉淀物。使用 P1000 移液器吸除残留的上清液。将沉淀重悬于 350 µL 自配 Triton 缓冲液中，然后通过上下吹打充分混匀。将样品置于干浴器中，95 °C 加热 30 分钟。取一到五毫升痰液样本，转移至无菌的50毫升离心管中，以制备痰液。进行二硫苏糖醇（DTT）液化时，向痰液样本中加入四倍体积的10毫摩尔二硫苏糖醇，然后充分涡旋振荡30秒。以最大转速离心样本10分钟。然后使用10毫升血清移液管弃去上清液，仅保留500微升。用P1000移液器吸除剩余上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀重悬于350微升自制Triton缓冲液中。进行NALC氢氧化钠液化时，向痰标本中加入四倍体积的NALC氢氧化钠溶液。将混合物涡旋振荡30秒，然后在室温下孵育7分钟。现在加入 PBS 至 50 毫升刻度线。涡旋振荡管内物质以充分混匀，然后以最大速度离心 10 分钟。离心后，用 50 毫升血清移液管按之前演示的方法弃去上清液。然后将沉淀重悬于350 µL定制的Triton缓冲液中。首先，将350 µL灭活样本转移至含有250 µL 0.1 mm氧化锆硅酸盐珠的已标记1.5 mL螺口管中。以每秒6.5米的速度对裂解液进行珠磨，每次45秒，循环间休息2分钟。将样品在最大速度下离心两分钟，然后转移150微升上清液至一个新的已标记试管中。接下来，涡旋振荡已在室温平衡30分钟的纯化磁珠，以重新悬浮磁珠。将180微升磁珠转移至DNA样品中。上下吹打10次以混匀。室温孵育2分钟后，将离心管置于磁力架上，静置2分钟，待溶液澄清。然后使用200微升移液器弃去上清液。保持离心管仍在磁力架上，沿管壁对侧加入500微升新配制的70%乙醇，静置30秒。最后一次洗涤结束后，用10微升移液器吸除残留乙醇，并在空气中干燥两分钟。一旦磁珠变为不透明，立即将离心管从磁力架上取下。用20 µL低EDTA Tris缓冲液重悬。通过移液或涡旋混匀，确保所有磁珠均处于溶液中，然后在室温下孵育5分钟。接着，将离心管置于磁力架上2分钟，直至溶液变澄清。然后转移少于20微升的洗脱DNA至一个新的已标记试管中，以避免磁珠残留。为使用定量PCR（靶向分枝杆菌atpE基因的99个核苷酸）定量分枝杆菌DNA，请在冰上配制QPCR预混液。根据样本和标准品的数量调整预混液用量，并额外增加10%以补偿移液过程中的损耗。将热循环仪程序设置为95 °C下运行60秒，随后进行35个循环：95 °C下10秒，60 °C下30秒，升降温速率为2.11 °C/秒。所有样本、标准品和对照均需设置三个重复。在此实验条件下，结核分枝杆菌培养物在所有测试条件中获得了最高的DNA浓度。加标痰液样本显示，随着细菌输入量的减少，DNA 产量逐渐降低，变异程度增加，尤其在 10,000 细菌组中更为明显。

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用定制缓冲液中的微珠打浆，然后进行 NGS 工作流程进行分枝杆菌 DNA 提取

本文介绍了两种植物细胞器DNA富集方法的比较与优化：传统的差速离心法，以及基于甲基化状态对总基因组DNA进行分馏的方法。我们评估了所获得DNA的数量和质量，展示了其在短读长的下一代测序中的表现，并讨论了其在长读长单分子测序中的应用潜力。...

适用于下一代测序的植物细胞器DNA富集方法的优化与比较分析

纳米孔测序技术在生命科学领域具有广泛应用，包括病原体鉴定、食品安全监测、基因组分析、宏基因组环境监测以及细菌抗生素耐药性表征。本文展示了利用纳米孔测序技术对土壤DNA进行宏基因组测序以实现物种鉴定的操作流程。...

纳米孔DNA测序用于宏基因组土壤分析

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。...

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

长读长测序技术显著促进了复杂基因组的组装以及结构变异的表征。本文介绍一种基于纳米孔测序平台生成超长读长序列的方法。该方法采用优化的DNA提取流程，结合改进的文库制备步骤，可从人类细胞中获得数百千碱基长度的读长，并达到中等测序深度。...

超长读长测序在全基因组DNA分析中的应用

利用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

本文介绍了一种利用磁珠提取蚊虫DNA的方案，可获得高质量的DNA提取物。这些提取物适用于后续的高通量测序分析。...

一种基于磁珠的蚊虫DNA提取方案及其在下一代测序中的应用

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。...

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

我们提出了一种优化的DNA提取方法，该方法采用基于基质的提取法结合磁珠纯化技术，从去污染的痰液样本中提取DNA，用于后续对结核分枝杆菌（Mycobacterium...

基于基质的DNA提取用于污染清除痰液样本的靶向下一代测序

本方案描述了使用CTAB法从分枝杆菌中提取高质量DNA的方法，克服了其富含分枝菌酸、结构坚韧的细胞壁所带来的提取困难。该过程包括酶消化、CTAB裂解细胞、以及通过有机萃取和乙醇沉淀进行DNA纯化。该方法所获得的DNA适用于分子生物学研究，是分枝杆菌研究中可靠的技术手段。...

全基因组脱氧核糖核酸提取自 分枝杆菌属 物种 通过 十六烷基三甲基溴化铵法

本文介绍一种利用靶向富集技术对临床样本中细菌性性传播感染病原体进行全基因组测序的实验方案。这种基于综合征检测面板的创新方法克服了样本中人类DNA含量高而细菌载量低的技术难题，有助于对沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum）和生殖支原体（Mycoplasma...

利用靶向富集工作流程从临床样本生成完整的细菌基因组

本研究描述了一种在染色体序列已知或无需关注时，对质粒进行纳米孔测序的工作流程。初始的质粒DNA富集步骤可确保最佳的质粒测序深度，并最大化每张流动池可测序的样本数量。...

基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

学习使用微珠打浆和磁珠纯化技术从结核分枝杆菌样本中提取DNA的方法。该流程适用于下一代测序应用，可在资源有限的环境中实现快速、可靠的DNA提取。

使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌DNA并进行下一代测序工作流程

探索更多视频