使用定制缓冲液中的微珠打浆，然后进行 NGS 工作流程进行分枝杆菌 DNA 提取
2025年6月13日
该方案显示，磁珠打动与 DNA 捕获磁珠纯化相结合，为从 结核分枝杆菌 样品中提取 DNA 提供了一种快速一致的方法，使其成为下一代测序应用的有效选择。
我们的诊断研究重点是在有限的资源环境中提高结核病耐药性的检测，重点是速度和实用性。在结核病诊断中，有更全面的基因型检测，甚至还有许多新的快速表型检测，并且一直在推动使这些检测更接近护理点。但仍然存在许多务实的障碍。
从试剂到基础设施再到物流的资源挑战仍然是重大障碍。除了 Cepheid Xpert 检测的技术复杂性之外，在不同环境中的方案标准化都很困难。因此，山地铁 DNA 提取，正如这项工作中所详述的那样，就是一个典型的例子。
迫切需要扩展基于测序的结核病诊断，但许多实验室仍然缺乏提取高质量 DNA 的可靠方法。我们的目标是分享一种简单、实用且适合资源匮乏的护理点环境的方法。在这里，我们提出了一种简单的低成本协议，设计用于资源有限的环境。
它已通过 NGS 应用验证，并与自动液体处理系统兼容。首先，将氯化钠溶液Tris盐酸盐缓冲液，Triton X 100和EDTA混合制成Triton缓冲液。通过搅拌混合并加入超纯水，最终体积为 100 毫升。
使用前对缓冲液进行过滤消毒。接下来，通过将一毫升一摩尔 Tris-HCl 和 20 微升 0.5 摩尔 EDTA 混合，制备 100 毫升低 EDTA Tris-EDTA 缓冲液。混合并填充超纯水，最终体积为 100 毫升。
然后过滤对缓冲液进行灭菌。要准备裂解管，请使用手术刀刀片小心地从拐点正下方的 1.5 毫升螺旋盖管上切下底部。从 P1000 移液器吸头上切下吸头，并在末端附近做一个 V 形楔形。
将螺旋盖管的切割底部楔入 V 形移液器吸头中，形成勺子。用 0.1 毫米氧化锆硅酸盐珠填充无菌容器。使用准备好的勺子，将大约 200 毫克珠子转移到 1.5 毫升螺旋盖管中。
为了制备细菌细胞培养物，将5毫升结核分枝杆菌培养物转移到15毫升锥形离心管中。以最大速度离心10分钟。现在使用 10 毫升血清移液器小心地去除除大约 500 微升外的所有上清液，而不会干扰沉淀。
使用 P1000 移液器去除剩余的上清液。将沉淀重悬于 350 微升定制 Triton 缓冲液中，然后通过上下移液充分混合。在95摄氏度的干热浴中加热样品30分钟。
为了制备痰液，将一到五毫升的痰液样本转移到无菌的50毫升离心管中。要进行二硫苏糖醇液化，请向痰液样本中加入四体积的 10 毫摩尔二硫苏糖醇，然后彻底涡旋 30 秒。以最大速度离心样品 10 分钟。
然后使用 10 毫升血清移液器丢弃除 500 微升外的所有上清液。用 P1000 移液器去除剩余的上清液，而不会干扰沉淀。将沉淀重悬于 350 微升定制 Triton 缓冲液中。
要进行 NALC 氢氧化钠液化，请向痰样中加入四体积的 NALC 氢氧化钠溶液。涡旋混合物 30 秒。然后将试管在室温下孵育七分钟。
现在将 PBS 添加到 50 毫升标记。涡旋管中的内容物使其充分混合，然后以最大速度离心管 10 分钟。离心后，用50毫升血清移液器，如前所述丢弃上清液。
然后将沉淀重悬于 350 微升定制 Triton 缓冲液中。首先，将 350 微升灭活样品转移到含有 250 微升 0.1 毫米氧化锆硅酸盐珠的标记的 1.5 毫升螺旋盖管中。珠子以每秒 6.5 米的速度敲打裂解物 45 秒，周期之间休息两分钟。
以最大速度离心样品两分钟，然后将 150 微升上清液转移到新的标记管中。接下来，涡旋清理在室温下等价30分钟的磁珠，以重悬它们。将 180 微升磁珠转移到 DNA 样品中。
上下移液10次混合。在室温下孵育两分钟后，将试管放在磁架上并等待两分钟让溶液澄清。然后使用 200 微升移液器丢弃上清液。
将管子仍放在磁架上，沿着对面壁加入 500 微升新鲜制备的 70% 乙醇，并等待 30 秒。最后一次洗涤结束时，用 10 微升移液器去除残留的乙醇并风干两分钟。一旦珠子变不透明，就从磁架上取下管子。
重悬于 20 微升低 EDTA Tris 缓冲液中。通过移液或涡旋混合，以确保所有磁珠在溶液中，然后在室温下孵育五分钟。接下来，将试管放在磁架上两分钟直至变通。
然后将少于 20 微升的洗脱 DNA 转移到新的标记管中，以避免磁珠残留。要使用靶向分枝杆菌 atpE 的 99 个核苷酸的定量 PCR 定量分枝杆菌 DNA，请在冰上组装 QPCR 预混液。根据样品量和标准品调整预混液，包括 10% 的超量，以考虑移液损失。
在 95 摄氏度下运行热循环仪 60 秒，然后以每秒 2.11 摄氏度的斜坡速率运行 35 次 95 摄氏度 10 秒和 60 摄氏度 30 秒的循环。一式三份运行所有样品、标准品和对照。在这里，结核分枝杆菌培养物在所有测试条件下产生了最高的 DNA 浓度。
加标痰液样本显示 DNA 产量逐渐降低，并且随着细菌输入的减少而增加变异，尤其是在 10， 000 个细菌组中。
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概述
本协议展示了一种使用珠子搅拌和DNA捕获珠子纯化从结核分枝杆菌样本中提取DNA的快速可靠方法。这种方法特别适用于下一代测序应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因组学
- 传染病学
背景
- 改进结核病诊断对于检测耐药性至关重要。
- 资源限制在各种环境中带来重大挑战。
- 标准化协议在基本测定之外很难实现。
- 高效的DNA提取方法对于准确的测试至关重要。
研究目的
- 提高从结核分枝杆菌样本中提取DNA的速度和效率。
- 提供一种可以在不同资源环境中标准化的方法。
- 支持结核病研究中的下一代测序工作。
所用方法
- 用于细胞裂解的珠子搅拌技术。
- 用于提取的DNA捕获珠子纯化。
- 该方法在各种实验室环境中的应用。
- 评估该方法在测序中的有效性。
主要结果
- 该方法从结核分枝杆菌样本中提供一致的DNA产量。
- 显著减少了DNA提取所需的时间。
- 与下一代测序工作流程兼容。
- 解决了资源有限环境中面临的挑战。
结论
- 本协议为结核病诊断中的DNA提取提供了一种实用解决方案。
- 它可以促进耐药性的改进检测。
- 该方法的标准化可以增强全球的测试能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable extraction of high-quality Mycobacterium tuberculosis DNA is a critical bottleneck for sequencing-based drug resistance profiling in tuberculosis diagnostics. This protocol addresses the need for standardized, reproducible DNA extraction workflows that are compatible with both qPCR and next-generation sequencing, especially in resource-limited and high-burden settings. By enabling consistent sample preparation, it supports translational continuity and predictive confidence in infectious disease R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of mycobacterial genetic material for resistance marker identification.
- Supports biological de-risking by ensuring DNA quality suitable for downstream molecular assays.
- Facilitates predictive confidence in target validation through standardized extraction outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DNA samples for high-throughput qPCR and NGS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across diverse laboratory environments.
- Enables reliable evaluation of clinical and cultured samples for resistance screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample preparation with translational biomarker discovery in tuberculosis research.
- Ensures continuity from clinical sample acquisition to preclinical molecular analysis.
- Reduces risk of sample variability impacting downstream sequencing and analytics.
Pipeline & Workflow Integration
This DNA extraction protocol fits at the interface of clinical sample processing and molecular assay readiness, bridging early discovery, screening, and translational research workflows.
- Discovery Biology: Provides high-integrity DNA for hypothesis testing and resistance mechanism studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative DNA yields for assay development and validation.
- Analytics: Supports qPCR and NGS readouts, enabling comparative analysis of extraction efficiency and sample quality.
- Translational Research: Maintains sample integrity for biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable extraction capability adaptable to various laboratory settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in resistance profiling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of DNA extraction workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in infectious disease R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of sequencing-based diagnostic programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in sample handling and molecular biology protocols.
- Needs access to bead-beating instrumentation and magnetic bead purification systems.
- Demands cross-team standardization for consistent protocol execution.
- Adaptable to both clinical sputum and cultured mycobacterial samples.
- Potential limitations in extremely low-resource settings may require further adaptation.
