用于发育中和成熟 拟南芥 种子胚乳细胞层显微分析的完整组织的制备

我们的研究范围之一是种子科学。我们的目标是回答胚乳如何促进种子发芽的问题。一种称为种子生长抑制测定的体外测定揭示了胚乳在种子发芽中的生理重要性。拟南芥种子很小，胚乳细胞层的位置在睾丸下方，睾丸是细胞。在不进行化学固定的情况下制备胚乳样品具有挑战性。以往对胚乳分析的分析使用了化学固定的样品，因此无法观察到生物体蛋白质的运动。我们的方案能够对胚乳细胞的动力学进行五种细胞成像。我们的方案可以使用标准实验室设备执行，并能够更深入地了解细胞间事件和分子机制以及常规胚乳功能。

[旁白]开始在土壤或岩棉上种植拟南芥植物，直到开花阶段。用彩色线标记完全开放的花朵，以表示开花后零天。在开花后 12 至 16 天选择角果进行下一个程序。用细剪刀剪掉花梗处标记的发育中角果，并将它们收集在 1.5 毫升管中。准备用于解剖的湿滤纸以防止干燥，并将样品置于体视显微镜下。使用两个镊子，一个带有粗尖端用于握持，另一个带有锋利的尖端用于撕裂。从李子上分开一个阀门。然后使用尖端关闭的镊子，轻轻地从角果中捡起正在发育的种子，以免损坏它们。使用 27 号注射针头时，在胚胎周围的睾丸和胚乳上形成大约 0.1 至 0.2 毫米大小的疤痕。用镊子夹住种子，不要压碎它，并在子叶和根基的交界处留下疤痕。现在，用镊子捏住种子，将胚胎推出，注意不要压碎种子包膜并保持其圆形。将注射针插入疤痕处的空种子包膜中，从内向外刺穿。接下来，将针头固定到位，并使用封闭的尖端镊子刮擦睾丸的表面。然后切开种子信封的一侧，使其打开。现在使用锋利的尖端镊子，将种子信封打开成一张纸。分离的样品现在应该是由胚乳和睾丸组成的双层片。将干燥的拟南芥种子放入 1.5 毫升管中，加入一毫升双蒸馏水。将种子在室温下浸泡至少 40 分钟。在体视显微镜的载物台上准备一张湿滤纸进行解剖，并使用1000微升微量移液器将吸收的种子转移到湿滤纸上。现在将样品放在体视显微镜下。使用注射针，在胚胎周围的睾丸和胚乳上留下约 0.2 毫米大小的疤痕。用镊子握住种子，不要压碎它，并瞄准子叶和根基之间的连接处作为疤痕。现在用镊子捏住种子后将胚胎推出。避免压碎空种子包膜并保持其圆形。使用注射针，切割空种子包膜的上下两侧，将其塑造成圆柱形。接下来，沿其中心轴切割圆柱形种子包膜，将其分成两部分。结果应该是由胚乳和睾丸制成的双层片。将分离的胚乳样品作为载玻片上的片状放置，并将它们安装在水中。最后，轻轻地将盖玻片放在样品上，确保胚乳层朝上朝向盖玻片。在显微镜下观察样品之前，使用指甲油或油脂密封盖玻片的边缘并防止干燥。使用既定的制备方案，从开花后14天收获的种子中成功地可视化了许多胚乳细胞及其细胞内结构。在胚乳细胞的细胞核内检测到光体，在白光下表达PHYB-GFP，证实了它们的存在和核定位。胚乳细胞在交替的远红光和红光照射下显示出可逆的光体形成，证实了解剖后长达 4.5 小时的 PHYB 光可逆性和生物活性。在种子抑制3小时后对完整胚乳细胞中的线粒体进行荧光延时成像，并检测线粒体运动。种子抑制一天后，在胚乳细胞中观察到更动态的线粒体运动，表明活性随着时间的推移而增加。