在受伤的斑马鱼幼鱼中建立持续性Pseudomonas aeruginosa感染模型

由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）引起的慢性感染对抗生素具有耐受性，极难治疗。我们的目标是建立一种体内模型，以加速高效疗法的发现。抗菌药物的筛选主要在体外进行，而在慢性感染小鼠中测试药物则面临复杂的挑战。为了弥合这两种方法之间的差距，我们提出一种利用受伤斑马鱼幼鱼的替代性临床前模型。本研究建立的斑马鱼持续感染模型采用临床来源的铜绿假单胞菌菌株，能够再现抗生素耐受现象。相较于通常用于感染斑马鱼幼鱼的显微注射方法，我们的创伤感染方法更接近自然感染途径，且更适合用于治疗化合物的筛选。

[旁白] 首先，将25号针头放置在两根筷子上，以便于操作。使用体视显微镜识别并移除发育异常或无活性的胚胎。通过环形移动培养皿，将剩余的胚胎聚集至中央。接着，使用两根垂直方向的针分别分离每个胚胎，将左侧的针置于尾部以保持胚胎身体平直。用右侧的针在脊索边缘进行单次切割，以去除尾鳍。每一切割操作应迅速完成，并确保所有胚胎在10分钟内均浸入细菌溶液中。在感染操作中，于二级生物安全柜内将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）溶液涡旋混匀，并将其以约1×10⁷ 菌落形成单位/毫升的浓度加入六孔板中。使用一次性玻璃巴斯德吸管收集受伤的胚胎，并将其转移至细菌溶液中。将六孔板置于28°C条件下孵育1.5小时。孵育结束后，取出感染的胚胎，并置于微生物安全柜中进行清洗。随后，用玻璃吸管将胚胎转移至10毫升不含亚甲蓝的鱼水中，尽量减少转移液体体积，并在室温下孵育30分钟。然后，再次用玻璃吸管将胚胎转移至4毫升不含亚甲蓝的鱼水中，短暂孵育。接下来，使用吸管将感染的胚胎逐个转移至24孔板中，每孔加入1毫升不含亚甲蓝的鱼水。将24孔板放入设定为28°C的培养箱中。为每个感染的幼鱼准备含有95微升1×PBS的1.5毫升微量离心管。将幼鱼转移至含有4毫升不含亚甲蓝鱼水的六孔板中，清洗以去除浮游细菌。将每个清洗后的胚胎放入含PBS的微量离心管中，尽可能少地带入液体。接着，使用研磨杵在微量离心管壁上碾碎每个胚胎，之后将研磨杵留在管内。然后提起研磨杵，并加入100微升2% PBS-Triton溶液，以冲洗研磨杵上残留的细菌，最终使Triton浓度为1%。涡旋混匀离心管并孵育10分钟。随后，从每个胚胎的未稀释裂解液中分别取三滴、每滴10微升，点样于LB琼脂平板上。使用多通道移液器在96孔板中对每份裂解液进行系列稀释，最高稀释至10⁻³。最后，在未稀释点样位置旁，分别点加三滴10微升的稀释液。于37°C过夜孵育。所有四种囊性纤维化来源的铜绿假单胞菌分离株在损伤胚胎模型中的毒力均显著低于PAO1参考菌株。在感染其中两种分离株的胚胎中，细菌载量在三天内明显下降，表明细菌被清除。相比之下，另外两种分离株B6513和RP73在感染后18至65小时期间，细菌载量在初始下降后维持相对稳定，提示其具有持续感染能力。在感染后1.5小时进行30分钟的妥布霉素短时处理，可显著降低B6513分离株感染胚胎中的细菌载量。然而，若在感染后24或48小时给予妥布霉素，则对细菌载量无显著影响，表明在持续感染阶段已产生耐药性。