对受伤斑马鱼幼虫的持续性铜 绿假单胞 菌感染进行建模

由铜绿假单胞菌引起的慢性感染对抗生素具有耐受性，很难治疗。我们的目标是开发一种体内模型，以加速有效疗法的发现。抗菌药物大多在体外筛选，在慢性感染小鼠中测试药物是一项复杂的挑战。为了填补这两种方法之间的空白，我们提出了一种使用受伤斑马鱼幼虫的替代临床前模型。我们基于使用铜绿假单胞菌临床菌株的斑马鱼持续感染模型复制了抗生素耐受性。微量注射通常用于感染斑马鱼幼虫，而我们的伤口方法反映了自然感染模式，非常适合筛选治疗性化合物。

[旁白]首先，将 25 号针放在两根筷子上，以方便作。使用体视显微镜识别并去除发育异常或无法存活的胚胎。以圆周运动移动培养皿，将剩余的胚胎收集在中心。现在，使用两根垂直方向的针头分离每个胚胎，将左针放在尾部以保持身体笔直。用正确的针，在脊索的边缘做一个切口以去除鳍。快速完成每次切割，确保所有胚胎在 10 分钟内浸入细菌溶液中。对于感染程序，将铜绿假单胞菌溶液在2型生物安全柜下涡旋，并以每毫升7个菌落形成单位的大约10乘以将其添加到六孔板中。使用一次性玻璃巴斯德移液器收集受伤的胚胎，并将其转移到细菌溶液中。将六孔板在28摄氏度下孵育1.5小时。孵育后，取出受感染的胚胎并将其置于微生物安全处进行洗涤。现在，用玻璃移液器将胚胎转移到10毫升不含亚甲蓝的鱼水中，尽量减少转移体积，并在室温下孵育30分钟。然后，用玻璃移液器再次将胚胎转移到四毫升不含亚甲蓝的鱼水中，并短暂孵育。接下来，用移液器将受感染的胚胎单独转移到 24 孔板中，向每个孔中加入一毫升不含亚甲蓝的鱼水。将 24 孔板放入设置为 28 摄氏度的培养箱中。为每个受感染的幼虫准备 1.5 毫升微量离心管，其中装有 95 微升 1X PBS。将幼虫转移到装有四毫升不含亚甲蓝的鱼水的六孔板中，以清洗和去除浮游细菌。将每个洗涤的胚胎放入装有PBS的微量离心管中，转移尽可能少的液体。现在，用杵将每个胚胎压碎在微量离心管的侧面，然后将杵留在管内。然后，提起杵并加入 100 微升 2% PBS Triton 以冲洗杵中的残留细菌，达到 1% 的最终浓度。涡旋管并孵育 10 分钟。接下来，将三滴 10 微升未稀释裂解物从每个胚胎中分配到 LB 琼脂平板上。使用多通道移液器将 96 孔板中的每种裂解物连续稀释至 10 的负 3 次方稀释度。最后，在未稀释的点旁边滴三滴 10 微升稀释液。并在37摄氏度下孵育过夜。与 PAO1 参考菌株相比，所有四种囊性纤维化铜绿假单胞菌分离株在受伤胚胎模型中的毒性显着降低。在感染两个分离株的胚胎中，细菌载量在三天内显着减少，表明细菌被消除。相比之下，另外两种分离株 B6513 和 RP73 在感染后 18 至 65 小时内在初始下降后保持相对稳定的细菌载量，表明细菌载量持续存在。在感染后 1.5 小时用妥布霉素进行 30 分钟的短暂治疗可显着降低感染分离株 B6513 的胚胎中的细菌负荷。妥布霉素在感染后 24 或 48 小时给药时对细菌载量没有显着影响，在持续感染阶段表现出耐药性。