Name: 对受伤斑马鱼幼虫的持续性铜 绿假单胞 菌感染进行建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 了解利用受伤斑马鱼幼虫建立铜绿假单胞菌持续性感染模型的方法。该模型通过模拟自然感染过程，可用于高通量筛选抗菌药物并加速新型治疗方案的发现。

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我们感谢斯特凡·蓬（Stéphane Pont，蒙彼利埃LPHI），他为建立本方法学做出了重要贡献，并生成了文中所示的部分结果 图3，如配套文章所述13我们感谢P. Plésiat（法国国家参考中心）&#160;感谢法国贝桑松的抗微生物药物耐药性研究机构提供临床菌株A6520、B6513和C6490，感谢意大利米兰的A. Bragonzi提供菌株RP73。我们感谢C. Gonzalez和V. Goulian提供LPHI的水生模型设施ZEFIX。本研究由Vaincre La Mucoviscidose（项目编号：RF20200502703、RF20210502864、RF20220503060）和Association Gregory Lemarchal资助。水生实验设施得到欧洲共同体H2020计划[玛丽·居里创新培训网络Inflanet：资助协议编号n° 955576]的支持。

本研究中描述的所有斑马鱼实验均在蒙彼利埃大学进行，遵循欧洲联盟关于实验动物管理的指南中规定的“3R”原则——替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement），并已获得埃罗省卫生与兽医部门以及科学用途动物使用伦理委员会（编号：CEEA-LR-B4-172-37）的批准。所有感染实验均在受精后5天内的胚胎上进行。 成年斑马鱼（Danio rerio）的繁殖来自AB品系或Golden品系，遵循欧盟动物保护指令2010/63/EU规定的国际指南。蒙彼利埃大学的斑马鱼养殖设施采用标准条件：12小时光照与12小时黑暗循环，使用3.5 L聚碳酸酯水箱（每箱最多饲养22条鱼），连接具有4%盐度/400 µS电导率的循环水系统，水温维持在28 °C。鱼类每日投喂两次饲料。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>制备用于培养斑马鱼胚胎的1x工作浓度鱼水，可选择是否添加亚甲蓝（见表1）。</li>
	<li>按照表1所述方法配制20x储备液（0.4%）和1x工作浓度三卡因麻醉液。为避免反复冻融储备液，建议将20x三卡因溶液分装为每份10 mL，于-20 °C保存。</li>
	<li>用1x磷酸盐缓冲液（PBS；表1）稀释配制2%曲拉通溶液。</li>
</ol>
2. 制备稳定表达GFP的荧光  P. aeruginosa
注意：所有涉及P. aeruginosa的操作均须在生物安全柜中采取BSL-2级防护措施。P. aeruginosa菌株应经过基因改造，以持续表达荧光报告蛋白，例如GFP（本文采用此方法，详见文献13）。强烈建议使用染色体整合型荧光报告蛋白的菌株，以避免质粒携带型荧光报告蛋白因质粒丢失而影响实验结果。
<ol>
	<li>在感染前2天，从-80 °C保存的菌种中将表达GFP的基因修饰型P. aeruginosa划线接种至LB琼脂平板（表1），并在37 °C下过夜培养。</li>
	<li>使用荧光显微镜（放大倍数6倍）检查菌落的荧光情况，挑取一个GFP+P. aeruginosa单菌落接种于1 mL LB液体培养基（表1）中，于37 °C振荡培养（180 rpm）过夜。</li>
	<li>在感染当天，将上述过夜培养的P. aeruginosa培养物按1:20比例转接至5 mL新鲜LB液体培养基中，在37 °C振荡（180 rpm）培养，直至菌液OD600达到0.8，约需2–3小时。</li>
	<li>将细菌培养物在室温（RT）下以3584 × g离心10分钟，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于4 mL不含亚甲蓝的鱼用水中。</li>
	<li>用鱼用水调整菌液体积，使终浓度为7 × 107至1 × 108 CFU/mL。此浓度对应OD600约为0.15（需根据不同菌株进行调整）。</li>
	<li>为定量接种物，对细菌悬液进行系列稀释，取10-4稀释度的菌液20 µL涂布于LB琼脂平板，于37 °C过夜培养。</li>
	<li>在荧光显微镜下计数GFP+菌落，以确定接种物的CFU数。</li>
</ol>
3. 斑马鱼胚胎的收集与制备
<ol>
	<li>在细菌浸染实验前3天，设置斑马鱼繁殖配对。将一尾繁殖期的雄鱼和雌鱼放入交配缸中。</li>
	<li>次日早晨，使用细网筛收集受精后的卵，并将收集的卵置于含有亚甲蓝的鱼水中培养皿中。</li>
	<li>为避免污染，在培养皿中加入1滴漂白剂。5分钟后，更换含亚甲蓝的鱼水以去除漂白剂。</li>
	<li>弃去胚胎发育异常（未受精卵类似于单细胞期卵）或已死亡（呈白色）的卵。</li>
	<li>感染当天早晨（2 dpf），在体视显微镜（放大倍数11倍）下用两把极细的镊子去除胚胎的卵膜。用镊子撕开卵膜，注意不要夹伤胚胎，以便释放出胚胎。</li>
	<li>将去膜后的胚胎放入含有亚甲蓝的鱼水的培养皿中，于28 °C培养至感染开始。</li>
</ol>
4. 胚胎损伤
<ol>
	<li>在细胞培养皿（35 mm × 10 mm）中，使用不含亚甲蓝并含有0.02%三卡因的鱼水对斑马鱼胚胎进行麻醉，于损伤前约5分钟开始。胚胎不再活动，且对刺激无反应。</li>
	<li>将25G针头放置在两根筷子顶端，以方便操作针头。</li>
	<li>在体视显微镜下剔除发育异常或已死亡的胚胎。通过轻轻旋转培养皿，将所有胚胎聚集至中央区域。</li>
	<li>用两根针逐个夹取胚胎，使其呈垂直方向（头朝下—尾朝上），将左侧针头置于尾部以保持尾部伸直。用右侧针头在脊索边缘处切断尾鳍，切割动作应一次完成。从切割完成到浸入细菌溶液的时间不得超过10分钟。</li>
</ol>
5. 感染受伤的胚胎
<ol>
	<li>在 II 级生物安全柜中，涡旋混匀后将浓度约为 1 × 107 CFU/mL 的 P. aeruginosa 溶液加入 6 孔板中。</li>
	<li>使用一次性巴斯德玻璃移液管收集受伤的胚胎，并在微生物安全操作台内将其加入细菌溶液中。于 28 °C 培养 1.5 小时。 
	注意：若需要大量感染的幼虫，可将幼虫分为每组约 50 条，依次进行造伤、浸入感染，然后重复处理下一组。</li>
	<li>感染后，在微生物安全操作台内按以下步骤清洗胚胎。
	<ol>
		<li>用玻璃移液管将胚胎转移至 10 mL 不含亚甲蓝的鱼水中进行第一次清洗，尽量减少带入的液体量，在室温下清洗 30 分钟。</li>
		<li>再次使用玻璃移液管将感染的胚胎转移至 4 mL 不含亚甲蓝的鱼水中，进行数分钟的第二次清洗。</li>
		<li>将 24 个感染的胚胎分别转移至多孔板中，每孔加入 1 mL 不含亚甲蓝的鱼水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板放入塑料盒中，置于 28 °C 培养箱内。通过湿润纸巾等方式保持盒内湿度，以减少蒸发。</li>
</ol>
6. 感染胚胎的存活情况
<ol>
	<li>进行胚胎存活率研究时，在感染后18小时、24小时和48小时（hpi）于体视显微镜下检查胚胎活力。当胚胎心脏停止跳动且血液循环终止时，判定为死亡。</li>
	<li>使用Kaplan-Meier阶梯图（GraphPad Prism 8.3.0）表示死亡率/存活率，并采用log-rank检验或其他适当的统计学方法进行数据分析。</li>
</ol>
7. 检测感染胚胎中的细菌载量（图1）
<ol>
	<li>在四个不同时间点对感染的胚胎进行CFU测定：感染后1.5小时（即感染后立即测定），以及每次清洗后的24、48和72小时，每个时间点使用5个胚胎。所有操作均需在微生物安全操作台内进行。</li>
	<li>为每只感染的幼虫准备含有95 µL 1× PBS的1.5 mL微量离心管。幼虫体积约为5 µL。</li>
	<li>将幼虫转移至含4 mL不含亚甲蓝的鱼水的6孔板中，进行清洗以去除浮游细菌。</li>
	<li>将每个胚胎放入含有PBS的微量离心管中，尽可能少地带入液体。仅需将含有幼虫的玻璃移液管轻轻接触PBS液面，使幼虫沉入微量离心管中而不带入多余液体。</li>
	<li>使用研杵在微量离心管壁上逐个研磨胚胎，研磨过程中保持研杵在管内。当观察不到完整胚胎时，即达到研磨终点。</li>
	<li>提起研杵，加入100 µL PBS-Triton 2%以冲洗研杵上残留的细菌（最终浓度为1%）。涡旋混匀后静置10分钟。每次处理的胚胎数量不得超过5个。</li>
	<li>对每个胚胎的未稀释裂解液，分别在LB琼脂平板上点样3次，每次10 µL。使用多通道移液器在96孔板中对裂解液进行系列稀释，直至达到10-3稀释度。在LB琼脂平板上，分别对10-1、10-2和10-3稀释液各点样3次，每次10 µL，紧邻未稀释样品点样，随后将平板在37 °C下过夜培养。</li>
	<li>在显微镜下计数各稀释度的荧光菌落，并计算每个感染胚胎的CFU数。</li>
</ol>
<img alt="显微镜感染时间线；损伤、感染、菌落形成单位分析、细菌存活率检测示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：评估细菌在斑马鱼胚胎中致病性与持续性的实验时间线。 缩写：CFU = 菌落形成单位，hpi = 感染后小时数。该图使用 BioRender.com 制作。本图已根据文献13进行修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
8. 针对持续性感染的治疗测试（图2）
<ol>
	<li>针对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株，配制浓度为最低抑菌浓度（MIC）40倍的抗生素溶液。实验前需确认所选抗生素浓度对斑马鱼胚胎无毒性。</li>
	<li>按照步骤7.1和7.2操作。在24孔板中每孔加入含抗生素的1 mL鱼水，并设置不含抗生素的对照组。</li>
	<li>将清洗步骤中每个处理组的五个胚胎转移至24孔板中，尽量减少携带的液体量。</li>
	<li>在室温下用抗生素孵育30分钟。然后返回步骤7.3，以定量分析处理后的细菌载量。</li>
</ol>
<img alt="细菌感染与定植的时间线，显示CFU测量值和抗生素治疗。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：用于评估抗生素治疗对感染胚胎疗效的实验流程。 缩写：ATB 30' = 抗生素处理30分钟，CFU = 菌落形成单位，hpi = 感染后小时数。该图由BioRender.com绘制。本图已根据文献13进行修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

建立细菌慢性感染模型 体内 对于理解发病机制和评估治疗效果至关重要。在此，我们建立了一种适用于药物筛选的斑马鱼持久性伤口感染模型 P. aeruginosa填补了当前方法学在该方面的空白 体内 适用于针对慢性细菌感染进行药物筛选的模型。值得注意的是，该模型模拟了慢性感染的一个重要特征，即适应性抗生素耐药性，从而可用于筛选优化的化合物或抗生素。这一持续性感染模型 P. aeruginosa 斑马鱼感染研究基于一种原始方法：（i）分析 P. aeruginosa 来自囊性纤维化患者分离的菌株，包括一株据报道可在小鼠中引发慢性肺炎的分离株14，（ii）感染后长时间段（3天）的分析，包括细菌载量计数，以及（iii）伤口感染模型。
我们描述了一种可重复且相对简单的方法，通过伤口愈合及细菌在水中的浸染，在斑马鱼胚胎中建立铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）持续感染模型。与哺乳动物模型相比，斑马鱼中的所有所述操作均遵循3R原则及欧盟动物...

<a href="https://app.jove.com/t/6639">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68464">10.3791/68464</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68464">Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

铜绿假单胞菌 是一种革兰氏阴性致病菌，可导致囊性纤维化（CF）患者及伤口部位的慢性定植1,2. P. aeruginosa 属于ESKAPEE病原体组，被世界卫生组织列为新疗法研发的最高优先级病原体3慢性细菌感染由于适应性耐药性的存在，难以通过抗生素进行有效治疗，这种耐药性与多种因素相关，包括生物膜生活方式、生长速率降低以及代谢活性下降。4以及细胞内生命周期5. 体内 模型对于更好地理解与治疗至关重要 P. aeruginosa 慢性感染
尽管已有多种体内模型用于评估P. aeruginosa的毒力，但极少模型能够模拟持续性定植并测试治疗手段对慢性感染的效果6。研究P. aeruginosa慢性致病机制的动物模型主要依赖将细菌包埋于琼脂珠中并接种至肺部7。此外，还建立了小鼠慢性皮肤感染模型8。斑马鱼（Danio rerio）具有多种优势（伦理问题较少、成本低、产卵量高），是一种具有吸引力的体内脊椎动物模型，适用于药物筛选，同时得益于胚胎的透明性，可实现对P. aeruginosa及宿主细胞的高分辨率实时观察9。
如一篇综述所述，在以往的研究中&#160;P. aeruginosa 实验室菌株（PAO1、PA14 和 PAK）主要应用于斑马鱼感染模型，可引起急性感染9我们近期开发了一种基于将尾鳍截断的胚胎浸入感染环境的伤口感染实验方案 P. aeruginosa PAO1菌株，可引起急性感染10通过浸泡感染已受伤的胚胎，该方法模拟了胚胎的自然感染模式 P. aeruginosa是一种可重复且比显微注射更简便的感染方式。
我们的目标是建立一种持久的方案 P. aeruginosa 斑马鱼感染。为此，我们的策略是使用 P. aeruginosa 临床菌株，在斑马鱼模型中极少被考虑11,12，结合伤口感染途径。在此，我们描述了一种已建立的实验方案，用于建立基于伤口感染的斑马鱼胚胎持续定植模型 P. aeruginosa CF 临床分离株。这种新型 体内 模型符合我们的预期，并为评估治疗手段在持续定植背景下的有效性提供了新的机会，如本文及配套文章所述。13.

<table><tbody><tr><td>甲基磺酸三卡因</td><td>Sigma</td><td>E50521</td><td></td></tr><tr><td>活塞压片</td><td>Eppendorf, Dutscher</td><td>33522</td><td></td></tr><tr><td>海水盐</td><td>Instant Ocean, Aquarium systems&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>218035</td><td></td></tr><tr><td>曲通</td><td>Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr></tbody></table>

在受伤的斑马鱼幼鱼中建立持续性pseudomonas aeruginosa感染模型

Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

Pseudomonas aeruginosa 是一种重要的人类病原菌，尤其在慢性伤口感染和慢性肺部感染中（特别是在囊性纤维化（CF）患者中）具有显著致病性。慢性细菌感染对抗生素治疗具有耐受性，因此迫切需要适用于药物筛选的 体内 慢性感染模型，以开发有效的治疗方案。本文介绍了一种利用来自 CF 患者的临床分离株 P. aeruginosa（该菌株组成型表达绿色荧光蛋白（GFP））在斑马鱼幼鱼中建立持续性伤口感染的实验方案。将尾鳍受伤的胚胎浸入细菌悬液中 1.5 小时，随后进行清洗，并持续监测 3 天内的细菌负荷量。通过计数裂解感染幼鱼后获得的荧光菌落形成单位（CFU），可每日定量检测细菌载量，从而实现&#160;持续性感染的建立&#160;。此外，持续存在的 P. aeruginosa 细菌对抗生素治疗表现出耐受性。这一新型的 体内 持续性 P. aeruginosa 感染模型为评估针对慢性感染的创新疗法的有效性提供了有力工具。

斑马鱼胚胎是监测持续性感染的合适模型 P. aeruginosa CF 分离株 
我们采用浸没损伤胚胎模式进行评估 体内 三种囊性纤维化分离株（A6520、B6513 和 C6490）的毒力9我们还评估了一株特征明确的晚期囊性纤维化分离株RP73的行为，该菌株以在小鼠气道中长期定植而闻名。14,15. 与参考菌株PAO1相比，所有四株CF分离株的毒力均显著减弱（图3A 和 图3B).
为了区分细菌的清除与持续存在，我们对每枚胚胎在3天内（最长至72 hpi）的细菌载量进行了定量分析。为了便于计数P. aeruginosa细菌，我们采用了携带染...

目前缺乏 体内 适用于慢性细菌感染药物筛选的模型。在此，我们描述了一种伤口感染的实验方案 铜绿假单胞菌 临床分离株在斑马鱼幼鱼中建立持续性感染。

在受伤的斑马鱼幼鱼中建立持续性Pseudomonas aeruginosa感染模型

铜绿假单胞菌是一种重要的人类病原体，尤其在慢性伤口感染和慢性肺部感染中（特别是在患有……的患者中）

由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）引起的慢性感染对抗生素具有耐受性，极难治疗。我们的目标是建立一种体内模型，以加速高效疗法的发现。抗菌药物的筛选主要在体外进行，而在慢性感染小鼠中测试药物则面临复杂的挑战。为了弥合这两种方法之间的差距，我们提出一种利用受伤斑马鱼幼鱼的替代性临床前模型。本研究建立的斑马鱼持续感染模型采用临床来源的铜绿假单胞菌菌株，能够再现抗生素耐受现象。相较于通常用于感染斑马鱼幼鱼的显微注射方法，我们的创伤感染方法更接近自然感染途径，且更适合用于治疗化合物的筛选。[旁白] 首先，将25号针头放置在两根筷子上，以便于操作。使用体视显微镜识别并移除发育异常或无活性的胚胎。通过环形移动培养皿，将剩余的胚胎聚集至中央。接着，使用两根垂直方向的针分别分离每个胚胎，将左侧的针置于尾部以保持胚胎身体平直。用右侧的针在脊索边缘进行单次切割，以去除尾鳍。每一切割操作应迅速完成，并确保所有胚胎在10分钟内均浸入细菌溶液中。在感染操作中，于二级生物安全柜内将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）溶液涡旋混匀，并将其以约1×10⁷ 菌落形成单位/毫升的浓度加入六孔板中。使用一次性玻璃巴斯德吸管收集受伤的胚胎，并将其转移至细菌溶液中。将六孔板置于28°C条件下孵育1.5小时。孵育结束后，取出感染的胚胎，并置于微生物安全柜中进行清洗。随后，用玻璃吸管将胚胎转移至10毫升不含亚甲蓝的鱼水中，尽量减少转移液体体积，并在室温下孵育30分钟。然后，再次用玻璃吸管将胚胎转移至4毫升不含亚甲蓝的鱼水中，短暂孵育。接下来，使用吸管将感染的胚胎逐个转移至24孔板中，每孔加入1毫升不含亚甲蓝的鱼水。将24孔板放入设定为28°C的培养箱中。为每个感染的幼鱼准备含有95微升1×PBS的1.5毫升微量离心管。将幼鱼转移至含有4毫升不含亚甲蓝鱼水的六孔板中，清洗以去除浮游细菌。将每个清洗后的胚胎放入含PBS的微量离心管中，尽可能少地带入液体。接着，使用研磨杵在微量离心管壁上碾碎每个胚胎，之后将研磨杵留在管内。然后提起研磨杵，并加入100微升2% PBS-Triton溶液，以冲洗研磨杵上残留的细菌，最终使Triton浓度为1%。涡旋混匀离心管并孵育10分钟。随后，从每个胚胎的未稀释裂解液中分别取三滴、每滴10微升，点样于LB琼脂平板上。使用多通道移液器在96孔板中对每份裂解液进行系列稀释，最高稀释至10⁻³。最后，在未稀释点样位置旁，分别点加三滴10微升的稀释液。于37°C过夜孵育。所有四种囊性纤维化来源的铜绿假单胞菌分离株在损伤胚胎模型中的毒力均显著低于PAO1参考菌株。在感染其中两种分离株的胚胎中，细菌载量在三天内明显下降，表明细菌被清除。相比之下，另外两种分离株B6513和RP73在感染后18至65小时期间，细菌载量在初始下降后维持相对稳定，提示其具有持续感染能力。在感染后1.5小时进行30分钟的妥布霉素短时处理，可显著降低B6513分离株感染胚胎中的细菌载量。然而，若在感染后24或48小时给予妥布霉素，则对细菌载量无显著影响，表明在持续感染阶段已产生耐药性。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

对受伤斑马鱼幼虫的持续性铜 绿假单胞 菌感染进行建模

透明的斑马鱼胚胎已被证明是研究先天免疫细胞与胞内细菌病原体（如Salmonella typhimurium和Mycobacterium...

斑马鱼胚胎感染细胞内细菌病原体

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斑马鱼幼鱼中播散性念珠菌病的非侵入性成像

本视频介绍了一种腹腔注射技术，该方法用于将溶液注入成年斑马鱼的腹腔内。...

腹腔注射：一种向成年斑马鱼腹腔内递送溶液的方法

来源： 卢克宁，H. 等 建立结核病模型 Mycobacterium marinum 感染的成年斑马鱼。 视频实验杂志 (2018).

利用斑马鱼模型评估宿主免疫在分枝杆菌感染中的作用

来源：Flores, E., et al．利用原生动物尾草履虫作为食物传播感染斑马鱼幼虫的载体．J. Vis. Exp. （2019）．本视频演示了通过喂食感染了荧光标记大肠杆菌（E.

利用食源性细菌建立斑马鱼幼鱼肠道感染模型

在现有的脊椎动物宿主中，病原体与免疫防御在黏膜水平上的体内时空相互作用难以进行成像。本文介绍了一种多功能平台，利用幼年斑马鱼的鱼鳔作为感染部位，用于在活体脊椎动物中研究黏膜念珠菌病。...

通过鱼鳔注射在斑马鱼幼虫中建立黏膜念珠菌病模型

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在感染Mycobacterium marinum的成年斑马鱼中建立结核病模型

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一种用于活体可视化及活体分析生物材料相关反应的斑马鱼胚胎模型 金黄色葡萄球菌 感染

我们描述了一种用于在免疫功能健全的小鼠中建立慢性伤口感染的延迟接种方案。...

一种慢性延迟接种模型 铜绿假单胞菌 伤口感染

本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中建立Aspergillus感染的模型。Aspergillus孢子被显微注射至幼鱼的后脑，通过化学处理诱导免疫抑制。利用每日成像系统监测感染进展，以观察真菌生长和免疫反应，并通过菌落形成单位平板法对存活孢子进行计数。...

斑马鱼幼虫感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子

了解利用受伤斑马鱼幼虫建立铜绿假单胞菌持续性感染模型的方法。该模型通过模拟自然感染过程，可用于高通量筛选抗菌药物并加速新型治疗方案的发现。

在受伤的斑马鱼幼鱼中建立持续性Pseudomonas aeruginosa感染模型

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