Name: 小鼠海马体中厚组织的冷冻电子断层扫描工作流程演示 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 了解小鼠海马体厚组织冷冻电子断层扫描的标准化工作流程。本方案整合高压冷冻、冷冻聚焦离子束切割及自动化数据采集，实现原位高分辨率细胞超微结构分析。

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作者感谢南方科技大学冷冻电镜中心工作人员提供的技术支持。本项目得到国家科技创新计划（脑科学与类脑智能技术——国家科技重大专项，项目编号：2022ZD0211905）和国家自然科学基金（项目编号：32200998 和 32161133022）的资助。

所有涉及动物组织的实验程序均符合南方科技大学动物护理与使用委员会（IACUC）的规定（方案编号 SUSTech‑JY202501019）。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 样品支撑物的制备
<ol>
	<li>高压冷冻载样器的制备（见图1A）
	<ol>
		<li>取一对6 mm铜制高压冷冻载样器（B型），确保其中一个载样器表面平整。</li>
		<li>将载样器的平整表面润湿后开始研磨。首先使用8000目砂纸，直至完全去除原始加工痕迹；然后换用12000目砂纸继续研磨，直至上一步骤产生的划痕基本消除，获得均匀光滑的表面。图2展示了研磨和抛光过程中载样器表面的典型图像。</li>
		<li>使用柔软的金相抛光布和W0.5金刚石抛光膏对研磨后的表面进行抛光：先将抛光膏涂于抛光布上，然后以圆周运动方式抛光表面1–2分钟，直至获得光滑且高度抛光的表面。随后用乙醇彻底冲洗载样器，再用蒸馏水冲洗，以去除所有磨料残留物。</li>
		<li>将抛光处理后的载样器在1-十六碳烯中浸泡至少4小时（或过夜），方可使用。 
		注意：抛光并处理后的载样器可长期保存在1-十六碳烯中。 
		警告：1-十六碳烯易燃，吸入有害；操作时应在通风橱内进行，并佩戴个人防护装备（PPE）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电镜支持膜网格的制备（见图1B）
	<ol>
		<li>使用100目铜网，表面覆有连续的Formvar/碳支持膜。</li>
		<li>采用溅射镀膜仪对网格两面进行金溅射镀膜：设定电流为50 mA，每面溅射120秒，使每侧形成约6 nm厚的金层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>铜箔的制备（见图1C）
	<ol>
		<li>获取厚度为1 µm的高纯度铜箔。 
		注意：铜的热导率随纯度变化，纯度越低，热导率越低。因此必须使用高纯度铜箔（Cu ≥ 99.9%）。</li>
		<li>使用圆形打孔器将铜箔冲压成直径为3 mm的圆片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高压冷冻
<ol>
	<li>在干净的玻璃表面放置一滴10 µL的10%蔗糖溶液。</li>
	<li>迅速从刚处死的小鼠中解剖出海马体。使用锋利的剃刀片切取约0.5–1 mm3大小的组织小块（见图1D）。</li>
	<li>用牙签或细刷将组织转移至HPF载具内的铜支持TEM载网（100目）上。使用2-methylpentane&#160;轻轻调整组织位置，同时尽量减少对载网的机械应力。 
	警告：2-Methylpentane极易燃。操作时应在无任何点火源的通风橱中进行。</li>
	<li>用直径为3 mm的铜箔片覆盖组织和载网。将第二个HPF载具（平面朝下）置于其上完成组装，形成密封的“华夫饼”三明治结构（见图1E）。 
	注意：铜箔在华夫饼结构中起关键的机械作用。它将组织夹在TEM载网与铜箔之间。在组装过程中，该结构施加轻微压力，有助于形成更薄且更均匀的组织切片，适合玻璃化。此外，铜箔可防止操作过程中组织丢失，并在高压冷冻时帮助分散压力，降低载网破裂的风险。冷冻后，铜箔也有助于更轻松地将载具与玻璃化的样品载网分离。然而，这种制备方法可能引入机械压缩损伤，不适用于对压力诱导伪影敏感的样品。对于此类样品，应考虑采用其他无需压缩即可获得合适厚度的切割技术，例如振动切片或打孔取样。</li>
	<li>立即按照制造商的操作规程启动高压冷冻程序。将目标压力设为约2100 bar，并确保从组织解剖到冷冻的总时间不超过90 s。 
	&#8203;注意：从解剖到冷冻的整个过程应在90&#160;s内完成，以尽量减少因长时间ex&#160;vivo导致的结构改变。脑组织的厚度范围约为20–40 µm。</li>
</ol>
3. 聚焦离子束铣削与拾取
注意：使用配备冷冻载台的双光束显微镜执行以下步骤。整个过程中须将样品温度维持在 -170 °C 以下。
<ol>
	<li>接收网格的制备
	<ol>
		<li>取一个新的300目金网格，作为提升操作的最终接收网格。</li>
		<li>在室温下使用体视显微镜，轻轻地将网格夹入兼容的冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）AutoGrid环中。</li>
		<li>将组装好的AutoGrid直接存放在维持在约40 °C的干燥烘箱中，以在使用前尽量减少霜的积聚。 
		注意：夹持时应确保网格平整且居中，以防止弯曲或错位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃化组织网格的取出与安装
	<ol>
		<li>在持续浸入液氮（LN₂）的条件下，小心地将含有组织和铜箔的玻璃化透射电镜（TEM）网格从周围的“华夫格”组件中分离出来。 
		注意：铜箔垫片通常使网格易于从载体上分离。</li>
		<li>在预冷的冷冻装载工作站上，在LN₂保护下将分离的组织网格装入第二个cryo-FIB AutoGrid环中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将网格共装载至冷冻转移穿梭器
	<ol>
		<li>将两个AutoGrid装入冷冻转移穿梭器的指定插槽中。</li>
		<li>调整每个AutoGrid的方向，使铣削缺口朝外并保持垂直。</li>
		<li>在转移至FIB/SEM显微镜前，保持装载好的穿梭器浸没于LN₂中或处于预冷状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FIB/SEM中的定位与导电涂层
	<ol>
		<li>冷冻转移至显微镜后，使用低倍SEM放大倍数导航至组织网格。</li>
		<li>对整个网格表面施加导电且具有保护作用的涂层。
		<ol>
			<li>以30 mA电流对网格表面溅射镀铂（Pt）15秒。</li>
			<li>使用气体注入系统（GIS）沉积一层0.5–1.0 µm厚的有机金属Pt帽。</li>
			<li>再次以30 mA电流对网格表面进行最终的溅射镀Pt，持续15秒。 
			注意：GIS帽对于减少帘状伪影至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织块的分离与提升（见图3）
	<ol>
		<li>位点选择与取向
		<ol>
			<li>使用SEM电子束图像在组织网格上导航至选定的兴趣区域（ROI）。</li>
			<li>将样品取向设为正面铣削。典型的样品台位置设定为110°旋转和7°倾斜，此位置使样品表面呈合适角度以便离子束进入。 
			注意：若无荧光标记，可采用预筛选策略。&#160;该策略旨在定位目标组织区域，并排除含有冷冻保护剂或其他非组织成分的区域。在选择一个表面无明显冰层的区域后，使用较高束流（例如30 kV下15 nA）在标准正面取向下铣出一个小的测试沟槽，并使用较低束流（例如30 kV下1 nA）进行抛光。切换至电子束观察截面：组织在电子束下表现出优异的对比度，这一特征在膜结构及富含重元素的区域尤为明显；相比之下，冷冻保护剂在电子束下通常呈现均匀的对比度。这可在进行完整提升操作前实现快速验证。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>沟槽铣削以分离组织块（图3A）
		<ol>
			<li>使用30 kV工作的离子束定义围绕目标组织块的矩形沟槽。</li>
			<li>从距离组织块一定距离处开始铣削，使用相对较高的15 nA电流以实现快速材料去除。</li>
			<li>当沟槽壁接近组织块至几微米范围内时，将离子束电流降低至7 nA。降低电流可实现更精确的控制，并最小化离子束对目标区域生物材料的损伤和加热。</li>
			<li>保留组织块一侧与主体材料相连，作为“标签”以暂时固定其位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>针对较厚组织块的可选底切铣削（图3B）
		<ol>
			<li>对于估计厚度大于20 µm的组织块，从背面执行底切铣削步骤，以利于最终的提升操作。</li>
			<li>旋转样品台（例如至-70°），并调整样品台倾斜角度（例如至23°），以接触组织块底部。</li>
			<li>使用聚焦离子束（FIB）在30 kV和3 nA电流下铣削底部连接部分。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>与微操纵针的连接（图3C）
		<ol>
			<li>为将样品连接至微操纵针，执行连续的截面铣削模式。 
			注意：金块可从300目金网格的横条中提取。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>组织块的提升（图3D）
		<ol>
			<li>使用FIB（30 kV，1 nA）切断连接组织块与主体样品的剩余“标签”。</li>
			<li>小心操控微操纵针，将已分离的组织块提起，使其完全脱离沟槽及周围原始网格。然后回撤针头，将组织块转移至接收网格。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>组织块转移、焊接与重新镀层
		<ol>
			<li>将微操纵针移至预冷的300目金接收网格。</li>
			<li>将组织块降低至选定的网格方格上。使组织块与网格上的薄膜接触，然后垂直提起组织块以断开接触。使用离子束（30 kV，1 nA）在网格薄膜上从组织块铣削约3–4 µm厚的薄片（图3E）。 
			注意：若存在冰屑，应使用矩形模式（30 kV，50 pA）预先清洁附着位点。确保组织块与网格薄膜接触，以减少静电荷，防止薄片随机位移。</li>
			<li>通过在连接处两侧使用清洁截面模式进行铣削，牢固焊接薄片（30 kV，30 pA）（图3F）。</li>
			<li>按照步骤3.4.2所述重新施加导电/保护涂层（图3G）。 
			注意：对于此GIS镀层步骤，可根据组织块大小适当缩短镀层时间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>薄片减薄
		<ol>
			<li>旋转样品台（例如至-70°），并设定初始样品台倾斜角度（例如15°）（图3H）。 
			注意：样品 holder 具有45°的预倾斜角度。</li>
			<li>在组织块的平滑区域内定义最终薄片的位置。 
			注意：确认所选区域无冰污染。</li>
			<li>使用表1中指定的离子束电流进行系统性铣削。&#160;随着接近目标平面，逐步从高电流过渡到低电流（图3I、J）。可选地，当距离薄片1–2 µm时，可在约1.5 µm远处铣削一个应力释放沟槽，以防止薄片弯曲或卷曲30,31。 
			&#8203;注意：当剩余材料距离目标平面约1 µm时，应限制每次通过所去除的厚度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 冷冻电子断层扫描数据采集
<ol>
	<li>成功制备薄片后，小心地将载网装入配备有冷冻样品台、能量过滤器和断层扫描软件（例如 SerialEM）的透射电子显微镜（TEM）中。</li>
	<li>获取整个载网的图谱地图（例如 图4A；典型放大倍数为155×）。</li>
	<li>导航至薄片区位置，并获取拼接图（例如 图4B；典型放大倍数为3600×，欠焦量为-100 µm）。</li>
	<li>设定标称记录放大倍数，并确认像素尺寸适合目标分辨率；在本研究中，采用的像素尺寸为2.109 Å。调整相应的照明参数，包括光斑尺寸、C2光阑直径和照明区域，以实现直接电子探测器的最佳剂量率。</li>
	<li>配置对焦和试照条件，使其与“记录”参数设定一致。</li>
	<li>使用PaceTomo脚本32进行数据采集，步骤如下：
	<ol>
		<li>在导航器中使用&#34;添加点&#34;功能在拼接图上预先选择目标区域，确保第一个特征具有足够的对比度。</li>
		<li>使用PACEtomo_selectTargets.py脚本32选择目标区域，必要时可在预览放大倍数下调整感兴趣区域。典型的感兴趣区域如&#160;图4C所示。</li>
		<li>采用剂量对称倾斜方案（例如0°, +3°, -3°, +6°, -6°... 至±60°–66°）进行倾斜系列图像采集，倾斜增量为2°或3°。在PACEtomo.py脚本中设置采集参数：起始倾斜角度由步骤3.7.1中指定的铣削角度（即8°）决定，其正负号取决于冷冻电镜中样品的装载方向；最小和最大倾斜角度指绝对值；步长对应倾斜增量（例如3°）。 
		注：该起始倾斜角度的设计目的是使薄片处于水平状态且垂直于电子束。若铣削角度未知，可倾斜图像以使薄片呈现最大表观高度；此方法可提供足够精确的对齐。</li>
		<li>在整个倾斜过程中保持累积电子剂量为100–150 e⁻/Å2&#160;。如有条件，使用狭缝宽度为10 eV的能量过滤器。</li>
		<li>启动数据采集。在每个倾斜角度下自动执行对焦和追踪。单个倾斜系列的典型采集时间为5–8分钟。 
		注：故障排除指南见表2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据处理
<ol>
	<li>使用 AreTomo 3 对倾斜系列图像进行运动校正、CTF 估计、对齐及三维断层重建33&#160;执行三个核心步骤：（1）对原始图像帧进行运动校正，（2）估计每幅倾转图像的对比度传递函数（CTF），以及（3）对完整的倾转系列图像进行对齐。
	<ol>
		<li>对齐后重建三维（3D）断层图像 通过 加权反投影算法&#160;此步骤所需的输入包括：原始图像帧、mdoc元数据文件（记录倾转系列采集参数）以及预先确定的样品旋转轴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缺失楔形校正
	<ol>
		<li>重建后，使用 IsoNet 对生成的断层图进行缺失楔形校正34.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颗粒挑选与筛选
	<ol>
		<li>在 EMAN 2.9 中进行颗粒挑选35 使用模板匹配方法。&#160;自动挑选后，手动剔除假阳性结果（即非目标区域或错误选择的区域），以确保所选颗粒数据集的质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子断层图平均法
	<ol>
		<li>将倾转系列及其对应的粒子坐标导入 RELION 4.0。按照 RELION 4.0 文档中所述的标准流程进行子断层平均化。&#160;（https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html），以确保遵循可重复性方面的既定最佳实践。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Engel, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+architecture+of+the+Chlamydomonas+chloroplast+revealed+by+in+situ+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography.</a> Elife. 4, e04889(2015).</li>
<li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+frozen-hydrated%2C+vitreous+lamellas+from+cells+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).</li>
<li>Rubino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+focused-ion-beam+lift-out+method+for+cryo+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).</li>
<li>Schiøtz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+lift-out%3A+Sampling+the+molecular+anatomy+of+whole+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms.</a> Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).</li>
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<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+procedure+for+an+optimized+serial+lift-out+cryo-focused+ion+beam+milling+technique+in+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis.</a> Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).</li>
<li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3A+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+fib-milled+cryo-lamellae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae.</a> J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).</li>
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<li>Peck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aretomolive%3A+Automated+reconstruction+of+comprehensively-corrected+and+denoised+cryo-electron+tomograms+in+real-time+and+at+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Preprint.+bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput.</a> Preprint. bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Liu, Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotropic+reconstruction+for+electron+tomography+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning.</a> Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+data+processing+workflow+for+cryo-ET+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging.</a> Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reduction+of+fib+damage+on+cryo-lamella+by+lowering+energy+of+ion+beam+revealed+by+a+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis.</a> Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).</li>
<li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).</li>
<li>Boltje, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryogenic%2C+coincident+fluorescence%2C+electron%2C+and+ion+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope.</a> Elife. 11, e82891(2022).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+microscopy+%28IFLM%29+for+cryo-fib-milling+and+in-situ+cryo-ET%5BTitle%5D)+AND+%22Preprint.+bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET.</a> Preprint. bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eli+trifocal+microscope%3A+A+precise+system+to+prepare+target+cryo-lamellae+for+in+situ+cryo-ET+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study.</a> Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).</li>
<li>Medeiros, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+workflow+and+instrumentation+for+cryo-focused+ion+beam+milling+of+samples+for+electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography.</a> Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).</li>
<li>Goetz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+automated+cryo-fib+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A modular platform for automated cryo-fib workflows.</a> Elife. 10, e70506(2021).</li>
<li>Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+parallel+automated+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart parallel automated cryo-electron tomography.</a> Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).</li>
<li>Swulius, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+segmentation+of+cryo-electron+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms.</a> J Vis Exp. (189), e64435(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的工作流程建立了一种通用、优化且可重复的管道 原位 冷冻电子断层扫描技术用于原位厚组织的研究。其主要贡献并不在于发明单一的新技术，而在于对整个流程进行系统性的整合、优化和详细标准化，从采用改良的华夫饼式高压冷冻法实现稳定玻璃化，到精确校准的冷冻聚焦离子束提取与减薄方案。这一整合策略解决了在复杂组织中应用冷冻电子断层扫描时常遇到的关键性可重复性与可及性难题。
关键步骤与方案优化 
多项集成优化对于工作流程的成功与可靠性至关重要。首先，改进的高压冷冻“华夫格”法是基础，其关键改进在于：在冷冻前使用两个抛光的铜载片对组织进行物理压缩，从而预先减薄样品。组织被支撑在带膜载网上，并在其上方覆盖一层铜箔以固定样品并防止丢失。该设计不仅促进了快速且均匀的玻璃化冷冻，还显著增强了机械稳定性，有效防止在后续操作中载网破裂和样品丢失，为获得完整、高质量的冷冻组织样本奠定了坚实基础。其次，冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）样品提取策略需通过一系列校准步骤执行。标准导电涂层方案（溅射铂/气体注入系统铂/溅射铂三层结构）对于电荷耗散至关重...

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为在天然水合状态下观察大分子复合物和细胞结构的关键技术1,2,3,4,5通过从投影图像的倾斜序列中重建三维体积，冷冻电子断层扫描技术在细胞环境背景与近原子分辨率之间架起了桥梁，为结构生物学提供了前所未有的洞察。 原位6. 尽管冷冻电子断层扫描技术在细胞样本中的工作流程7 （包括悬浮细胞和贴壁细胞的冷冻聚焦离子束减薄样品）现已得到广泛应用，但将其直接拓展至厚实且结构完整的组织仍极具挑战性8,9,10这一点对于脑等高含水量组织尤为明显11，其中可靠的玻璃化冷冻及制备电子透明薄片（通常 &#60;200&#160;nm）仍然是持续存在的瓶颈12.
由于组织含水量高且热传导受限，实现组织的玻璃化冷冻具有挑战性。虽然浸入式冷冻对较薄的样品（≤20 µm）有效13，但对于大多数组织而言，该方法会失效。高压冷冻（HPF）通过施加高压抑制冰晶成核，理论上可实现厚度达约200 µm的样品玻璃化。然而，传统HPF在组织玻璃化方面的效率通常不理想。为了改善效果，近期研究采用了添加冷冻保护剂等策略14 并进行切片前处理15,16 （例如，使用振动切片机）在冷冻前通过机械方式降低样品厚度11,17尽管这些方法能够提高玻璃化冷冻的质量，但通常需要较长时间 离体 处理和使用可能改变天然结构的化学添加剂。为解决这些局限性，本研究对Kelley等人最初开发的“华夫格”载体策略进行了改进。18 通过引入一项关键优化：在冷冻前使用两个抛光的铜载片对脑组织进行物理压缩，从而在将样品固定于载有薄膜的载网与铜箔之间的过程中预先将其压薄。该设计不仅促进了快速且均匀的玻璃化冷冻，还显著增强了机械稳定性，从而有效防止后续操作中载网破裂和样品丢失，为获得完整且高质量的冷冻组织样本建立了可靠基础。
玻璃化冷冻后，样品变薄仍然是影响通量和质量的主要障碍。作为一种早期且被广泛采用的技术，冷冻超薄切片法（cryo-ultramicrotomy）推动了大量原位（in situ）结构研究的开展。然而，该方法常引入压缩和切削伪影19,20，从而破坏结构的完整性。相比之下，冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削技术21具有更高的精度和更小的形变7,22。最初，cryo-FIB 铣削被直接应用于载网上玻璃化样品以制备薄片（lamellae）23；然而，这种&#160;in situ&#160;方法主要适用于较薄的样品24,25（例如培养的细胞或外周组织区域），无法获取厚而大块组织内部的深层结构。为克服这一深度限制，研究人员开发了提取转移（lift-out）策略26，实现了从样品内部特异性地提取感兴趣区域（ROIs）。随后的方法学进展，包括连续提取（serial lift-out）27和载网上序列化切片（SOLIST）28，进一步提高了复杂组织中三维关联定位的通量、薄片稳定性和精确性。近年来，该领域持续取得创新进展，例如 Tang 等人提出的六面固定法29，可在提取和减薄过程中增强机械稳定性；以及 Benjamin C. Creekmore 等人开发的新型载网内铣削方法11，可在保留天然组织环境的同时实现对深层结构的访问。尽管取得了这些进展，现有方案在不同组织类型间的效率、可重复性和适应性方面仍存在差异。目前仍存在一个关键空白：尚未建立一种标准化、易于复制且广泛适用的工作流程，将上述优化整合为一个连贯的、适用于多种厚组织的处理管线。
本研究通过整合已有方法中的关键技术细节，并将其优化为通用的端到端流程，弥补了这一空白。该方案不仅采用改进的高压冷冻-华夫格（HPF-waffle）方法实现稳定的玻璃态冷冻，还结合了一系列优化的冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）拾取与减薄步骤，包括系统性的过倾补偿、标准化导电镀层以及校准的铣削序列，从而整体上提高薄片的均匀性，减少伪影（如帘状伪影），并提升处理通量。与针对特定细胞类型或模式生物的方案不同，本工作流程以通用性为核心设计，提供了一个可灵活适应多种厚而复杂的组织（包括相对柔软且易受压缩的组织）的通用框架，其适用范围超越了本文所展示的小鼠海马组织。
在小鼠海马体这一具有挑战性的模型中进行了验证，该模型以易受冰损伤和结构复杂著称。本整合且通用的工作流程可稳定制备高质量的薄片（120–200 nm），并支持高效的倾转系列图像采集（每系列5–8分钟）。通过将最佳实践整合为一个连贯、易于获取且广泛适用的实验方案，本方法为在多种生物学和生物医学研究背景下开展厚组织冷冻电子断层扫描技术提供了可重复的框架，显著降低了该技术的应用门槛。

<table><tbody><tr><td>1-十六碳烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2131</td><td>化学试剂 &amp;试剂与耗材</td></tr><tr><td>2-甲基戊烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M65807</td><td>化学试剂 &amp;和试剂</td></tr><tr><td>夹环</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1131750;1188953</td><td>耗材</td></tr><tr><td>铜箔</td><td>冯成金属材料</td><td>1 &amp;micro;m 厚度</td><td>耗材</td></tr><tr><td>铜支撑透射电镜载网（100目）</td><td>北京中精科仪技术有限公司</td><td>BZ10021b</td><td>耗材</td></tr><tr><td>冷冻电镜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Krios G4</td><td>设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻聚焦离子束</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Aquilos 2</td><td>设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻聚焦离子束自动网格</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1205101</td><td>耗材</td></tr><tr><td>载网（UltrAufoil R 1.2/1.3 300 目）</td><td>Quantifoil</td><td>AltrAufoil</td><td>耗材</td></tr><tr><td>高压冷冻仪</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM ICE</td><td>设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高压冷冻载网，铜</td><td>Leica Microsystems</td><td>B型（6 mm）</td><td>耗材</td></tr><tr><td>离子溅射镀膜仪</td><td>Quorum</td><td>Q150RS plus</td><td>设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>金相抛光膏</td><td>Lab-testec</td><td>W0.5</td><td>耗材</td></tr><tr><td>抛光布</td><td>GORAL</td><td>B00809</td><td>耗材</td></tr><tr><td>砂纸</td><td>Eagle Brand 砂纸</td><td>8000目，12000目</td><td>耗材</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>S9i</td><td>&lt;a 名称=&quot;RANGE!D17&quot;&gt;设备&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200-334-9</td><td>化学品 &amp;试剂与耗材</td></tr><tr><td>倾转系列采集软件</td><td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td><td>SerialEM 4.0.9</td><td>软件</td></tr><tr><td>倾转系列图像对齐 &amp;与重建软件</td><td>https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3&amp;nbsp;</td><td>AreTomo 3</td><td>软件</td></tr><tr><td>倾转系列采集软件</td><td>https://github.com/eisfabian/PACEtomo</td><td>PaceTomo</td><td>软件</td></tr><tr><td>倾转系列图像对齐 &amp;和重建软件</td><td>https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet</td><td>IsoNet</td><td>软件</td></tr><tr><td>倾转系列图像对齐 &amp;与重建软件</td><td>https://github.com/cryoem/eman2</td><td>EMAN2</td><td>软件</td></tr><tr><td>倾转系列图像对齐 &amp;和重建软件</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html</td><td>Relion 4</td><td>软件</td></tr></tbody></table>

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

Cryo-Electron Tomography Workflow for Thick Tissues Demonstrated in Mouse Hippocampus

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）可实现对天然细胞超微结构的三维可视化，但其在厚组织中的应用受限于缺乏可靠的玻璃化冷冻技术以及低通量的薄片制备方法。本文介绍了一种端到端的工作流程，该流程结合了高压冷冻（HPF；~2100 bar；从组织分离到冷冻时间≤90 s），采用带有铜箔的“华夫格”组装方式对组织进行预减薄，随后进行冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）取出及具有倾角补偿的可控减薄，获得厚度为120–200 nm的薄片。导电镀膜过程实现标准化（溅射铂，30 mA/15 s；气体注入系统帽层0.5–1.0 µm），以最小化帘幕效应。采用自动化、剂量对称的数据采集方式（0°, ±3°, ±6°…至±60–66°；步长2–3°；总剂量100–150 e⁻/Å²），结合基于深度学习的运动校正与对齐、相位板成像、300 keV冷冻透射电镜以及相位翻转加权，显著提升了信噪比。在人类胰岛中，该方法揭示了完整β细胞内微管的极性、突触样囊泡对接以及线粒体嵴的异质性。在小鼠大脑皮层中，观察到轴突中微管数量的梯度变化、突触前末端中与突触囊泡聚集相关的致密突起，以及少突胶质细胞突起内髓鞘的周期性结构。该工作流程支持在接近生理状态下对厚组织中细胞器与大分子复合物进行高分辨率三维分析。 
关键词：冷冻电子断层扫描，高压冷冻，冷冻聚焦离子束，薄片制备，导电镀膜，剂量对称采集，深度学习，相位板，300 keV冷冻透射电镜，相位翻转加权，微管极性，突触样囊泡对接，线粒体嵴，髓鞘周期性结构，人类胰岛，小鼠大脑皮层2) 被实施 通过 PACEtomo 脚本，起始倾转角度由铣削角度和样品取向确定。使用 AreTomo 3 进行处理，可实现近实时的运动校正、CTF 估计、对齐和加权反投影（WBP）重构；IsoNet 可选择性地用于减少缺失楔形各向异性。子层析平均（RELION 4.0）采用伪子层析图策略，分辨率报告基于 0.143 的 FSC 截断值。该流程已在小鼠海马组织上得到验证，常规可获得良好玻璃化的样品和均一的薄片（目标厚度 150 ± 40 nm），并实现高通量倾转系列采集（通常每倾转系列 5–8 分钟）。本方案为研究提供了可重复的途径 原位 直接从复杂的组织环境中研究结构生物学。

成功应用本方案可制备高质量的玻璃化组织薄片，并进一步重建出揭示天然细胞超微结构的断层图像。以下结果均使用小鼠海马组织展示，代表了一次成功的实验。
采用高压冷冻“华夫饼”法处理的组织块呈现出均匀且电子透明的外观（图4B、C）。完全玻璃化的样品未显示出与结晶冰相关的衍射衬度。从倾斜系列图像获得的功率谱呈现出弥散的分布特征，未见尖锐的六边形衍射环，表明无冰晶形成，证实细胞内的水成功保存为玻璃态，这对于高分辨率成像分析至关重要。尽管实验方案已优化，厚组织样本的完全玻璃化仍是技术上的挑战。在评估的四个组织块中，有一个样本内部出现局部冰晶形成；相比之下，接触表面的玻璃化效果始终更为理想。因此，组织操作和冷冻保护剂的应用仍需进一步实践，并需要开展更多的筛选工作。
后续的冷冻聚焦离子束铣削可从玻璃化组织块中稳定地制备薄片。该工作流程表现出一致的通量，每次标准的12小时制备周期平均可获得8 ± 2个可用薄片。薄片质量通过以下方面进行评估 通过<...

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位 小鼠海马体中的分析。

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）能够实现天然状态下细胞超微结构的三维可视化，但其在较厚组织中的应用受到限制……

我的研究重点是建立标准化的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程，以实现对小鼠海马体等厚组织的原位结构分析。现有方法在厚组织分析上缺乏可靠性，因此本方案整合了经过优化的步骤，以实现标准化分析。首先，在洁净的玻璃表面滴加10 µL的10%蔗糖溶液。迅速从刚处死的小鼠中解剖出海马组织。使用锋利的剃须刀片，切取大小为0.5至1立方毫米的小块组织。用牙签或细刷将组织转移至高压冷冻载具内已准备好的铜支持透射电镜载网上。使用2-甲基戊烷保持组织湿润，并调整其在网格上的位置，同时尽量减少机械应力以避免网格损伤。随后，用直径为3毫米的铜箔片覆盖组织和网格。为完成组装，将第二个高压冷冻载样器平整面朝下放置在上方，形成密封的华夫三明治结构。检查冷冻参数，确保仪器无异常。从组织分离到冷冻的总时间不得超过90秒。取一个新的300目金网格，作为提取操作的最终接收网格。在室温下，使用体视显微镜小心地将载网夹入兼容的冷冻聚焦离子束 AutoGrid 载网环中。然后将组装好的 AutoGrid 直接存放在保持约 40 摄氏度的干燥烘箱中，以在使用前尽量减少结霜。在持续浸入液氮的同时，小心地将玻璃态化的透射电镜载网从周围的华夫格组件中分离出来。使用预冷的细头镊子，轻轻将两个高压冷冻载具分开。接着，在预冷的冷冻装载工作台上，于液氮保护下将分离的组织载网安装到第二个冷冻聚焦离子束 AutoGrid 圆环中。将两个 AutoGrid 装入冷冻转移 Shuttle 样品 holder 的指定插槽中。将每个自动网格（AutoGrid）按铣削缺口朝外且垂直放置，以实现较低的铣削角度。在转移至聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）前，始终保持装载完毕的样品架浸没于液氮中或处于预冷却状态。使用样品杆将样品台装入仪器中。将冷冻样品转移至显微镜后，先在低倍扫描电镜（SEM）下找到组织网格位置。随后以30毫安电流对网格表面溅射镀铂15秒，以提供导电保护。再使用气体注入系统沉积一层厚度为0.5至1.0微米的有机金属铂帽，持续约60秒。以30毫安电流对载网表面进行最终的溅射镀铂处理，持续15秒。利用扫描电镜（SEM）电子束成像，导航至组织载网上的目标区域。为进行正面铣削，将样品台调整至约110度旋转和7度倾斜，使样品表面呈适合离子束加工的角度。进行沟槽铣削时，使用30千伏电压下的离子束定义一个围绕目标组织块的矩形沟槽。从距离组织块一定位置处开始铣削，采用15纳安的相对较高电流，以实现快速去除材料。当沟槽侧壁接近组织块至几微米范围内时，将离子束电流降低至7纳安，以获得更精确的铣削控制。保留一侧的样品块与主体材料相连，以形成临时固定标签。对于估计厚度超过 20 微米的组织块，需从背面进行 undercut 铣削步骤，以利于最终的提取。旋转样品台并调整倾角，以便接触样品块的底部。使用聚焦离子束在30千伏和3纳安电流下铣削底部连接面。铣削金属块的底部，使其与样品块紧密贴合。精密铣削样品与金块之间的接触面，以使接触更加紧密。将样品与探针连接时，确保金块与目标样品直接接触。使用聚焦离子束在30千伏和0.5纳安条件下，在界面处进行8至12次连续的横截面铣削图案，以将金块焊接至样品。为取出组织块，使用聚焦离子束切断连接该块与主体样品的剩余连接部分。小心操作显微操作针，将分离的组织块完全提起，使其脱离沟槽及周围网格。收回操作针，将组织块转移至接收网格。将显微操作针移至预先冷却的300目金质接收网格。将组织块放置在选定的网格方格上。铣去网格上的微小冰晶，使组织块与网格更紧密地贴合。降低组织块，使其刚好接触网格。使用离子束将块状样品上3至4微米厚的切片铣削至载网膜上。接着，通过在连接处两侧采用清洁截面模式进行铣削，牢固地焊接该切片，并如前所述重新在载网表面施加导电层和保护涂层。进行薄片减薄时，在设定好样品台倾角后，应在组织块的平整区域内确定薄片的最终位置。根据所提供的表格中指定的离子束电流和过倾补偿，进行系统性铣削。当接近薄片约1至2微米时，可选择在距离薄片约1.5微米处铣削一条应力释放槽，以防止薄片弯曲或卷曲。完成薄片制备后，使用冷冻电子显微镜采集图像。采用高压冷冻华夫法处理的组织块呈现出均匀且透射电子良好的外观。重建的断层图像清晰解析了细胞环境中的线粒体结构。细胞质中的大分子复合物（如核糖体）也得以清晰分辨。在重建的断层图像中，也可观察到细胞骨架和膜相关的细胞特征以及核孔复合体。突触结构及特征，包括钙储存结构和髓鞘结构，在断层图像中清晰可见。该方案使研究人员能够在复杂的组织环境中直接研究细胞天然的外层结构。本冷冻电子断层扫描实验方案中最关键的挑战是实现厚组织样本均匀且无伪影的玻璃化冷冻。按照本方案操作后，研究人员可利用相关光镜与电镜技术或标记技术定位感兴趣区域，进而进行亚断层平均化及结构分析，以解析大分子复合物的结构。

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