用于可视化神经突在冷冻水合状态下使用低温电子断层扫描准备初级神经元

以保留神经流程超微结构分析，我们描述了一种协议，用于在电子显微镜网格后用快速冷冻原代神经元的电镀，得到的样品悬浮在一层玻璃的冰。这些样本可以检查与一个低温电子显微镜可视化结构在纳米尺度。

该程序的总体目标是以使其神经元适合通过冷冻电子显微镜可视化的方式培养原代大鼠神经元。这是通过首先准备带有 EM 网格的培养皿来铺板初级神经元来实现的。第二步是在 EM 网格上准备和接种初级神经元。

接下来，在 EM 网格上进行神经元的玻璃化。最后一步是通过冷冻电子显微镜收集图像，然后进行后处理和注释。最终，冷冻电子显微镜和断层扫描用于显示冷冻水合状态下神经突的超微结构。

与现有方法相比，该技术的主要优点是它可以用于纳米分辨率的冷冻水合神经突的 3D 可视化，而无需使用化学固定剂。因此，有助于评估更接近原生状态的形态特征。通过检查金 EM 网格上圣碳的完整性来开始此过程。

使用放大至少 25 倍的光学显微镜，确保碳孔完整大于 98%。为了电镀原代神经元，使用本生灯对 EM 网格进行火焰消毒，同时使它们具有亲水性。立即将网格与碳面向上转移到玻璃的中心。

底培养皿，每个培养皿放置一个 EM 网格，并且仅使用预先消毒的玻璃底培养皿。然后使用光学显微镜检查网格完整性，同时仍将 EM 网格保持在组织培养罩中的玻璃底培养皿内，将 250 微升适当的涂层物质涂抹在培养皿的中央玻璃区域。缓慢而小心地确保适当的涂层物质覆盖整个 E EM 网格。

然后，用盖子盖住培养皿，并在室温下孵育标本 1 小时。接下来，用连接到通风橱中真空管的无菌移液器吸头从培养皿中吸出所有多元醇赖氨酸混合物。避免直接接触 E EM 网格。

随后，使用可调节空气置换移液器小心地施加 250 微升无菌 PBS，以完全覆盖每个培养皿中央玻璃区域的 EM 网格。然后从每个培养皿中吸出 PBS。之后重复该过程 3 次。

让带有 EM 网格的培养皿在组织培养罩中干燥 15 分钟。在光学显微镜下检查。确保它们完全干燥并且网格中没有水分气泡。

否则，在 EM 网格旁边小心吸出以消除这些额外的水分，应立即使用涂层网格来电镀神经元。在此过程中，计算每个培养皿的适当细胞体积，以达到每个培养皿每毫升 50， 000 个细胞的浓度。最大施用量应为 250 微升，以仅填充中央玻璃区域，而不是整个培养皿。

接下来，将培养皿在 37 摄氏度的 CO2 培养箱中孵育 30 分钟，让细胞在 30 分钟后恢复和粘附，向每个培养皿中缓慢加入 1.5 毫升加热的细胞培养基，避免接触海马神经元的 EM 网格。第二天更换介质，然后每两天更换一半的介质，持续 14 天。在此过程中，准备在低温下冷冻和储存金 EM 网格的设备和所有材料，其中包括带湿度室的玻璃化装置、无钙滤纸、一对长平尖镊子、一对用于玻璃化机的细尖专用镊子、液氮作器， 一个冷却液容器和 EM 网格存储箱。

接下来打开玻璃化装置。将湿度设置为 100%，温度设置为 32 摄氏度。在 option 部分中，将区块时间设置为 0 秒。

这允许通过湿度箱的侧窗进行手动吸墨。然后叠放三张无钙滤纸。将纸叠切成 0.5 厘米宽的条带，长约 2 厘米，然后将它们弯曲 90 度角，使纸张的一部分为 0.5 厘米 x 0.5 厘米。

该部分将用于印迹标本。取出中间纸，将其放在另一张无钙滤纸上直至使用。接下来，使用专门的玻璃化镊子小心地从盘子中挑选 EM 网格。

请注意神经元生长的 EM 网格一侧，因为该位置对下一步很重要。然后使用镊子上的黑色滑动锁将镊子牢固地锁定在 EM 网格上。现在将镊子插入玻璃化机中，使神经元粘附的 EM 网格的一侧朝向左，远离玻璃化机侧面的圆形开口孔。

然后将固定 EM 网格的镊子缩回玻璃化机中。然后，使用玻璃化机的适当筛网命令，将装满足够 LN 二和液态乙烷的冷却剂容器放入玻璃化机的适当支架中。向上抬起冷却液室，直到它用平尖镊子与湿度室底部齐平。

抓住滤纸的一侧边缘，使较短的一侧垂直于镊子。该表面将与 EM 网格直接接触以进行印迹。现在，小心地将滤纸稳定地插入湿度室的侧孔中 将滤纸靠在 EM 网格上 10 秒钟，丢弃滤纸并立即浸入。

使用玻璃化机的自动化功能将样品冷冻在液态乙烷中。之后，小心地将冷冻的水合 EM 网格转移到网格存储中的一个插槽中。这是 EM 网格中心区域的光学显微镜图像，放大 10 倍，大鼠原代神经元已经生长了两周。

这是观察神经元及其神经突投射的浅绿色框的放大视图。这是以 4K 放大倍率从神经元体向外突出的神经突的电子显微照片。蓝色框在这里是近距离观察的，在 20 K 放大倍率下，神经突内部特征清晰可见。

该视频显示了来自大鼠海马神经元原代培养物的神经突的 3D 重建显微照片堆栈。它使用断层扫描对其进行成像，然后进行相应的 3D 颜色注释。这是另一个视频，显示了使用冷冻电子断层扫描收集的大鼠背根神经节轴突的 3D 重建图像堆栈，然后是相应的 3D 颜色注释，此处显示的是以 20 K 放大倍率拍摄的单独大鼠背根神经节轴突的四个 2D 冷冻电镜图像的蒙太奇。

观看此视频后，您应该对如何在电子显微镜网格上准备原代神经元有一个很好的了解，以便于使用冷冻电子断层扫描在冷冻水合状态下可视化其神经元。