Name: 药物治疗后肝细胞癌类器官的生成及单细胞转录组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-26T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 了解肝细胞癌类器官药物处理及单细胞转录组分析的标准化流程。该方法使用患者来源类器官和仑伐替尼处理，通过单细胞RNA测序分析治疗前后的细胞状态与基因表达变化，为肿瘤药物反应研究提供可扩展的技术方案。

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本研究受到国家自然科学基金（82303022；82122048；82372714；82203380）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515011416）以及广州市基础与应用基础研究基金（2024A04J6575）的资助。部分示意图元素使用“研究人员之家”（https://www.home-for-researchers.com）制作，并由作者进行了修改。示意图使用Figdraw（https://www.figdraw.com）绘制，并由作者进行了修改。

本研究使用的人体组织经广州医科大学研究伦理审查委员会审核并批准（批准号：GYZL-2024-KY31）。所有涉及人体样本的操作均遵循机构关于人类研究的指导方针。所有患者均已签署书面知情同意书，同意将其临床样本用于医学研究。所用试剂和设备列于材料表中。
该实验流程包括冷冻保存的肝细胞癌类器官的复苏与扩增，并针对下游的治疗干预和单细胞RNA测序进行了少量优化。目的是获得质量足够高且一致性良好的类器官培养物，用于后续的药物处理实验12。
1. 建立并扩增肝细胞癌患者来源类器官
<ol>
	<li>类器官的解冻与复苏
	<ol>
		<li>解冻前准备
		<ol>
			<li>将水浴锅预热至 37 °C。将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中至少预平衡 1 小时，以备接种使用。</li>
			<li>提前配制完全类器官培养基，并将基底膜提取物（BME）置于冰上直至使用。完全类器官培养基的组成见补充表 1。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>类器官解冻
		<ol>
			<li>从液氮储存中取出含有冷冻肝细胞癌（HCC）类器官的冻存管，立即放入 37 °C 水浴中。</li>
			<li>轻轻摇动冻存管，当仅剩少量冰晶时停止解冻。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>去除冷冻保护剂
		<ol>
			<li>用移液器轻轻吹打一次解冻后的悬液，以重悬内容物。</li>
			<li>将悬液转移至含有 3–5 mL 完全类器官培养基的 15 mL 锥形离心管中。</li>
			<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的包埋与重新接种
	<ol>
		<li>复苏混合液的制备
		<ol>
			<li>将类器官沉淀重悬于完全类器官培养基中。完全类器官培养基的组成见补充表 1。</li>
			<li>与等体积的冰上预冷 BME 轻柔混合，制备接种混合液。 
			注：保持混合液处于冰上，以防止基质提前聚合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>类器官穹顶的接种
		<ol>
			<li>将 50 µL 类器官-基质混合液加入预热的 24 孔板的每个孔中。</li>
			<li>在 37 °C 下孵育 30 分钟，使基质固化。</li>
			<li>沿孔壁向每孔加入 500 µL 含 20 µM Y-27632 的完全类器官培养基。 
			注：Y-27632 仅在解冻或传代后的前 2–3 天内使用。确保每个穹顶保持紧凑，并附着于孔底，不向外扩散。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的培养与扩增
	<ol>
		<li>复苏期培养条件
		<ol>
			<li>将类器官维持在 37 °C、5% CO2 的培养环境中。</li>
			<li>在解冻后的前 2–3 天内使用含 20 µM Y-27632 的培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养基更换
		<ol>
			<li>每 3–4 天使用轻柔吸除法更换一次培养基。</li>
			<li>沿每个孔的孔壁加入新鲜培养基，避免破坏基质穹顶。</li>
			<li>在同一实验中，所有孔应保持一致的换液频率。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生长监测
		<ol>
			<li>使用明场显微镜并保持一致的成像参数，监测类器官的复苏与扩增情况。</li>
			<li>在复苏与扩增过程中，于规定时间点记录代表性图像。</li>
			<li>当大多数结构保持完整、类器官呈现圆形至椭圆形且边界光滑、随时间推移出现持续增大、且碎片或塌陷结构极少时，可确认复苏成功。</li>
			<li>在后续定量分析中，排除含有少于 10 个完整类器官的孔。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>传代与扩增标准
		<ol>
			<li>在观察到稳定扩增后进行类器官传代。</li>
			<li>通过类器官尺寸或总面积可重复地增加且形态保持良好，来确认稳定扩增。</li>
			<li>在不同实验中保持一致的成像间隔、放大倍数和纳入标准。</li>
			<li>基于类器官面积或计数生成代表性生长曲线，以确认扩增稳定性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>后续实验的标准
		<ol>
			<li>选用表现出稳定三维生长、无污染或广泛塌陷、并能为平行实验条件提供足够产量的类器官系。</li>
			<li>在解冻后至少维持培养 7–10 天，或直至完成复苏及一个扩增周期。</li>
			<li>仅推进在重复孔中形态一致的类器官系。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 治疗干预用类器官的制备
<ol>
	<li>治疗前质量评估
	<ol>
		<li>基于形态学的评估
		<ol>
			<li>确认类器官形态呈圆形至椭圆形。</li>
			<li>确认类器官具有光滑且边界清晰的轮廓。</li>
			<li>确认类器官内部细胞碎片极少。</li>
			<li>排除存在广泛碎片化、腔体变暗、大面积塌陷或明显污染的培养物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>扩增状态评估
		<ol>
			<li>仅使用已完成恢复并进入稳定扩增阶段的类器官培养物。</li>
			<li>确认类器官随时间推移持续增大。</li>
			<li>确认在重复孔之间形态一致。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为药物处理重新接种类器官
	<ol>
		<li>从基质中回收类器官
		<ol>
			<li>每孔加入1 mL预冷的细胞回收溶液，在冰上溶解类器官穹顶结构，孵育15–20分钟。</li>
			<li>孵育期间每5分钟轻柔吹打一次。</li>
			<li>将回收的悬液在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
			<li>将沉淀重悬于完全类器官培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重新接种前的标准化
		<ol>
			<li>在药物处理前，确保各孔起始类器官负荷量一致。</li>
			<li>在可行的情况下，经部分解离后测定活细胞数量。</li>
			<li>将样本归一化至每孔接种相同数量的细胞。</li>
			<li>在24孔板中，每孔接种约1,000–5,000&#160;个活细胞。</li>
			<li>若未进行直接细胞计数，则通过确保每孔中形态完整的类器官数量相近且各组间大小分布相似来进行归一化。</li>
			<li>在处理前记录每孔初始类器官数量及基线形态。</li>
			<li>在同一实验中，所有孔应采用相同的纳入标准和接种策略。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为药物处理重新接种
		<ol>
			<li>将回收的类器官与预冷的基底膜基质混合，终浓度为30%–50%。</li>
			<li>向24孔板的每孔中加入50 µL穹顶状结构。</li>
			<li>在37 °C孵育30分钟，以促进基质聚合。</li>
			<li>沿孔壁每孔加入500 µL完全类器官培养基。 
			注意：确保每个穹顶结构保持紧凑并附着于孔底，不向外扩散。在同一实验中，所有孔的穹顶体积和基质浓度应保持一致。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物处理前的恢复
	<ol>
		<li>重新接种后的恢复
		<ol>
			<li>在标准培养条件下让类器官过夜恢复。</li>
			<li>仅当重新接种的穹顶结构中类器官形态恢复完整后，才开始处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>药物处理的准入标准
		<ol>
			<li>仅当类器官在重新接种后保持完整、无广泛塌陷或过多碎片，且各孔间类器官负荷量相近时，才启动药物处理。</li>
			<li>在处理前，为所有实验组记录明场图像作为基线。</li>
			<li>在所有对照组和处理组孔中，保持相同的起始类器官负荷量、重新接种后的恢复时间以及处理开始时间。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安全注意事项
	<ol>
		<li>所有涉及人源类器官的操作均应使用适当的个人防护装备，并遵循生物安全操作规范。</li>
		<li>小心操作酶解解离试剂，避免接触皮肤或眼睛。</li>
		<li>根据机构的生物安全规定妥善处置液体和固体生物废弃物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肝细胞癌类器官的药物处理
<ol>
	<li>药物制备与处理
	<ol>
		<li>药物制备
		<ol>
			<li>根据制造商说明书，用 DMSO 配制乐伐替尼（lenvatinib）储备液。</li>
			<li>使用前立即用预热的培养基将储备液稀释至预定义的工作浓度。</li>
			<li>确保所有孔中的终浓度 DMSO 保持一致（≤ 0.1%）。</li>
			<li>配制足够体积，以保证每孔最终处理体积相等。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>药物处理
		<ol>
			<li>沿每孔孔壁加入含乐伐替尼的培养基（20 µM），避免扰动基质凝胶的穹顶结构。</li>
			<li>设置溶剂对照组，其终浓度 DMSO 与处理组相同。</li>
			<li>将类器官在标准培养条件下孵育，持续预定义的处理时间。</li>
			<li>若处理时间超过 72 小时，每 48–72 小时更换一次含药培养基。</li>
			<li>实验中所有孔均采用相同的培养基更换时间表。</li>
			<li>处理前记录明场下的基线图像。</li>
			<li>处理期间以固定时间间隔采集图像，显微镜设置、放大倍数和视野位置保持一致。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>治疗反应评估
	<ol>
		<li>基于形态学的评估
		<ol>
			<li>采用以下基于图像的读数评估治疗反应：类器官面积生长曲线、平均类器官直径和存活类器官计数。</li>
			<li>所有图像均采用相同的曝光设置、放大倍数和分析阈值。</li>
			<li>通过计算每个时间点每孔或每视野的类器官总面积，并相对于基线进行归一化，获得类器官面积生长曲线。</li>
			<li>通过测定单个完整类器官的直径，计算每孔的平均值，获得平均类器官直径。</li>
			<li>通过计数形态上可识别的完整类器官，排除碎片和塌陷片段，确定存活类器官数量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选的活力检测
		<ol>
			<li>若需额外进行整体活力评估，可在治疗终点执行三维荧光素酶活力检测。</li>
			<li>按照制造商说明书进行检测操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>绘制类器官面积随时间变化的生长曲线。</li>
		<li>比较溶剂对照组与乐伐替尼处理组的平均类器官直径。</li>
		<li>比较不同处理组之间的存活类器官数量。</li>
		<li>所有组别均采用相同的图像采集时间表、类器官纳入标准和分析参数，以确保可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 单细胞RNA测序用类器官的制备
<ol>
	<li>类器官的筛选与回收
	<ol>
		<li>解离前评估
		<ol>
			<li>选择具有完整三维结构、无广泛塌陷、含有足够材料用于后续单细胞捕获且无明显污染的类器官孔。</li>
			<li>在对照组和处理组样本中，于相同的实验时间点收集类器官。</li>
			<li>保持各样本间铺板密度、处理时间表及培养基更换条件一致。</li>
			<li>使用相同的显微镜设置、放大倍数和视野选择标准，在解离前记录每个选定孔的明场图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>基质去除
		<ol>
			<li>完全吸除每孔中的培养基。</li>
			<li>用预冷的 PBS 洗涤每孔两次，以去除残留培养基和碎片。</li>
			<li>向每孔中加入 1 mL 预冷的细胞回收溶液。</li>
			<li>在冰上孵育 20–30 分钟。</li>
			<li>孵育期间每 5–7 分钟轻柔吹打一次，以促进基质溶解。</li>
			<li>使用宽口或剪口移液枪头将溶解后的材料转移至预冷的离心管中，以尽量减少剪切应力。</li>
			<li>仅当基质基本溶解且仅剩少量可见凝胶残留时，才进行后续酶解解离步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶解解离与单细胞悬液制备
	<ol>
		<li>酶解解离
		<ol>
			<li>将回收的类器官悬液在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>小心移除上清液，避免扰动沉淀。</li>
			<li>将沉淀重悬于 1 mL 重组细胞解离酶中。</li>
			<li>在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。</li>
			<li>每 2–3 分钟使用宽口 P1000 枪头轻柔吹打 8–10 次，以促进解离。</li>
			<li>当大多数类器官片段已分散为单细胞且仅剩少量残余细胞团时，停止消化。</li>
			<li>避免过度消化，以防细胞活力降低、产生应激相关转录伪影以及环境 RNA 污染增加。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>终止反应与过滤
		<ol>
			<li>加入 4 mL 含 2% 胎牛血清的预冷 PBS 以终止消化反应。</li>
			<li>将悬液通过 40 µm 细胞筛过滤。</li>
			<li>用 PBS 洗涤一次，以去除残留酶、聚集体和碎片。</li>
			<li>若存在红细胞污染，按照制造商说明书进行红细胞裂解。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞制备与质量控制
		<ol>
			<li>使用台盼蓝排斥法计数细胞。</li>
			<li>在文库构建前测定细胞活力。</li>
			<li>仅使用活力 ≥ 85% 的样本。</li>
			<li>将最终细胞浓度调整至 700–1,200 个细胞/µL。</li>
			<li>排除含有过多碎片、大量死细胞、明显大聚集体或解离不完全的样本。</li>
			<li>若存在聚集体，上样前重复过滤步骤。</li>
			<li>对照组和处理组样本应在相同条件下处理，包括解离酶种类、消化时间、吹打频率、过滤方法、细胞浓度及上样策略。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞文库构建与测序
	<ol>
		<li>单细胞捕获与文库构建
		<ol>
			<li>根据制造商说明书，将制备好的单细胞悬液加载至基于液滴的单细胞捕获平台。</li>
			<li>使用相应的单细胞 3′ 流程进行逆转录、cDNA 扩增和文库构建。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测序参数
		<ol>
			<li>每细胞测序深度至少达到 50,000 条 reads。</li>
			<li>上样细胞数应使每个文库回收约 6,000–10,000 个细胞。</li>
			<li>记录测序化学体系、读段结构及仪器设置。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下游分析的质量标准
	<ol>
		<li>确保最终制备样品具有高细胞活力、极少碎片和低聚集体负荷。</li>
		<li>确认其适用于后续单细胞转录组分析，以研究细胞异质性和细胞状态转变。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 单细胞RNA测序数据的基本处理与质量控制
<ol>
	<li>初级数据处理
	<ol>
		<li>生成计数矩阵
		<ol>
			<li>使用所选平台推荐的分析流程处理原始测序数据。</li>
			<li>生成基因-细胞计数矩阵。</li>
			<li>记录软件版本、参考基因组版本及转录本注释版本信息。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>初始文库水平质量评估
		<ol>
			<li>汇总每个文库的测序指标，包括总读段数、估计回收细胞数、每个细胞的中位基因数、每个细胞的中位UMI数以及测序饱和度（如适用）。</li>
			<li>所有样本使用相同的参考基因组和注释设置。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞水平质量控制
	<ol>
		<li>低质量细胞过滤
		<ol>
			<li>对每个细胞评估检测到的基因数量、总UMI计数、线粒体转录本比例以及存在双细胞或多细胞的证据。</li>
			<li>排除基因计数极低、UMI计数极低或线粒体转录本比例异常升高的细胞。</li>
			<li>根据数据集分布设定过滤阈值。</li>
			<li>在匹配的处理组间应用相同的过滤阈值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可能的双细胞去除
		<ol>
			<li>使用适当的计算方法识别可能的双细胞。</li>
			<li>使用与平台兼容的检测流程去除双细胞。</li>
			<li>在所有样本中应用相同的双细胞检测策略。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准化、聚类与注释
	<ol>
		<li>数据标准化
		<ol>
			<li>使用标准的单细胞RNA测序分析流程对过滤后的计数矩阵进行标准化。</li>
			<li>在所有样本中应用相同的标准化流程。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>降维与聚类
		<ol>
			<li>进行降维处理。</li>
			<li>进行无监督聚类以识别主要的转录组群体。</li>
			<li>使用低维嵌入方法（如UMAP）可视化细胞状态。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>标志基因识别
		<ol>
			<li>通过聚类间的差异表达分析识别标志基因。</li>
			<li>基于标志基因表达对主要上皮细胞状态进行生物学注释。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理条件的比较分析
	<ol>
		<li>元数据整合
		<ol>
			<li>为每个细胞标注处理条件、患者来源类器官系及处理批次。</li>
			<li>在所有样本中保持一致的元数据结构。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>处理相关变化分析
		<ol>
			<li>比较对照组与处理组样本。</li>
			<li>识别与处理相关的转录组重塑。</li>
			<li>识别细胞状态组成的变化。</li>
			<li>识别与治疗适应相关的候选细胞群体。</li>
			<li>结合基于形态学和存活率的检测结果共同解释分析结果。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析输出
	<ol>
		<li>生成经过质量控制的基因-细胞计数矩阵。</li>
		<li>生成转录组不同群体的低维可视化图。</li>
		<li>识别主要聚类的标志基因。</li>
		<li>在参考基因组、预处理流程、过滤标准、聚类策略和注释标准方面保持所有样本之间的一致性。</li>
		<li>记录任何偏离标准流程的样本特异性操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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作者声明无利益冲突。

为确保可重复性、高效性以及高质量的单细胞转录组分析，该实验流程中的多个技术步骤需要严格控制。在复苏和扩增患者来源的肝细胞癌类器官时保持一致性至关重要，因为接种密度、基底膜基质成分和培养时间的差异可能会影响类器官的形态、生长特性以及后续治疗反应13,14。此外，解离过程中保持高细胞活力对单细胞RNA测序（scRNA-seq）尤为关键，因为剧烈的酶消化或过度的机械剪切可能引入与应激相关的转录偏差，并降低数据质量。优化的解离策略（如低温或使用冷活性酶处理条件）有助于在敏感的类器官样本中维持原有的细胞组成15。
该方案可根据实验需求进行策略性调整。对于生长缓慢或冻存后复苏率不稳定的类器官品系，延长扩增时间或优化基质浓度与培养基成分，可提高培养的稳定性和实验的一致性。药物处理时间可根据预期的治疗反应进行调整。该工作流程的优势在于，将常规类器官培养、药物处理和标准单细胞文库制备整合为一个易于实施的实验设计。该方案适用于已熟悉类器官...

肝细胞癌（HCC）是成人中最常见的原发性肝癌，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一1,2,3。其临床预后较差，主要归因于显著的瘤内异质性，导致治疗耐药和复发4。最近一项研究表明，由关键转录程序（如FOXM1/CEBPB轴）驱动的发育多样性及细胞状态可塑性，是HCC治疗耐药的重要机制5。这些发现凸显了理解肿瘤细胞群体在持续治疗压力下如何适应并发生状态转换的必要性。然而，大多数临床前模型未能充分反映这些治疗相关状态转换的动态性和连续性，从而限制了对肿瘤适应机制及治疗失败机理的深入研究。
患者来源的类器官（PDOs）为此目的提供了一个有用的平台，因为它们保留了原始肿瘤的重要基因组改变和细胞异质性6。肝细胞癌（HCC）类器官可在长期培养中维持关键的组织学特征7，使其特别适用于治疗反应研究。此外，基于类器官的研究已证明利用肝癌类器官进行药物筛选以及捕捉个体间和瘤内治疗敏感性差异的可行性，支持其作为治疗反应研究的临床前模型的价值8,9。然而，大多数基于类器官的药物研究仍主要依赖终点活力检测，或主要集中于整体表型反应，因而仅能提供关于细胞异质性反应和治疗相关转录变化的有限信息。与此同时，针对HCC的RNA靶向治疗策略的快速发展，进一步凸显了建立能够以单细胞分辨率准确预测并从机制上解析治疗反应的临床前体系的迫切需求10。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可实现对类器官模型中细胞组成和转录状态的高分辨率表征11将单细胞RNA测序（scRNA-seq）应用于治疗前后收集的类器官样本，可揭示基因表达变化、细胞群体的动态转变以及bulk检测方法无法捕获的异质性响应。因此，该方法代表了一种实用且强大的策略，可用于研究肝细胞癌（HCC）类器官中与治疗相关的转录重塑。然而，目前仍缺乏一种整合HCC类器官培养、药物处理及治疗前后单细胞RNA测序的实用且可重复的操作流程。此类流程的有效性依赖于药物处理过程中类器官完整性的维持，以及能够回收足够数量的活细胞用于后续单细胞分析。与其他基于类器官的方法类似，其重要局限性包括对肿瘤微环境中基质、血管和免疫组分的代表性不足，以及长期培养过程中可能产生的选择性偏倚。 体外&#160;培养。
本文描述了一种整合的实验流程，用于生成肝细胞癌（HCC）类器官，施加定义明确的药物处理，并在处理前后对类器官样本进行单细胞RNA测序分析。该流程包括类器官复苏与扩增、处理前质量评估、可控的药物暴露，以及配对样本的下游单细胞RNA测序。该方法提供了一个实用框架，可在单细胞分辨率下比较HCC类器官中与治疗相关的细胞组成及基因表达程序的变化。

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-胃泌素 I 人</td><td>默克</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>默克</td><td>AXYMCT150LC</td><td></td></tr><tr><td>1X 红细胞裂解缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 内螺纹冷冻小瓶</td><td>巢</td><td>607001</td><td></td></tr><tr><td>A8301（TGFb 抑制剂）</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>AFP 多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>14550-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗白蛋白抗体 [ALB/2144]</td><td>abcam</td><td>ab236492</td><td></td></tr><tr><td>抗HNF-4α抗体 [EPR16885] - ChIP级</td><td>abcam</td><td>ab181604</td><td></td></tr><tr><td>抗前白蛋白抗体 [EPR3219]</td><td>abcam</td><td>ab92469</td><td></td></tr><tr><td>抗SOX9抗体 [EPR14335-78]</td><td>abcam</td><td>ab185966</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂（503），不含维生素 A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液，100 mL</td><td>康宁</td><td>354253</td><td>用于在重新接种或下游处理前溶解基底膜基质并回收类器官的试剂</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo&amp;reg;&amp;nbsp;三维细胞活力检测</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>默克</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3' GEM，文库 &amp;amp; 凝胶微珠试剂盒 v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>CG000227</td><td></td></tr><tr><td>康宁细胞滤筛，40 &amp;mu;米，蓝色，S，IND，1/50</td><td>康宁</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Corning 24孔透明平底超低吸附多孔板，单个包装，无菌</td><td>康宁</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 减少生长因子基底膜提取物，2 型 PathClear（BME）</td><td>默克</td><td>3533-005-02</td><td>用于支持三维类器官培养和圆顶结构形成的细胞外基质</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>默克</td><td>C6164</td><td>用于配制药物储备液和空白对照的溶剂</td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12634028</td><td>高级DMEM/F-12</td></tr><tr><td>E7080（乐伐替尼）</td><td>Selleck</td><td>S1164</td><td>用于类器官治疗及治疗性干预的酪氨酸激酶抑制剂</td></tr><tr><td>胎牛血清价值 FBS</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>福斯科林</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>苏木精和伊红染色试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，1 M</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6 B 荧光电动显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂（1003）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>默克</td><td>A0737-5MG</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>默克</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>基因组生物</td><td>GNM20012</td><td>用于清洗类器官及制备下游处理样品的缓冲液</td></tr><tr><td>重组人EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>重组人HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>重组人Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐</td><td>默克</td><td>Y0503</td><td>ROCK抑制剂，用于提高类器官在解冻或传代后的存活率</td></tr><tr><td>R-spodin1 条件培养基</td><td>（Broutier 等）</td><td>N/A</td><td>细胞系的分泌</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液，经0.85%生理盐水配制，膜过滤</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x），无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12604013</td><td>胰蛋白酶替代物</td></tr><tr><td>Wnt-3a 条件培养基</td><td>（Broutier 等）</td><td>N/A</td><td>细胞系的分泌作用</td></tr></tbody></table>

药物处理后肝细胞癌类器官的生成及单细胞转录组学分析

Generation and Single-Cell Transcriptomic Analysis of Hepatocellular Carcinoma Organoids following Drug Treatment

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其特征是显著的瘤内异质性，这导致治疗反应差异、肿瘤复发和疾病进展。因此，深入理解肿瘤细胞在药物治疗前后转录水平的变化，对于改进治疗策略至关重要。然而，目前将类器官药物处理与后续单细胞转录组分析相结合的实用实验流程仍较为有限。本研究建立了一种标准化的工作流程，用于生成肝细胞癌类器官、施加特定药物处理，并对处理前后采集的样本进行单细胞RNA测序。该方案包括类器官复苏与扩增、治疗前质量评估、药物暴露、类器官单细胞解离前准备、文库构建以及单细胞转录组数据的基本比较分析。文中提供了关键的技术注意事项，以提高实验的可重复性和样本质量。该工作流程能够并行表征肝细胞癌类器官中与药物处理相关的细胞组成变化和转录组改变。该方案具有良好的稳健性、可扩展性，并适用于不同的类器官系统，为在单细胞分辨率下研究治疗相关的基因表达变化提供了实用平台。

图1概述了肝细胞癌（HCC）类器官的建立与表征过程。图1A显示，采用患者来源的肿瘤组织建立类器官培养体系，用于组织学分析和治疗研究。图1B展示了类器官在复苏后第1天和第6天的明场图像，表明其在标准三维培养条件下具有存活能力并可扩增。第1天时，类器官呈小而致密的结构，至第6天则体积增大，形态清晰且结构完整。图1C展示了扩增期间类器官的明场图像及苏木精-伊红染色结果，以及EPCAM、AFP、SOX9、HNF4A和ALB的免疫染色结果，证实其具有肝细胞谱系特征。上述结果表明HCC类器官已成功建立并实现有效扩增，表现为持续生长、形态保持良好以及表达肝细胞谱系标志物。
图2展示了治疗相关的形态学变化以及类器官用于单细胞RNA测序的制备过程。图2A</str...

本方案概述了一种简化的方法，用于生成肝细胞癌类器官，施加药物处理，并在处理前后进行单细胞RNA测序，以表征与治疗相关的转录变化。

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其特征是显著的瘤内异质性，这种异质性……

我们重点关注肝细胞癌类器官对药物治疗的反应，以及其转化研究在实际工作中的变化。该方案适用于肝细胞癌类器官，也可根据需要调整用于其他肿瘤类器官系统。首先，建立肝细胞癌（HCC）患者来源的类器官，并为其接受治疗干预做好准备。根据制造商说明书，用二甲基亚砜（DMSO）配制仑伐替尼储备液。使用前，立即用预热的培养基将储备液稀释至预定的工作浓度。配制足够体积的溶液，以确保所有孔中的终体积相等，从而使每孔中的 DMSO 浓度保持一致。接下来，沿每个孔的孔壁加入含20微摩尔仑伐替尼的培养基，以避免干扰基质小滴。设置含有相同终浓度DMSO的溶剂对照组。将类器官在标准培养条件下孵育预定义的处理时间。对于超过72小时的处理，每48至72小时更换一次含药物的培养基，确保所有孔板的更换时间表保持一致。在处理前记录明场基础图像。在处理期间以固定的时间间隔，使用相同的显微镜设置、放大倍数和视野位置采集图像。对于基于形态学的治疗反应评估，所有图像应采用相同的曝光设置、放大倍数和分析阈值。通过计算每个时间点每孔或每个视野中类器官的总面积，并将数值归一化至基线水平，从而绘制类器官面积生长曲线。为测量类器官平均直径，需确定各个完整类器官的直径，并计算每孔的平均值。接下来，通过计数形态上可识别的完整类器官来确定存活的类器官数量，同时排除任何碎片或塌陷的片段。如果在处理终点需要进行额外的整体活力评估，则根据制造商说明书进行三维发光活力检测。然后，绘制类器官面积随时间的增长曲线。比较对照组与仑伐替尼处理组类器官的平均直径，同时比较各处理组中存活类器官的数量。应确保使用一致的成像时间表、纳入标准及分析参数，以保证实验的可重复性。选择具有完整三维形态、含有足够单细胞捕获材料且无可见污染的类器官孔。使用相同的显微镜设置、放大倍数和视野选择标准，在消化前记录每个选定孔的明场图像。在对照组和处理组之间采集相同时间点的类器官，并在整个样本中保持一致的铺板密度、处理时间表和培养基更换条件。从每个孔中完全吸除培养基。用预冷的 PBS 洗涤每个孔两次，以去除残留的培养基和碎片。向每个孔中加入 1 毫升预冷的细胞回收溶液，并在冰上孵育 20 至 30 分钟。孵育期间每5至7分钟轻柔吹打一次，以促进基质溶解。使用宽口或剪口移液枪头将溶解后的材料转移至预冷的离心管中，以尽量减少剪切力。只有当基质基本溶解且仅剩少量可见凝胶残留时，方可进行酶解解离。将回收的类器官悬液在4 °C条件下以300 ×g离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于1 mL重组细胞解离酶中，在37 °C孵育5至10分钟。每2至3分钟使用宽口P1000枪头轻柔吹打8到10次，以促进组织解离。当大多数类器官片段已分散为单个细胞，仅剩少量残余细胞团时，停止消化。随后，加入4毫升含2%胎牛血清的预冷PBS以终止消化反应。然后，将悬液通过40微米的细胞筛过滤。用PBS洗涤一次，以去除残留的酶、细胞聚集体和碎片。使用台盼蓝排斥法计数细胞。在确保细胞存活率达到85%或以上后，将最终细胞浓度调整为每微升700至1,200个细胞。排除含有过多碎片、大量死细胞、明显大块聚集体或解离不完全的样本。若存在聚集体，上样前需重复过滤。在相同条件下对对照样本和处理样本进行操作，包括解离酶种类、消化时间、吹打次数、过滤方法、细胞浓度及上样策略。最后，在完成单细胞文库扩增后，进行单细胞测序。类器官在复苏后第1天至第6天期间，在标准的三维培养条件下存活并持续扩增。第1天时，类器官呈现为小型致密结构，而到第6天时，其体积增大，并表现出明确的形态特征。与DMSO处理的对照组相比，经乐伐替尼（lenvatinib）处理的类器官更小，且形态发生改变。定量分析显示，与DMSO对照组相比，乐伐替尼处理后类器官的平均直径显著减小。本方案使我们能够在处理后研究细胞状态、细胞组成和基因表达的变化。最大的挑战是保持细胞活力，并确保所有组别的处理过程简单且一致。在此步骤之后可进行细胞下游分析，包括聚类分析、差异基因实验分析、通路富集分析和转录调控推断。

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癌症研究

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