Name: 斑马鱼非酒精性脂肪肝相关肝细胞癌早期进展期间的肝脏微环境分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解利用斑马鱼幼虫模型研究非酒精性脂肪性肝炎相关肝细胞癌早期进展的计算方法。通过高胆固醇饮食诱导和活体成像技术，分析肝脏微环境变化及免疫细胞浸润动态，为癌症生物学和肝病研究提供新视角。

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作者谨此感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院斑马鱼核心设施的技术人员克林顿·德帕奥洛（Clinton DePaolo）和斯巴塔克·卡林宁（Spartak Kalinin）在斑马鱼品系维护和实验协助方面提供的支持。&#160;FJMN 的研究工作得到了癌症研究所和纤维板层肝癌基金会的资助。

动物实验按照阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序进行。本实验方案中所用缓冲液和溶液的配制方法，请参见补充表1。
1. 制备用于急性胆固醇过量的10%胆固醇富集饮食。
<ol>
	<li>取两个 25 mL 玻璃烧杯，分别称取 2 × 4 g 的 Golden Pearl Diet 5-50&#8239;nm 活性微球（GPAS）——一个用于正常饮食（ND），另一个用于 10% 高胆固醇饮食（HCD）。 
	注意：可使用任何市售的斑马鱼幼体干燥饲料。</li>
	<li>在 10 mL 玻璃烧杯中称取 0.4 g 胆固醇，并用铝箔覆盖烧杯口。</li>
	<li>使用带 20 G 针头的 10 mL 注射器量取 5 mL 乙醚。随后将乙醚加入 ND 烧杯中，并立即用刮勺与干燥饲料充分混合。 
	警告：乙醚可引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激。仅可在化学通风橱中使用。</li>
	<li>再次使用带 20 G 针头的 10 mL 注射器量取 5 mL 乙醚，加入含胆固醇的 10 mL 烧杯中，并立即用注射器反复抽吸混合，使胆固醇溶解。</li>
	<li>迅速将胆固醇溶液加入 HCD 烧杯中，并立即用刮勺搅拌，直至混合均匀。</li>
	<li>将烧杯置于通风橱中静置最多 24 小时，使乙醚完全挥发。次日，使用研钵和研杵将 GPAS 饲料研磨成细小颗粒。 
	&#8203;注意：研磨饲料是关键步骤，幼体无法摄食大于 50 nm 的颗粒。</li>
	<li>将每种饲料分别转移至标记好的小型塑料袋或 50 mL 离心管中，于 -20 ˚C 保存。</li>
</ol>
2. 通过胆固醇富集饮食短期喂养幼虫诱导NASH——静态条件。
<ol>
	<li>在第 -1 天建立转基因鱼系（表 1）。次日早晨（第 0 天），在鱼产卵后，用网筛收集卵。</li>
	<li>使用装有胚胎水（E3）的冲洗瓶彻底冲洗卵，并小心地将卵转移至含有 E3 培养基的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>清理繁殖盒中可能积聚的所有碎屑，包括死亡或未受精的卵。 
	注意：冲洗卵和清洁培养皿对于防止微生物不受控生长以及由此导致的幼鱼发育异常至关重要。</li>
	<li>将卵以每 10 cm 培养皿 70–80 枚的密度分配（置于 25 mL E3 培养基中）。在第 1 天，在配备透射照明底座的解剖显微镜下检查并清除死亡或发育异常的胚胎。 
	注意：使用透射照明底座的暗场模式识别发育异常的胚胎，并检查培养皿中是否存在微生物生长。不同实验设施的系统中微生物滋生情况各异。如有必要，更换 E3 培养基和/或培养皿，以避免不利影响。</li>
	<li>在第 5 天，将所有培养皿中的幼鱼合并至一个 15 cm 培养皿中，加入不含亚甲蓝的 E3 培养基。随后按照以下方式将幼鱼分配至喂养盒中（表 2）。 
	注意：在对照条件下，为获得健康幼鱼且不诱发全身性慢性炎症，每条幼鱼每日应喂食约 0.1 mg 食物。请注意，总食物量（表 2）需平均分为每日两次投喂。</li>
	<li>将幼鱼置于 28 °C 的培养箱中，在明暗循环条件下（例如 14 小时光照/10 小时黑暗循环），从第 5 天至第 12 天每天喂食两次。</li>
	<li>每天使用连接 1 mL 移液器吸头的真空系统吸除食物残渣以及 90–95% 的培养基。随后，小心地将不含亚甲蓝的新鲜 E3 培养基沿喂养盒的一角缓缓倒入，以避免损伤幼鱼。 
	注意：每日清洁喂养盒对于防止微生物不受控生长至关重要。</li>
</ol>
3.&#160;从喂养盒中收集受精后13天的幼虫。
<ol>
	<li>第13天，根据设置的实验条件数量准备相应数量的收集培养皿。使用永久性记号笔在培养皿（包括皿盖和皿底）侧面做标记，以避免样品混淆，例如正常饮食组（ND）标记一条黑线，高脂饮食组（HCD）标记两条黑线。</li>
	<li>倒入足量不含亚甲蓝的E3培养液，以覆盖每个培养皿底部。使用真空系统小心吸除喂养盒中的水，尽量将底部的残渣或死亡幼鱼吸出，避免将这些物质转移至收集培养皿中。</li>
	<li>当水位开始降低时，缓慢抬起喂养盒，使幼鱼游向其中一个角落，然后从相反方向进行吸液。 
	注意：使用剪去尖端的1 mL移液枪头，在不同高度进行操作，以便在吸液时提供不同的孔径。交替使用不同大小的枪头，开始时使用较大孔径，随着液体体积减少和幼鱼密度增加，逐渐更换为较小孔径。</li>
	<li>当剩余液体约为20–30 mL时，小心将幼鱼倾倒至第1步中准备好的收集培养皿中。将喂养盒上的标签胶带贴在培养皿盖上。</li>
	<li>对所有喂养盒重复步骤3.2–3.4。</li>
</ol>
4. 饮食诱导肝脂肪变性的对照实验——油红O（ORO）染色、成像与评分。
<ol>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将15-20条幼虫转移至一个2 mL圆底离心管中，置于冰上约15-30分钟。去除管中的大部分培养基。</li>
	<li>加入2 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定幼虫，并在4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>次日早晨，弃去4% PFA溶液，用2 mL 1x PBS清洗幼虫三次。</li>
	<li>每种实验条件准备一个12孔板（图2A），每孔中放置一个带网格的插入式培养小室。</li>
	<li>使用玻璃吸管将幼虫从2 mL离心管转移至已放置在孔板中的插入式小室，并加入5 mL 1x PBS。染色完成后，保留2 mL离心管用于样品储存。 
	注意：此阶段幼虫具有极强黏性，切勿使用塑料吸管。</li>
	<li>将带有幼虫的插入式小室转移至另一孔中，加入5 mL 60%异丙醇溶液，在室温（RT）下孵育30分钟。</li>
	<li>同时，配制0.3%油红O的60%异丙醇溶液。使用0.45 µm注射器滤器将0.3%油红O溶液过滤两次。 
	备注：通过将3 mL异丙醇中的0.5%油红O溶液与2 mL蒸馏水混合，每孔配制5 mL溶液。0.3%油红O的60%异丙醇溶液需新鲜配制。</li>
	<li>随后，将带有幼虫的插入式小室转移至另一孔中，加入5 mL新配制的0.3%油红O的60%异丙醇溶液，在室温下轻轻振荡孵育3小时。</li>
	<li>油红O染色后，将插入式小室转移至另一含有60%异丙醇的孔中冲洗幼虫。每次用60%异丙醇清洗30分钟，共清洗两次，每次将插入式小室依次转移至新的含60%异丙醇的孔中。</li>
	<li>将插入式小室依次转移至含有1x PBS-0.1% Tween的孔中，清洗幼虫三次，每次5分钟。</li>
	<li>将幼虫转移回2 mL离心管中，弃去PBST，加入1 mL 80%甘油，并在4 °C保存直至成像。</li>
	<li>为获得更好的成像效果，将幼虫转移至1x PBS-0.1% Tween中，在解剖显微镜下使用两把#55镊子小心牵拉组织，分离肝脏。 
	备注：若使用Casper品系背景，可直接对整条幼虫进行成像。</li>
	<li>使用玻璃吸管小心将肝脏转移至瓷点滴板的一个孔中，孔内含50%甘油。使用小型工具（如睫毛工具—图2B）调整肝脏位置。在配备彩色相机的体视显微镜下对肝脏进行成像。</li>
	<li>评估肝脂肪变性程度（无油红O染色=无；浅红色染色=轻度；红色至深红色染色=中度/重度）。</li>
</ol>
5. 使用斑马鱼创伤与捕获成像生长装置（zMEDGI）进行无创共聚焦成像。
<ol>
	<li>准备一个10 cm的培养皿，加入15–20 mL的1×三卡因-E3溶液，用量以刚好覆盖皿底为宜。 
	注意：1×三卡因-E3工作液（0.16 mg/mL）可通过将2 mL的25×三卡因储备液（4 mg/mL）稀释于48 mL的E3溶液中制得。三卡因浓度不得超过0.16 mg/mL，因为此发育阶段的幼鱼对麻醉极为敏感。</li>
	<li>使用塑料巴斯德&#160;吸管将15–20条幼鱼转移至含有1×三卡因-E3的培养皿中，麻醉5分钟。</li>
	<li>准备一个6孔板，每孔加入2–3 mL不含亚甲蓝的E3溶液。</li>
	<li>在荧光体视显微镜下，对麻醉后的幼鱼进行目标荧光标记的筛选（表1）。将筛选后的幼鱼以最少体积的含三卡因E3溶液转移，并置于6孔板中恢复，直至成像前。 
	注意：双、三或四重转基因幼鱼的筛选耗时较长，应将幼鱼置于E3溶液中，并频繁更换6孔板中的培养液，以减少不必要的三卡因暴露。此外，此发育阶段的幼鱼易漂浮，应使用睫毛工具在不造成组织损伤的前提下调整其位置以进行筛选。</li>
	<li>筛选完成后，准备一个10 cm的培养皿，加入25 mL的1×三卡因-E3溶液。使用塑料巴斯德&#160;吸管将15–20条麻醉后的幼鱼转移至该培养皿中，继续麻醉5分钟。</li>
	<li>同时，在体视显微镜下，向损伤与固定装置（例如zWEDGI）的腔室中加入1×三卡因-E3溶液15,16。使用P200移液器去除腔室及固定通道&#160;中的气泡。移除多余的1×三卡因-E3溶液，仅保留足以充满腔室的体积。</li>
	<li>将一条麻醉后的幼鱼转移至zWEDGI的加载腔室中，并在体视显微镜下使用睫毛工具进行定位。轻敲幼鱼头部并推动，使其尾部进入固定通道。此外，可使用移液器从损伤腔室中吸出部分1×三卡因-E3溶液，以帮助幼鱼进入通道。确保幼鱼位置适合左叶成像——倒置显微镜：左侧朝下；正置显微镜：左侧朝上。 
	注意：若无zWEDGI装置，可将幼鱼固定于含1%低熔点琼脂糖的1×三卡因-E3溶液中，但琼脂糖浸没法仅适用于快速成像（不超过15分钟）。</li>
	<li>对于肝细胞及细胞核形态学分析，使用共聚焦显微镜配合40倍空气物镜，以2 µm光学切片进行Z轴层扫成像。对于肝脏形态、血管生成及免疫细胞募集实验，使用20倍空气物镜，以5 µm光学切片进行Z轴层扫成像。对于肝脏较大的幼鱼，应采集2 × 2拼接图像，以确保完整覆盖肝脏及其周围75 µm范围的区域。</li>
	<li>成像完成后，使用含1×三卡因-E3的塑料巴斯德&#160;吸管将幼鱼从固定通道&#160;中抽出，并转移至不含亚甲蓝的E3溶液培养皿中。</li>
</ol>
6. 肝脏形态学变异的分析。
注意：以下步骤用于肝脏表面积和体积的定量分析：
<ol>
	<li>打开成像软件。通过选择 Observe folder 图标，将包含待分析图像文件的文件夹添加到 Arena。接着，右键点击缩略图，选择 Convert to native Imaris file format，将文件转换为 .ims 格式。</li>
	<li>在 Surpass 子菜单中，调节每个通道的亮度和对比度。接着，通过点击蓝色的 Add new surfaces 按钮，创建肝脏的表面结构。</li>
	<li>在表面创建面板中，选择 Segment only a region of interest，以手动创建肝脏表面。</li>
	<li>点击 Skip automatic creation | Edit manually 选项。在场景面板中选择 Contour，并取消选择&#34;Volume&#34; 选项。 
	注意：必须取消选中 Volume 视图选项，否则将无法在不同的 z-stacks 中选择感兴趣区域。</li>
	<li>浏览&#160;z-stacks 层面，通过选择 Mode 并选取偏好的绘图模式，在每个平面上绘制感兴趣区域。开始绘图前，请将指针切换至 Select 模式而非 Navigate 模式，然后点击 Draw，拖动指针穿过肝脏以绘制 ROI。</li>
	<li>在不同焦平面选择 ROI 后，点击 Create a surface，合并所有选定的 ROI 并生成肝脏表面。</li>
	<li>接着，利用新创建的表面生成肝细胞信号的掩膜。点击该表面，在 Edit 选项卡（铅笔图标）下选择 Mask All。在弹出的窗口中，选择希望进行掩膜处理的通道，该通道将用于量化肝脏体积和表面积。然后，选择“将表面外的体素设为 0”，并在应用掩膜前勾选 Duplicate channel 选项。</li>
	<li>从统计分析菜单中获取肝脏表面积和体积数值用于后续分析。</li>
</ol>
注意：执行以下步骤以进行肝脏区域定量。
<ol start="9">
	<li>打开 Fiji 软件。在 Plugins 菜单中，选择 Bio-formats，然后选择 Bio-formats Importer，勾选 Split channels 选项以打开图像文件。</li>
	<li>在 Image 菜单中，选择 Properties，检查图像是否具有正确的像素尺寸和体素深度，若数值不正确，请进行调整。接着，进入 Images 菜单，点击 Adjust，然后选择 Brightness and Contrast，调节图像的亮度和对比度。</li>
	<li>接下来，使用肝细胞通道创建肝脏的最大强度投影。进入 Images 菜单，点击 Stacks，然后选择 Z Project，并选择 Maximum Intensity Projection。</li>
	<li>使用自由手绘选择工具，手动创建一个围绕幼虫肝脏的兴趣区域（ROI）。然后，在 Analyze 菜单中点击 Measure，以获取肝脏面积。将结果保存为电子表格，用于进一步分析。</li>
</ol>
7. 肝细胞及细胞核形态学分析。
<ol>
	<li>打开 Fiji 软件。在 Plugins 菜单中，选择 Bio-formats，然后选择 Bio-formats Importer，并勾选 Split channels 选项以打开图像文件。</li>
	<li>在 Image 菜单中，选择 Properties 以检查图像是否具有正确的像素尺寸和体素深度，若数值不正确，请进行调整。接着，进入 Images 菜单，点击 Adjust ，然后选择 Brightness and Contrast，调节图像的亮度和对比度。</li>
	<li>在 Analyze 菜单中选择 Set Measurements，并勾选所有需要分析的参数（例如：面积、周长和形态描述符）。选择肝细胞膜荧光通道。通过&#160;Z 轴切片浏览，使用自由手绘选择工具在单个肝细胞周围绘制精确的感兴趣区域（ROI）。接着，在 Analyze 菜单中点击 Measure ，以计算肝细胞的面积。</li>
	<li>对 15–30 个肝细胞重复步骤 7.3。将结果保存为电子表格，用于进一步分析。</li>
	<li>接着，选择细胞核荧光通道。通过&#160;Z 轴切片浏览，使用自由手绘选择工具在肝细胞核周围绘制精确的感兴趣区域（ROI）。接着，在 Analyze 菜单中点击 Measure ，以计算细胞核面积和圆形度。</li>
	<li>对 15–30 个肝细胞重复步骤 7.5。将结果保存为电子表格，用于进一步分析，包括核质比的定量分析。</li>
	<li>根据以下标准（表 3）对样本进行微核和核疝的评分。</li>
</ol>
8. 血管生成分析。
<ol>
	<li>按照本方案第6节所述，手动创建肝脏表面。将此表面命名为 &#34;肝脏表面&#34;。</li>
	<li>为肝脏内部的内皮细胞信号创建掩膜。点击表面，在编辑选项卡（铅笔图标）下选择全部掩膜。在弹出的窗口中，选择内皮细胞通道，以仅从肝脏中分离出血管信号。应用掩膜前，选择“将表面外的体素设为0”，并勾选复制通道选项。</li>
	<li>将新的内皮细胞掩膜通道重命名为肝脏血管系统。</li>
	<li>为测量血管体积和表面积，创建第二个表面。点击蓝色的添加新表面按钮。在表面创建的第一步中，确保所有选项均未选中，以自动创建表面。</li>
	<li>在第二步中，选择“肝脏血管系统”通道作为创建表面的基础。取消勾选平滑选项，以尽可能检测到更多血管细节，并在阈值设定选项中启用背景扣除。</li>
	<li>调整阈值，确保所检测的表面与肝脏血管系统的信号共定位。从统计分析菜单中获取表面积和体积数值。使用以下公式计算血管密度指数： 
	血管密度指数（按肝脏 µm2）=（血管表面积 (µm2)）/（肝脏表面积 (µm2)） 
	&#8203;血管密度指数（按肝脏 µm3）=（血管体积 (µm3)）/（肝脏体积 (µm3)）</li>
</ol>
9. 免疫细胞募集分析。
<ol>
	<li>打开 Fiji 软件。在 Plugins 菜单中，选择 Bio-formats，然后选择 Bio-formats Importer，并勾选 Split channels 选项以打开图像文件。</li>
	<li>在 Image 菜单中，选择 Properties，检查图像是否具有正确的像素尺寸和体素深度，若数值不正确，请进行调整。接着，进入 Image 菜单，点击 Adjust，然后选择 Brightness and Contrast，调节图像的亮度和对比度（例如：巨噬细胞 - mCherry 或 dTomato；中性粒细胞 - BFP；T 细胞 - EGFP；肝细胞 - EGFP 或 mCherry）。</li>
	<li>接下来，对每个通道创建最大强度投影（maximum intensity projections）。</li>
	<li>如第 6 节（步骤 6.9–6.12）所述，创建一个围绕幼鱼肝脏的感兴趣区域（ROI），并测量肝脏面积。再创建第二个 ROI，包含肝脏区域及周围 75 µm 的区域（&#34;招募区域&#34;）。</li>
	<li>接着，在 Edit 菜单中选择 Selection 选项，然后选择 Add to Manager。选择先天免疫细胞通道的最大强度投影图像，点击 ROI Manager 窗口中的肝脏 ROI，以设定 Recruitment area。</li>
	<li>在 Plugins 菜单中，选择 Analyze 选项，然后选择 Cell Counter，统计 Recruitment area 内的免疫细胞数量。将招募至肝脏区域的免疫细胞数量记录到电子表格中。</li>
	<li>通过将免疫细胞数量标准化为单位肝脏面积，计算中性粒细胞、巨噬细胞和 T 细胞的密度。</li>
</ol>

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<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose+leads+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+that+is+reversed+by+mechanistic+target+of+rapamycin+%28mTOR%29+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.</a> Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).</li>
<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+directly+induces+acute+inflammasome-dependent+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation.</a> Nature Communication. 5, 5864(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着肝细胞癌（HCC）发病率的上升，特别是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）诱导的HCC，建立更高效的模型以研究NASH相关HCC中涉及的细胞和分子机制显得尤为重要。解析肝脏内细胞间的相互作用对于深入理解肝病进展及肝癌发生机制至关重要。本方案所述方法为分析肝病进展提供了一种独特途径 体内 且无创地。
饮食制备对于成功建立与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）相关的肝细胞癌（HCC）模型至关重要。在为斑马鱼制备饮食时，必须在通风橱内让乙醚完全挥发，以避免产生有害影响。若将这些饮食用于幼体（受精后5-12天），必须将饲料研磨成细小颗粒，以确保幼体能够摄食，这一点极为重要。可使用荧光标记的脂肪酸类似物来评估幼体的摄食情况。
在将幼虫放入培养盒并开始喂养程序之前，必须通过混合来自不同培养板的幼虫来确保实验取样的均一性。此步骤至关重要，因为在每个培养板中自第0天起即形成了不同的微环境，这可能会影响炎症反应。
另一个重要步骤是统计幼虫数量，以确定每个饲养盒所需的饲料量。如果每个饲养盒中的饲料量不足以满足幼虫数量的需求，则会出现以下两种情况之一：1）幼虫进食不足；2）幼虫进食过量。喂养不准确会导致营养不良或营养过剩相关的不健康状况，例如炎症，这将显著影响肝脏微环境。如果出现喂养不准确的情况，幼虫会表现出运动异常。在此发育阶段，幼虫应剧烈游动，因此若观察到运动异常，则表明幼虫处于不健康的饲养条件（营养不良或因过度喂养而暴露于过量胆固醇）。因此，对于正常饮食和胆固醇富集饮食，喂养程序都必须严格控制。可通过一些检测快速评估喂养准确性和幼虫健康状况，包括是否存在肝肿大（肝脏大小）以及组织和器官（尤其是肝脏和肠道）的炎症（可见中性粒细胞和巨噬细胞浸润增加）。
每天清洁并更换95%的E3培养液，对于减少喂养盒中微生物的生长、提高幼鱼的健康和存活率至关重要。 alternatively，可将幼鱼置于独立的架子系统中。为获得最佳效果，建议在3升的水箱中放置60-80尾幼鱼。通过调节水流至快速滴流模式，并每天两次（上午和下午）每次投喂3-4 mg，将水流保持在最低水平。应定期检查水流，以确保每个水箱的水流正常。在本实验室中，采用此方法进行短期喂养10% HCD时，幼鱼存活率可达95-100%。此外，该方法显著降低了传统静态喂养方案中每日清洁和换水所需的工作量。
尽管我们采用含10%胆固醇的饮食在短期暴露（5天足以诱导脂肪性肝炎）下诱导NASH，但也可对饮食进行调整和扩展，例如添加果糖18、脂肪酸（如棕榈酸）19，或采用含4%胆固醇的饮食方案并延长喂养周期20。目前，针对肝细胞癌（HCC）的治疗靶点较少且疗效有限，而针对NASH则尚无有效治疗靶点。斑马鱼模型的运用不仅有助于拓展我们对肝癌发生机制的认识，还提供了一个无与伦比的脊椎动物系统，可用于高通量药物筛选。本实验方案中所描述的技术将有助于推动未来在肝病及肝癌发生领域的新发现和治疗靶点的开发。

肝细胞癌（HCC）是一种侵袭性强且治疗选择有限的癌症。研究发现，超过30%的HCC患者存在肥胖并伴有非酒精性脂肪性肝炎（NASH），而NASH是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的一种侵袭性形式1,2,3,4。高热量饮食的摄入显著增加了脂肪酸的可利用性，导致局部和全身性的代谢改变，并引发脂肪变性、肝细胞损伤、炎症和纤维化——这些均为NASH的关键特征。NASH向HCC的进展涉及肝脏中脂质的积累，从而触发炎症反应及免疫细胞组成的改变5,6,7。深入了解肝脏微环境和免疫细胞格局在肝病进展过程中如何发生变化，以及特定病因因素如何影响这些变化，具有特别重要的意义。为了更准确地识别胆固醇过剩对肝脏微环境和免疫细胞格局的影响，我们建立了一种独特的与NASH相关的HCC斑马鱼模型。该模型的应用使我们能够更深入地理解饮食和营养过剩对肝脏微环境及肝病进展的影响。
哺乳动物模型（如小鼠和人类组织样本）在理解脂肪性肝炎和脂肪变性的发病机制方面至关重要8。小鼠是肝脏疾病和癌症研究的首选模型，但其在细胞水平上缺乏光学通透性，而人类组织样本通常缺少动物模型所能模拟的三维环境。这些局限性使得斑马鱼成为研究领域中强有力的模型。斑马鱼与人类具有显著的相似性，基因保守性至少达70%。它们保留了肝脏微环境、肝细胞组成、功能、信号通路以及对损伤的反应能力9,10。通过结合高胆固醇饮食（HCD）与已建立的肝细胞癌转基因斑马鱼模型，我们开发出一种与NASH相关的肝细胞癌斑马鱼模型。
本文介绍了一种建立与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）相关的肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型的实验方案，并阐述了如何研究肝脏微环境及早期恶性病变特征。 体内利用非侵入性共聚焦显微镜结合肝细胞膜和细胞核荧光标记的转基因斑马鱼品系，可通过分析肝脏形态（面积、体积和表面积）、细胞及细胞核形态（肝细胞面积、细胞核面积、核质比、细胞核圆度、微核/核疝评分）以及血管生成（血管密度）来研究肝癌早期恶性特征。免疫细胞微环境在肝癌发生过程中同样具有重要意义。11,12,13,14因此，我们还展示了如何利用免疫细胞标记的转基因斑马鱼品系（中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞），分析NASH相关肝细胞癌幼鱼的肝脏免疫细胞组成。所述技术为此模型所独有，对于评估肝脏疾病进展过程中肝脏微环境及免疫细胞组成极为有用。

<table><tbody><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>易降解。需在 -20&amp;deg;C 下保存。</td></tr><tr><td>Corning Netwells 载体试剂盒 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Corning Netwells 插入式培养皿</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>高度挥发性。</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 5.75 英寸巴斯德吸管</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Golden Pearl 饮食 5&amp;ndash;50 nm 活性微球</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>-</td><td>可使用任何市售的幼虫干粉饲料。</td></tr><tr><td>带刻度移液管</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4，10X，10 包装</td><td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 100×20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 异丙醇 Oil Red O 溶液</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>用于幼虫收集的真空系统</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S9i 配透射照明底座</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>开源 Java 图像处理程序。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Bitplane；Oxford Instruments。</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌早期进展过程中肝脏微环境分析

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

肝癌目前是第三&#160;全球癌症相关死亡的主要原因，肝细胞癌（HCC）占所有肝癌病例的75-90%。随着有效治疗手段的出现以预防和治疗乙型/丙型肝炎，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及其更具侵袭性的形式——非酒精性脂肪性肝炎（NASH）正迅速成为现代社会中发展为HCC的首要风险因素。为了更好地理解NASH在HCC发生中的作用，我们构建了一种与NASH相关的HCC斑马鱼模型。斑马鱼幼体具有光学通透性和良好的遗传可操作性，使其成为利用无创荧光活体成像研究肝脏微环境及免疫细胞组成的理想且强大的模型。本实验方案描述了如何利用与NASH相关的HCC斑马鱼模型，研究胆固醇过量对肝脏微环境的影响，以及其在疾病早期阶段对免疫细胞组成的作用。首先，我们给予表达肝细胞特异性激活型β-catenin的HCC幼鱼（s704Tg）10%高胆固醇饮食，持续8天，以建立与NASH相关的HCC模型。本文详细介绍了如何利用不同的转基因品系，通过无创共聚焦显微镜评估肝脏中多种早期恶性特征，包括肝脏面积、细胞及细胞核形态（肝细胞面积、细胞核面积、核质比（N:C比）、细胞核圆度、微核/核疝评分）以及血管生成情况。随后，利用标记了免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞）的转基因品系，展示如何分析与NASH相关的HCC幼鱼中肝脏免疫细胞的组成。所描述的技术可用于评估肝癌早期阶段的肝脏微环境和免疫细胞组成，也可根据需要进行调整，用于研究其他肝脏疾病模型中的类似特征。

关键词：肝细胞癌，非酒精性脂肪性肝炎，斑马鱼，胆固醇，肝脏微环境，免疫细胞组成，共聚焦显微镜，转基因模型

通过在肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型中引入短期高胆固醇饮食，该模型过表达一种肝细胞特异性的组成型激活形式的β-连环蛋白（s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17），我们能够建立一种与NASH相关的HCC非哺乳脊椎动物模型。可通过检测肝脂肪变性、肝脏大小、肝细胞及细胞核形态、血管生成以及免疫细胞浸润等指标，早期监测肝脏疾病的进展（图1）。
以正常饮食喂养的HCC幼鱼，通过油红O染色检测显示无或轻度肝脂肪变性。然而，以高胆固醇饮食喂养的HCC幼鱼则表现出显著增加的肝脂肪变性（图2）。
肝病的一个公认标志是肝肿大17。为评估肝脏大小，可将HCC幼鱼与一种在肝细胞中特异性表达荧光标记物的转基因品系（如Tg(fabp10a:H2BmCherry)）进行杂交。为评估肝肿大，需对肝脏面积（二维）、肝脏表面积以及肝脏体积（三维）进行分析。在暴露于过量胆固醇8天后，HCC幼鱼中观察到肝脏增大（图3）。
利用非侵入性活体成像技术，可通过表达肝细胞膜荧光蛋白（如 Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP)）和肝细胞核荧光蛋白（如 Tg(Fabp10a:H2B-mCherry)）的转基因鱼系，评估肝细胞恶性转化过程中细胞形态和细胞核形态的改变。在与NASH相关的肝细胞癌中，肝细胞面积增大（图4A、B、D），细胞核面积（图4C、E）以及核质比（图4F）也增加。HCD+HCC组还观察到细胞核圆度显著降低（图4G）。脂毒性可引发DNA损伤，这是伴有微核出现的癌变特征之一。利用H2B-mCherry标记物，我们发现饲喂高胆固醇饮食的HCC幼鱼中微核发生率更高（图4H）。
可以利用转基因标记的斑马鱼品系（例如 Tg(kdrl:mCherry) 或 Tg(fli1:EGFP)，这些品系可标记血管系统）对肝脏血管系统进行简便的评估。在肝细胞癌合并高胆固醇饮食（HCC+HCD）的幼鱼中观察到血管密度显著增加（图5）。
为了观察非酒精性脂肪性肝炎相关肝细胞癌（NASH-associated HCC）早期引发的炎症反应，将表达巨噬细胞和中性粒细胞荧光蛋白的转基因鱼系（例如 Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP)）与肝细胞癌（HCC）转基因鱼系进行杂交。在HCC以及饲喂高胆固醇饮食（HCD）的HCC中均观察到中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，通过定量肝脏及其周围区域（邻近区域，范围达75µm）内中性粒细胞/巨噬细胞的数量和密度进行评估（图6A-H）。然而，HCC+HCD组显示出中性粒细胞数量和密度显著增加（图6F-H）。在受精后13天，适应性免疫系统已具备功能。利用在T细胞中表达荧光蛋白的转基因鱼系（例如Tg(lck:EGFP)），结合HCC转基因鱼系，我们评估了胆固醇过量对T细胞向肝脏募集的影响。结果显示，饲喂高胆固醇饮食的HCC幼鱼中，T细胞密度和总数均显著降低（图6I-K）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>转基因斑马鱼品系</td>
			<td>ZFIN 参考文献</td>
			<td>检测法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casper</td>
			<td>roya9; mitfaw2</td>
			<td>肝脂肪变性osis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>肝脏形态学</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>肝细胞与细胞核形态学</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>血管生成</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; mfap4:Tomato-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>巨噬细胞与中性粒细胞募集</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>T细胞招募</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在不同实验中使用的转基因斑马鱼品系。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>幼虫数量</td>
			<td>饲养盒尺寸</td>
			<td>每日食物量（mg）</td>
			<td>E3 体积（ml）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-40</td>
			<td>小型繁殖盒</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-80</td>
			<td>小型/大型繁殖盒</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-150</td>
			<td>大型繁殖盒</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：饲喂箱的设置条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>表型</td>
			<td>评分方法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无</td>
			<td>正常细胞核，无微核或核突出</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>轻度</td>
			<td>微核数量较少（每视野少于5个）和/或存在核突出</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中度/重度</td>
			<td>微核数量中等至较多（每视野多于5个）和/或存在核突出</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：微核与核突出评分。
<img alt="斑马鱼肝脏分析工作流程；成像、形态学、血管生成、免疫细胞过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：实验流程图，概括主要实验步骤与分析方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞癌实验；氧化应激示意图、移液器、组织学图像、脂肪变性图表、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：肝脏脂肪变性的对照实验——油红O染色。 将HCC幼虫饲喂正常或高胆固醇饮食，并进行油红O（ORO）染色以评估肝脂肪变性。(A) 使用网格孔插入物进行连续油红O染色的12孔板示意图。(B) 用于操作幼虫的睫毛工具图像。(C) 经油红O染色的肝脏代表性图像；HCC和HCC+HCD幼虫。(D) 卡方图显示具有不同肝脏脂肪变性评分的幼虫百分比。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞分析；肝脏区域、表面积、体积图；HCC与HCC+HCD比较；显微镜观察，数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：肝脏大小的代表性图像。 在倒置式旋转盘共聚焦显微镜上利用 zWEDGI 技术，对表达肝脏标记物（Tg(fabp10a:H2B-mCherry)）的转基因 HCC 幼鱼进行活体、非侵入性成像。(A) HCC 与 HCC+HCD 幼鱼肝脏的代表性三维重建图像。(B-D) 显示 HCC 与 HCC+HCD 幼鱼肝脏形态学变化的图表，包括肝脏面积 (B)、肝脏表面积 (C) 和肝脏体积 (D)。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="肝细胞显微图像，F-肌动蛋白（白色），细胞核（品红色）分析，肝细胞核面积图表，HCC 与 HCC+HCD 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：肝细胞及细胞核形态的代表性图像。对在肝细胞膜（Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP)）和肝细胞核（Tg(fabp10a:H2B-mCherry)）中表达荧光蛋白的转基因 HCC 系进行了成像。（A-C）HCC 和 HCC+HCD 幼鱼中 F-肌动蛋白和肝细胞核的代表性三维重建图像。空心箭头示增大的细胞核；白色箭头示形态改变的细胞核；红色箭头示微核和核疝。（D-G）显示 HCC 和 HCC+HCD 13 日龄幼鱼中细胞和细胞核参数平均值的图表。（D）肝细胞面积。（E）细胞核面积。（F）核质比。（G）细胞核圆形度。每个点代表每条幼鱼的平均值。点图显示均值 ± 标准误（SEM）。（H）卡方图，显示具有不同微核和核疝评分的幼鱼百分比。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞癌血管密度比较，显微镜图像及显示肝脏密度指数的图表（p&lt;0.0001）。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：肝血管系统的代表性图像。 转基因肝细胞癌（HCC）品系在肝细胞核中表达荧光蛋白（Tg(Fabp10a:H2B-mCherry)），在内皮细胞中表达荧光蛋白（Tg(fli:EGFP)）。(A) HCC 和 HCC+HCD 幼鱼中肝血管系统的代表性三维重建图像。(B-C) 图表显示 HCC 和 HCC+HFCD 幼鱼肝脏表面积（B）和体积（C）的血管密度指数。点状图显示均值 ± 标准误（SEM）。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫荧光、肝脏中巨噬细胞与中性粒细胞密度，肝细胞癌 vs 肝细胞癌合并高胆固醇饮食，图表与显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6肝脏免疫细胞图谱的代表性图像。 表达荧光蛋白的转基因肝细胞癌系：在巨噬细胞和中性粒细胞中表达（Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP)），或在T细胞中表达（Tg(lck-EGFP)）。A、C、F) 13天龄HCC及HCC+HCD幼鱼肝脏的代表性三维重建图像及其肝脏区域白细胞募集情况。B) 成像肝脏区域示意图。D-E) 显示巨噬细胞密度的曲线图（D）和数量（E) 在肝细胞癌（HCC）及HCC合并肝细胞发育不良（HCD）幼鱼的肝脏区域。G-H) 图显示肝细胞癌（HCC）及 HCC+HCD 幼鱼肝脏区域中性粒细胞密度（G）和数量（H）。G) 肝细胞癌（HCC）及 HCC+HCD 幼鱼肝脏区域 T 细胞募集的代表性三维重建图像。H-I) T细胞密度图示（H）和数量（I肝区HCC及HCC+HCD幼鱼中的)。点图显示均值±标准误。比例尺 = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表1：缓冲液与溶液表 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍了如何构建与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型，以研究胆固醇过量对肝脏微环境及免疫细胞格局的影响。

肝癌目前是全球癌症相关死亡的第三大原因，其中肝细胞癌（HCC）占所有肝癌病例的75–90%。

我们的斑马鱼肝癌模型及实验方案提供了一个独特的机会，可利用活体显微成像技术非侵入性地在活体中可视化肝脏微环境及免疫格局。斑马鱼幼体的透明性无疑是该系统的主要优势，使我们能够进行非侵入性的活体显微观察，深入了解肝脏等深层组织和器官的微环境以及免疫细胞的浸润情况。本方案中所述的饮食诱导肾病模型及成像技术可轻松应用于其他肝脏疾病或研究领域中复杂的细胞间相互作用，包括代谢综合征和心血管疾病。进行该实验操作的是我们的实验室技术员 Cassia Michael，以及我实验室的博士后研究员 Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro。首先，将四克商品化斑马鱼幼鱼干饲料分别称量至两个 25 毫升的玻璃烧杯中，其中一个用于正常饮食组，另一个用于 10% 高胆固醇饮食组（HCD）。再称取 0.4 克胆固醇至一个 10 毫升的玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。 在通风橱中，使用带20号针头的10毫升注射器量取5毫升乙醚。然后将乙醚加入正常饮食烧杯中，并立即用刮勺与干燥食物混合。使用同一注射器和针头再量取5毫升乙醚，加入含HCD的烧杯中。立即用注射器反复抽吸以充分混匀。迅速将胆固醇溶液加入HCD烧杯中，并立即用刮刀搅拌至溶液均匀。将烧杯置于通风橱中静置最多24小时，以使乙醚完全蒸发。第二天，使用研钵和研杵将饲料研磨成细小颗粒。将每种饲料转移至已标记的小型塑料袋或50毫升离心管中，并于-20 °C条件下保存。在实验开始前一日建立转基因鱼系。在第0天，鱼类产卵后，使用网筛收集卵。用装有E3培养基的洗瓶彻底冲洗卵，并小心地将其转移至含有E3培养基的10厘米培养皿中。清除繁殖盒中可能积聚的所有碎片，包括任何死亡或未受精的卵，以防止微生物不受控制地生长，从而避免导致幼虫发育异常。然后将卵以每皿70至80枚的密度分配至含有25毫升E3培养液的培养皿中。第一天，在配备透射光源底座的解剖显微镜下检查并清除死亡的胚胎或具有发育缺陷的胚胎。第五天，将所有培养皿中的幼鱼收集至一个15厘米的培养皿中，并加入不含亚甲蓝的E3培养液。将幼鱼分至饲养盒中，并按照文稿中所述方法进行喂养。将幼鱼置于28摄氏度的斑马鱼饲养室或培养箱中，在明暗循环条件下饲养，并从第5天至第12天每天喂食两次。每天使用连接1毫升移液器吸头的真空系统清除食物残渣以及90%至95%的培养液。然后，小心地将不含亚甲蓝的新E3培养基倒入饲养盒的一角，以避免损伤幼鱼。或者，可将幼虫分装至装有系统用水的三升水箱中，并作为独立的系统单元放置，保持较低的水流速度。此替代方案可节省每日清洁所需的时间，且过滤系统有助于在实验终点前维持幼虫的健康状态。第13天时，根据所设置的实验条件数量准备相应的收集皿。倒入足量不含亚甲蓝的E3培养液，以覆盖每个培养皿的底部。然后，使用真空系统小心抽吸喂养盒中的水。当水位开始降低时，缓慢抬起喂养盒，使幼鱼游向其中一个角落，随后从相反方向进行抽吸。当液体剩余约 20 至 30 毫升时，小心地将幼虫倾倒入已准备好的收集培养皿中，并将取自饲养盒的标签胶带贴在培养皿盖上。在荧光体视显微镜下，筛选麻醉后的幼虫以确认所需的荧光标记。然后向损伤与捕获装置的腔室中加入三卡因 E3。使用 P-200 微量移液器去除腔室和限制通道中的气泡。移除所有多余的三卡因 E3 溶液，仅保留足以充满腔室的液体体积。接着，将一条麻醉后的幼鱼转移至损伤与捕获装置的加载腔室中，并使用睫毛工具将其定位，以便对左叶进行成像。按照文本稿件中的描述，在共聚焦显微镜下观察肝脏中所有所需细胞的形态。打开 Fiji 软件，然后打开图像文件，并在 Bio-Format 导入选项选项卡中勾选“拆分通道”选项。对每个通道创建最大强度投影后，绘制围绕幼鱼肝脏的感兴趣区域（ROI），并测量肝脏面积。随后添加比例尺作为参考，并创建第二个ROI，包含肝脏区域及周围75微米的范围。在“插件”（Plugins）菜单中，选择“分析”（Analyze）选项，接着选择“细胞计数器”（Cell Counter），对招募区域内的免疫细胞进行计数。在电子表格中记录招募的免疫细胞数量。通过将免疫细胞数量标准化为每单位肝脏面积，计算中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞的密度。经油红O染色检测，以正常饮食喂养的肝细胞癌斑马鱼幼鱼未出现肝脂肪变性。然而，以高胆固醇饮食（HCD）喂养的HCC幼鱼表现出明显的肝脂肪变性增加。在暴露于过量胆固醇八天后，观察到HCC幼鱼出现肝脏肿大。为评估肝肿大，检测了肝脏面积、肝脏表面积和肝脏体积。在非酒精性脂肪性肝炎相关的肝细胞癌中，肝细胞面积、细胞核面积以及核质比均增加。在高脂饮食喂养的肝细胞癌组中，还观察到细胞核圆形度显著降低。利用H2B-mCherry标记，在饲喂高胆固醇饮食的肝细胞癌幼虫中检测到更高的微核发生率。肝脏血管评估显示，饲喂高胆固醇饮食（HCD）的肝细胞癌（HCC）幼鱼血管密度显著增加。在HCC幼鱼以及饲喂HCD的HCC幼鱼中均观察到巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。对肝脏及其周围区域巨噬细胞内中性粒细胞的定量分析表明，饲喂HCD的HCC幼鱼中这些细胞的数量和密度均显著增加。相比之下，在喂食高胆固醇饮食（HCD）的HCC幼鱼中观察到T细胞密度在总体数量上显著下降。保持水箱清洁和喂养是确保幼鱼存活率的最重要步骤，可避免因水质不佳或喂养不当导致对照组出现脂肪变性或肝脏及全身性慢性炎症。还可进行其他方法，如延时显微成像以及分析定植于肝脏的不同细胞之间的相互作用。此外，可对处于不同肝癌阶段的分离肝脏进行单细胞RNA测序，以全面了解肝脏免疫微环境如何随疾病进展而演变。

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