斑马鱼非酒精性脂肪肝相关肝细胞癌早期进展期间的肝脏微环境分析

在这里，我们介绍了如何生成非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型，以研究胆固醇过剩对肝脏微环境和免疫细胞景观的影响。

我们的斑马鱼肝癌模型和方案提供了一个独特的机会，可以使用活体显微镜在体内非侵入性地可视化肝脏微环境和免疫景观。斑马鱼幼虫的透明度无疑是该系统的主要优势，它使我们能够进行非侵入性活体显微镜检查，并深入了解深层组织和器官（如肝脏）的微环境和免疫细胞浸润。我们的饮食诱导肾病模型和本协议中描述的成像技术可以很容易地应用于其他肝脏疾病或研究领域（包括代谢综合征和心血管疾病）中错综复杂的细胞 - 细胞相互作用。

演示该程序的将是我们的实验室技术员Cassia Michael和我实验室的博士后Francisco Juan Martinez-Navarro博士。首先，将四克斑马鱼幼虫的商业干粮饮食称重到两个 25 毫升的玻璃烧杯中，一个用于正常饮食，另一个用于 10% 高胆固醇饮食或 HCD。在 0.4 毫升玻璃烧杯中称取 10 克胆固醇，并用箔纸覆盖烧杯。

在通风橱中，使用带有 10 号针头的 10 毫升注射器测量 5 毫升乙醚。然后，将乙醚加入普通减肥烧杯中，并立即用刮刀将其与干粮混合。使用相同的注射器和针头再测量五毫升乙醚，并将其添加到含有HCD的烧杯中。

用注射器上下吸气立即混合。快速将胆固醇溶液添加到HCD烧杯中，并立即用刮刀混合，直到溶液均匀。将烧杯留在引擎盖中长达 24 小时，以完全蒸发乙醚。

第二天，用研杵和研钵将饮食研磨成细颗粒。将每种饮食转移到一个小的，有标签的塑料袋或50毫升的离心管中，并将它们储存在零下20摄氏度。在减一日建立转基因鱼线。

在零天，在鱼产卵后将卵收集在网状过滤器中。使用装有E3的洗涤瓶彻底冲洗鸡蛋，并小心地将它们转移到带有E3培养基的10厘米培养皿中。清洁盘子中可能积聚在繁殖箱中的所有碎屑，包括任何死亡或未受精的卵，以避免微生物不受控制的生长以及随之而来的幼虫发育缺陷。

然后以每道含有 70 毫升 E3 的 80 或 80 个鸡蛋的密度将鸡蛋分成。在第一天，在配备透照底座的解剖镜下检查和清洁死亡胚胎或有发育缺陷的胚胎。在第五天，将所有培养皿中的幼虫混合在 15 厘米的培养皿中，并加入不含亚甲蓝的 E3。将幼虫分入喂食箱中，并按照文本手稿中的说明喂食它们。

将幼虫放在斑马鱼室或28摄氏度的孵化器中，以暗光循环，从第5天到第12天每天喂食两次。每天使用连接到一毫升移液器吸头的真空系统清除食物残渣以及 90% 至 95% 的培养基。然后，小心地将不含亚甲蓝的新E3倒入喂食箱的一角，以免损坏幼虫。

或者，可以将幼虫分成装有系统水的三升水箱中，并作为具有低水流量的独立系统单元放置。这种替代方案节省了日常清洁过程所需的时间，过滤系统有助于保持幼虫的健康直到终点。在第13天，根据设置的实验条件数量准备收集盘。

倒入足够的不含亚甲蓝的E3，以覆盖每个盘子的底部。然后，小心地使用真空系统从喂食箱中吸出水。当水位开始变低时，慢慢抬起喂食箱，使幼虫游到其中一个角落，然后向相反方向吸气。

一旦只剩下约20至30毫升的液体，小心地将幼虫倒入准备好的收集培养皿中，并将喂食盒中的标记胶带放在培养皿的盖子上。在荧光立体显微镜上，筛选麻醉的幼虫以获得所需的荧光标记物。然后将三卡因E3加入伤和卡压装置的腔室中。

使用 P-200 微量移液器从腔室和约束通道中去除气泡。去除所有多余的三卡因E3，只留下足够的体积来填充腔室。接下来，将麻醉的幼虫转移到伤人和卡压装置的加载室中，并使用睫毛工具将其定位以进行左叶成像。

如文本手稿中所述，在共聚焦显微镜下对肝脏中所有必需细胞的形态进行成像。打开斐济软件。然后打开图像文件并勾选 分割通道 生物格式导入选项选项卡中的选项。

为每个通道创建最大强度投影后，围绕幼虫肝脏创建ROI并测量肝脏面积。然后，添加一个比例尺作为参考，并创建第二个ROI，包括肝脏区域和周围区域的75微米。在插件菜单中，选择分析选项，然后选择细胞计数器并计数募集区域内的免疫细胞。

在电子表格上记录招募的免疫细胞数量。通过标准化每个肝脏区域的免疫细胞数量来计算中性粒细胞、巨噬细胞和 T 细胞密度。用正常饮食喂养的HCC斑马鱼幼虫没有肝脂肪变性，通过油红O染色测量。

然而，用HCD喂养的HCC幼虫显示肝脂肪变性显着增加。暴露于胆固醇过剩八天后，在HCC幼虫中观察到肝脏肿大。为了评估肝肿大，评估了肝脏面积、肝脏表面积和肝脏体积。

在非酒精性脂肪性肝炎相关肝细胞癌中，肝细胞区、核区和核质比增加。在高脂肪饮食喂养的HCC组中也观察到核循环性显着降低。使用H2B-mCherry标记，在喂食HCD的HCC幼虫中检测到更高的微核发生率。

肝血管系统评估显示，喂食HCD的HCC幼虫的血管密度显着增加。巨噬细胞和中性粒细胞的浸润发生在HCC和用HCD幼虫喂养的HCC中。肝脏及其附近巨噬细胞中嗜中性粒细胞的定量显示，用HCD喂养的HCC幼虫中细胞的数量和密度显着增加。

相比之下，在喂食HCD的HCC幼虫中观察到T细胞总数的显着降低。水箱的清洁和喂食是确保幼虫存活能力的最重要步骤，并避免由于水质差或喂养不当而导致脂肪变性或肝脏和全身慢性炎症的发展。可以进行其他方法，例如延时显微镜和填充肝脏的不同细胞之间的相互作用分析。

此外，可以对不同肝癌阶段的解剖肝脏进行单细胞RNA搜索，以充分了解肝脏免疫景观如何随着疾病进展而演变。