从Xenopus早期胚胎中分离单个细胞并按大小分选
2026年3月20日
我们描述了一种从Xenopus laevis早期胚胎中分离单个细胞并根据细胞大小进行分选的方法。
我们的研究聚焦于细胞大小如何调控早期胚胎发育中的基因组和硫酸盐相关决策。现有方法忽略了早期非洲爪蟾胚胎中细胞大小的异质性。本方案可实现按细胞大小进行精确的物理分离与分选。
首先，在一个新的、涂有1.5% AGROS凝胶的60毫米培养皿中加入约15毫升CMFM。使用塑料移液管，将10至100个非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎转移至培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下。
用一把镊子小心夹住胚胎表面的卵黄膜，用另一把镊子将其剥离，注意避免损伤胚胎。将去卵黄膜的胚胎在室温下于CMFM中孵育1小时。
每五分钟轻轻摇晃培养皿一次，以促进细胞解离。定期检查，直至显微镜下无成堆的卵裂球可见。在卵裂球解离过程中，将40微米、70微米和100微米的细胞滤网分别浸入盛有CMFM的培养皿中。
按照指定顺序从左到右排列培养皿。在各组之间放置两个额外盛有 CMFM 的培养皿，用于分选过程中滤网的短暂清洗。现在轻轻晃动含有分离的单个卵裂球的培养皿，使其在中央富集。
然后小心地将卵裂球转移至浸没在 CMFM 中的 40 微米滤网中。轻轻晃动滤网数次，使小于 40 微米的卵裂球通过滤网。迅速将滤网移至盛有 CMFM 的培养皿中进行短暂清洗。
然后小心地将滤网中保留的卵裂球转移至70微米滤网中。使用逐渐增大的滤网重复分选步骤，直至卵裂球被收集在100微米滤网中。轻轻旋转每个含有已分选卵裂球的培养皿，使卵裂球富集于中央。
然后，小心地将约四毫升的卵裂球转移至含有0.5毫升15%密度梯度介质的荧光激活细胞分选管顶部，避免混匀。10分钟后，完整的卵裂球将因重力作用沉降至管底，从而与破裂卵裂球释放的卵黄颗粒分离。未分选的对照样本以及按大小分选的单个卵裂球经固定后，在明场显微镜下进行成像观察。
分选后的卵裂球在其各自预期范围内的大小分布较窄，与未分选的对照组卵裂球相比更为均一。小于40微米组的平均直径约为33微米；40至70微米组的平均直径约为55微米，而大于70微米组的平均直径约为91微米。
本方案使研究人员能够研究由细胞大小介导的功能和机制。本方案最重要的注意事项是小心处理解离的细胞，因为它们较为脆弱。完成本方案后，分选的细胞可用于细胞周期分析、单细胞测序以及共聚焦成像。
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概述
本方案展示了一种根据细胞大小从非洲爪蟾早期胚胎中分离和分选单个细胞的方法。该技术克服了现有方法忽略细胞大小异质性的局限，有助于开展发育过程中与细胞大小相关功能的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 胚胎学
背景
- 细胞大小是早期胚胎发育的关键因素。
- 现有实验方案未能充分考虑胚胎在大小上的差异。
- 按细胞大小进行分离有助于深入理解发育机制。
- 该方法可实现细胞的精确物理分离。
研究目的
- 提供一种从胚胎中分离单个细胞的可靠方法。
- 实现基于细胞大小的分选，以便进行后续分析。
- 促进关于细胞大小在发育生物学中意义的研究。
使用的方法
- 使用CMFM和AGROS凝胶进行胚胎操作。
- 利用尺寸特异性滤网对卵裂球进行物理分离。
- 采用荧光激活细胞分选技术进行后续分析。
- 小心操作脆弱的解离细胞。
主要结果
- 经分选的卵裂球表现出较窄的尺寸分布。
- 记录了不同尺寸组别的平均直径。
- 该方案可有效分离完整的卵裂球与卵黄颗粒。
- 分选后的细胞可用于多种下游应用。
结论
- 本方案为研究细胞大小效应的研究人员提供了一种有价值的工具。
- 它增强了在发育背景下分析单个细胞的能力。
- 谨慎操作对于维持细胞完整性至关重要。
常见问题
行业重要性概述
从非洲爪蟾早期胚胎中精确分离并基于细胞大小进行单细胞分选，可揭示早期发育过程中依赖于细胞大小的调控机制。该技术填补了细胞大小异质性如何影响发育命运决定这一关键认知空白，有助于提高靶点验证的预测可信度，并降低机制研究中的风险。该方法为生成标准化、大小均一的细胞群体提供了可扩展的平台，适用于后续的发现性研究及转化研究工作流程。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够研究细胞大小对发育通路和基因组调控的功能性影响。
- 通过将细胞大小作为假设检验中的独立变量进行分离，支持机制层面的风险评估。
- 提供均一的细胞群体用于通路解析，从而促进生物学靶点的验证。
筛选与检测方法开发
- 生成经过验证、尺寸明确的单细胞悬液，用于可重复的检测方法开发。
- 通过在筛选平台中控制细胞尺寸异质性，提高检测标准化水平。
- 实现对尺寸依赖性表型的定量测量，以进行可靠的化合物评估。
转化与临床前研究
- 为研究与早期发育相关的尺寸依赖性调控机制提供了一个模型系统。
- 通过支持单细胞测序和成像等下游应用，实现了从发现到临床前验证的连续性。
- 通过阐明细胞大小在发育结果中的作用，有助于基于风险评估推进研发决策。
流程与工作流整合
该方案可融入从早期假设验证到检测方法开发及转化研究的整个发现流程，能够实现基于细胞大小的机制研究，并为下游分析提供标准化的细胞制备方法。
- Discovery Biology：支持细胞大小效应的假设验证，并阐明发育通路。
- Screening：提供可重复、大小定义明确的细胞群体，适用于检测准备和定量分析。
- Analytics：实现对细胞大小分布的精确测量，并支持不同实验条件间的统计学比较。
- Translational Research：通过支持分选后活细胞的分析、测序和成像，与临床前研究流程相衔接。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的标准化细胞群体生成方案，适用于多个研究项目的跨平台应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高发育学研究中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：为多样化的研发应用提供标准化、可重复且可扩展的细胞分选。
- 战略价值：通过明确尺寸依赖性生物学风险，提升决策质量与资本使用效率。
- 组合影响：实现基于风险调整的发现阶段项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备胚胎操作和单细胞解离方面的专业知识。
- 需要具备体视显微镜、细胞筛以及成像或测序基础设施的使用条件。
- 需要不同团队之间进行严格的标准化，以确保尺寸分选的可重复性。
- 针对不同的模式系统或发育阶段，可能需要进行方法优化。
- 细胞脆弱性和操作敏感性是本实验方案中强调的实际限制因素。
