Name: 从非洲 爪蟾 早期胚胎中分离单细胞并按大小分类 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: 学习从非洲爪蟾早期胚胎中分离单细胞并按大小分类的方法，用于发育生物学研究。该技术通过物理分离实现精确分选，为细胞大小相关功能研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢宾夕法尼亚大学Matthew Good实验室提供的培训。本工作部分由尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发育研究所（R03HD105802）资助。

本文所述动物实验已获得南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 溶液配制
注意：在开始实验方案之前，准备好以下溶液。
<ol>
	<li>配制 20× MMR：混合 100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl₂2，以及 40 mM CaCl2用 NaOH 调节 pH 至 7.8。高压灭菌后室温保存。</li>
	<li>制备 Ca2+，Mg2+无血清培养基（CMFM）：混合 50.3 mM NaCl、0.7 mM KCl、9.2 mM Na2HPO4，0.9 mM KH2PO4，2.4 mM NaHCO₃3，以及 1.0 mM EDTA。必要时调节 pH 至 7.4。高压灭菌后室温保存。</li>
	<li>在60 mm培养皿中制备1.5%琼脂糖凝胶：将0.75 g琼脂糖加入50 mL CMFM中，用微波炉加热至完全溶解。取5–10 mL琼脂糖溶液倒入60 mm培养皿，均匀覆盖形成薄层。</li>
	<li>配制15%密度梯度介质（wt/vol）/CMFM：将15 g密度梯度介质缓慢加入100 mL CMFM中。为促进溶解，置于加热板上加热并搅拌，直至密度梯度介质完全溶解。溶液于4 °C保存，待用。</li>
	<li>配制 4% PFA/1× MEM：取 1 瓶（10 mL）16% 多聚甲醛储备液与 4 mL 10× MEM（1000 mM MOPS，pH 7.4，20 mM EGTA 和 10 mM MgSO₄）混合4加入超纯水至40 mL。 
	注意：为了获得 非洲爪蟾 胚胎，遵循标准方案进行 体外 体外受精（IVF）（例如，参见 Sive 等，2007）10胚胎应置于预冷的0.1× MMR溶液中备用。</li>
</ol>
2. 将早期胚胎解离为单个细胞
<ol>
	<li>向一个涂有1.5%琼脂糖凝胶的新60 mm培养皿中加入约15 mL CMFM。使用塑料移液管将10–100个胚胎（根据实验需求）转移至培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下。</li>
	<li>用双手各持一把镊子，小心去除卵黄膜：用一把镊子夹住胚胎表面的卵黄膜，另一把镊子将其轻轻剥离。操作过程中避免损伤胚胎。</li>
	<li>将去卵黄膜的胚胎在CMFM中于室温孵育约1小时。每5分钟轻轻摇动培养皿一次，以促进细胞解离。定期观察，直至不再见到成堆的卵裂球（图1）。</li>
</ol>
3. 按细胞大小对解离后的细胞进行分选
<ol>
	<li>进行卵裂球解离时，将细胞筛（40 µm、70 µm 和 100 µm）分别浸入盛有 CMFM 的培养皿中（图2）。按照图示从左到右的顺序放置培养皿。在每组之间再额外放置两个盛有 CMFM 的培养皿，用于每次分选过程中对细胞筛进行短暂清洗。</li>
	<li>轻轻晃动含有分离后单个卵裂球的培养皿，使其富集于皿中央。小心地将卵裂球转移至盛有 CMFM 的 40 µm 筛中。</li>
	<li>轻轻振荡筛子数次，使直径 &#60; 40 µm 的卵裂球通过筛孔。随后迅速将 40 µm 筛转移至盛有 CMFM 的培养皿中进行短暂清洗。小心地将保留在 40 µm 筛上、直径 &#62; 40 µm 的卵裂球转移至 70 µm 筛中。</li>
	<li>重复上述步骤，直至卵裂球被分选至 100 µm 筛中。</li>
	<li>轻轻晃动每个含有已分选卵裂球的培养皿，使其富集于皿中央。小心地将卵裂球（约 4 mL）转移至流式细胞分选（FACS）管中，加在 0.5 mL 15% 密度梯度介质的液面上方（图3）。避免混合。</li>
	<li>静置试管 10 分钟。完整的卵裂球将因重力作用沉降至管底，而破裂卵裂球释放出的卵黄颗粒则与之分离（图3）。</li>
	<li>根据后续实验目的，可进行活细胞分析，或将卵裂球在液氮中冷冻保存用于 RNA 相关实验，或对卵裂球进行固定以用于免疫染色（图3）。</li>
</ol>

<ol><li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology.+On+being+the+right+%28cell%29+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell biology. On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075(2015).</li>
<li>Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+cell+size+control+and+its+relation+to+biosynthesis+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).</li>
<li>Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+cell+size+regulation+and+its+implications+for+cellular+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction.</a> Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).</li>
<li>Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterning+of+zygotic+genome+activation+in+a+model+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo.</a> Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).</li>
<li>Hubatsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+size+threshold+limits+cell+polarity+and+asymmetric+division+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential.</a> Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).</li>
<li>Fung, H. F., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+follows+form%3A+How+cell+size+is+harnessed+for+developmental+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions.</a> Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).</li>
<li>Chen, H., Qian, W., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+cellular+dimensions+with+cell+differentiation+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development.</a> Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).</li>
<li>Clute, P., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+appearance+of+division+asynchrony+and+microtubule-dependent+chromosome+cycles+in+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos.</a> Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).</li>
<li>Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+cloning+and+differential+screening+of+RNAs+from+Xenopus+primordial+germ+cells%3A+Cloning+uniquely+expressed+RNAs+from+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells.</a> Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+in+vitro+fertilization+and+natural+mating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争利益。

细胞大小对细胞功能具有根本性的重要意义3，其对早期发育的影响需要在模式胚胎系统中进行更深入的探究。本文详细描述了从Xenopus laevis早期胚胎中分离单个细胞，并利用细胞筛网按大小对细胞进行分选的方法，该方法可能适用于细胞大小相关研究。本方法使我们能够提供在早期胚胎发生过程中由细胞大小调控合子基因激活的直接证据4。
该实验方案的成功依赖于几个关键步骤。由于非洲爪蟾（Xenopus）早期胚胎中存在细胞大小的梯度轴——从动物极到植物极，细胞由小逐渐变大4，因此不同大小的细胞所占比例差异显著；即胚胎中较大细胞的数量远少于较小的细胞。此外，在细胞解离和分选过程中，大细胞会继续分裂，且比小细胞更容易破裂。因此，估算进行卵裂球解离所需的胚胎数量非常重要；如果实验需要特定数量的细胞，尤其是大细胞，则应增加胚胎数量，以获得足够数量的大卵裂球。
CMFM孵育的时...

细胞大小的变化是早期胚胎发育的常见特征，在受精卵经历多轮卵裂并产生越来越多的细胞时尤为明显。尽管关于细胞大小作为调控细胞功能主要参数的作用已有较多研究1,2,3，但细胞大小如何影响早期发育仍知之甚少。近年来在多种模式胚胎系统中的研究表明，细胞大小可调控合子基因组激活（ZGA）4 和细胞命运决定5，提示细胞大小在发育决策中具有重要作用6,7。
Xenopus 早期胚胎是研究细胞大小调控发育决策的重要模型。由于 Xenopus 早期胚胎体积较大（直径约 1.2 mm），易于通过物理手段操控其大小，因此适用于评估细胞大小变化的直接后果。例如，可通过毛发环收缩单细胞胚胎产生不同大小的微型胚胎4,8，从而证明 ZGA 具有剂量依赖性4。此外，Xenopus 早期胚胎沿动-植物极轴存在细胞大小梯度，动物极的细胞最小，植物极的细胞最大，体积差异超过 100 倍4。重要的是，通过对整体胚胎单个细胞中新生成的转录本进行直接可视化和定量分析，我们鉴定出一个调控 ZGA 的细胞大小阈值4。进一步地，从 Xenopus 早期胚胎中分离单细胞并按大小分选，也证实了该细胞大小阈值对 ZGA 的重要性4。
在此，我们描述了从单个细胞中分离的详细步骤 Xenopus laevis 早期胚胎并按大小进行分选。 非洲爪蟾 早期胚胎可通过在含Ca的溶液中孵育而解离为单个细胞2+，Mg2+无血清培养基（CMFM）9，这些单细胞可使用不同孔径的细胞筛进一步分选。分选后的细胞可进行纯化，并用于多种应用，包括活细胞分析、测序或成像检测。

<table><tbody><tr><td>16% 多聚甲醛（PFA）</td><td>EMS</td><td>15710-S</td><td>用于配制固定液</td></tr><tr><td>60 mm 一次性培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>用于胚胎孵育</td></tr><tr><td>ACCU-SCOPE 3075 变倍体视显微镜</td><td>VWR</td><td>470351-130</td><td>用于观察胚胎</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9414</td><td>用于包被培养皿</td></tr><tr><td>细胞筛，100 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>76327-102</td><td>用于按细胞大小进行分选</td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>76327-098</td><td>用于按细胞大小进行分选</td></tr><tr><td>细胞筛，70 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>76327-100</td><td>用于按细胞大小进行分选</td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>VWR</td><td>414004-035</td><td>用于转移胚胎</td></tr><tr><td>Dumont 镊子，5 型</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>用于去除卵黄膜</td></tr><tr><td>玻璃培养皿，60 &amp;times; 15 mm</td><td>VWR</td><td>75845-542</td><td>用于胚胎孵育</td></tr></tbody></table>

从xenopus早期胚胎中分离单个细胞并按大小分选

Isolating Single Cells from Xenopus Early Embryos and Sorting Them by Size

早期胚胎发育需要细胞尺寸呈指数级减小，而胚胎在发育的最初阶段总体大小保持不变。细胞尺寸影响胚胎发育的功能重要性及其作用机制目前仍缺乏深入研究。Xenopus 早期胚胎&#160;为解决这些关键问题提供了独特的研究体系。与其他模式生物相比，Xenopus 早期胚胎体积极大，在中囊胚转换时期的整个胚胎中存在明显的细胞尺寸梯度，从动物极的较小细胞到植物极的较大细胞均有分布。本文介绍了一种从 Xenopus 早期胚胎中分离单个细胞，并利用不同孔径的细胞筛网按尺寸进行分选的实验方案。通过成像和尺寸测量结果确认，分选后的细胞尺寸处于预期范围内，可用于活细胞分析或测序，也可固定后用于成像研究。该体系将有助于揭示早期发育过程中依赖于细胞尺寸的调控机制。

Xenopus laevis 胚胎（n = 50）在 9 期阶段按照本方案在 CMFM 培养基中孵育，以解离为单个卵裂球（见图 1中的示例）。解离后的单个卵裂球依次通过 40 µm、70 µm 和 100 µm 的细胞筛进行分选，具体操作如上所述。未分选的对照混合物和分选后的单个卵裂球用 4% 多聚甲醛固定，并在明场显微镜下成像（图 4A）。如图 4B、C所示，与包含多种尺寸的未分选对照卵裂球相比，分选后的卵裂球尺寸分布范围较窄，且落在各自预期的尺寸范围内：&lt; 40 µm 组为 33 ± 5.3 µm；40–70 µm 组为 55 ± 11 µm；&gt; 70 µm 组为 91 ± 17 µm（图 4），表明根据细胞大小实现了有效的分选。这些按尺寸分选的细胞可用于进一步分析，例如验证早期胚胎发生过程中依赖于细胞大小的合子基因组激活<sup c...

我们描述了一种从Xenopus laevis早期胚胎中分离单个细胞并根据细胞大小进行分选的方法。

从Xenopus早期胚胎中分离单个细胞并按大小分选

早期胚胎发育需要细胞尺寸呈指数级减小，而在发育的最初阶段胚胎整体尺寸保持不变。

我们的研究聚焦于细胞大小如何调控早期胚胎发育中的基因组和硫酸盐相关决策。现有方法忽略了早期非洲爪蟾胚胎中细胞大小的异质性。本方案可实现按细胞大小进行精确的物理分离与分选。首先，在一个新的、涂有1.5% AGROS凝胶的60毫米培养皿中加入约15毫升CMFM。使用塑料移液管，将10至100个非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎转移至培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下。用一把镊子小心夹住胚胎表面的卵黄膜，用另一把镊子将其剥离，注意避免损伤胚胎。将去卵黄膜的胚胎在室温下于CMFM中孵育1小时。每五分钟轻轻摇晃培养皿一次，以促进细胞解离。定期检查，直至显微镜下无成堆的卵裂球可见。在卵裂球解离过程中，将40微米、70微米和100微米的细胞滤网分别浸入盛有CMFM的培养皿中。按照指定顺序从左到右排列培养皿。在各组之间放置两个额外盛有 CMFM 的培养皿，用于分选过程中滤网的短暂清洗。现在轻轻晃动含有分离的单个卵裂球的培养皿，使其在中央富集。然后小心地将卵裂球转移至浸没在 CMFM 中的 40 微米滤网中。轻轻晃动滤网数次，使小于 40 微米的卵裂球通过滤网。迅速将滤网移至盛有 CMFM 的培养皿中进行短暂清洗。然后小心地将滤网中保留的卵裂球转移至70微米滤网中。使用逐渐增大的滤网重复分选步骤，直至卵裂球被收集在100微米滤网中。轻轻旋转每个含有已分选卵裂球的培养皿，使卵裂球富集于中央。然后，小心地将约四毫升的卵裂球转移至含有0.5毫升15%密度梯度介质的荧光激活细胞分选管顶部，避免混匀。10分钟后，完整的卵裂球将因重力作用沉降至管底，从而与破裂卵裂球释放的卵黄颗粒分离。未分选的对照样本以及按大小分选的单个卵裂球经固定后，在明场显微镜下进行成像观察。分选后的卵裂球在其各自预期范围内的大小分布较窄，与未分选的对照组卵裂球相比更为均一。小于40微米组的平均直径约为33微米；40至70微米组的平均直径约为55微米，而大于70微米组的平均直径约为91微米。本方案使研究人员能够研究由细胞大小介导的功能和机制。本方案最重要的注意事项是小心处理解离的细胞，因为它们较为脆弱。完成本方案后，分选的细胞可用于细胞周期分析、单细胞测序以及共聚焦成像。

isolating-single-cells-from-xenopus-early-embryos-sorting-them

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从非洲 爪蟾 早期胚胎中分离单细胞并按大小分类

我们报道一种高效且简便的方法，用于分离发育早期阶段的胚胎 拟南芥 种子。根据下游应用的不同，可在1至4小时内分离出多达40个胚胎。该方法适用于转录组、DNA甲基化、报告基因表达、免疫染色和荧光检测。 原位...

高效快速分离早期胚胎 拟南芥 种子

我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。...

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

细胞及细胞内比例调控的机制仍不明确。Xenopus...

使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

我们描述了实现快速的步骤 原位...

用于活体非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎单细胞代谢组学的微探针毛细管电泳质谱分析

我们介绍一种用于分析小鼠早期胚胎中microRNA表达谱的技术。该方案克服了细胞起始量少以及小RNA富集困难的挑战。本检测方法可用于分析小鼠早期胚胎不同细胞谱系中miRNA表达随时间的变化。...

从小鼠早期胚胎中制备小RNA测序文库

我们描述了一种简单的方法，用于从非洲爪蟾（Xenopus...

利用非洲爪蟾胚胎细胞生成黏液纤毛上皮类器官：培养、传代与高分辨率活体成像

本文描述了一种基于质谱的蛋白质组学方法，用于对具有已知组织命运的脊椎动物Xenopus...

基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

本文建立了一种用于制备受精后小鼠胚胎单细胞和细胞核高质量悬液的流程，以进行单细胞和单细胞核测序。...

从上胚层到原肠胚形成结束：突变小鼠全胚胎的单细胞RNA测序

我们描述了一种物理限制方法，可从Xenopus...

物理操作法生成Xenopus微型胚胎

学习从非洲爪蟾早期胚胎中分离单细胞并按大小分类的方法，用于发育生物学研究。该技术通过物理分离实现精确分选，为细胞大小相关功能研究提供可靠工具。

从Xenopus早期胚胎中分离单个细胞并按大小分选

探索更多视频