Summary
האנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs) הם כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס לתקן כלי הדם.
Abstract
נייר זה מציג אסטרטגיית התאוששות הרומן אנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs) מ heparinized אבל unmanipulated אחרת מבוגר דם היקפיים אדם בתוך ממוצע של 12 ימים. לאחר התרחבות בקנה מידה גדול> 1x10 8 ECFCs ניתן להשיג עבור בדיקות נוספות. ביתרון באמצעות pHPL הקשר של תאים אנושיים עם אנטיגנים בסרום שור ניתן לשלול. עד cytometry זרימה אימונוהיסטוכימיה התאים מבודדים ניתן לאפיין ECFC ואת הפונקציונליות שלהם חוץ גופית כדי ליצור מבנים דמויי כלי דם ניתן לבדוק assay matrigel. יתר על תאים אלה ניתן להזריק תת עורי במודל של עכברים כדי ליצור תפקודית, כלי perfused in vivo. לאחר התרחבות לטווח ארוך התפשטות cryopreservation, פונקציה ויציבות גנומית להופיע להישמר. 3,4
זה בידוד בעלי חיים חלבון חופשית שיטת הרחבה ישים בקלות לייצר כמות גדולה של ECFCs.
Protocol
א) ECFC ISOLATON
יום 1:
- לפני שתתחיל בניסוי להכין את תרבית תאים בינוני צמיחה האנדותל בינוני-2 (EGM-2). מוסף 500ml האנדותל בסל בינוני 2 עם הפרין (1ml של 1000 U / ml), פתרון 100x 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין, (כל Sigma, סנט לואיס, מיזורי www.sigmaaldrich.com ריכוז), L-גלוטמין (סופי 2 מ"מ ), ו 50 מ"ל ונקווה lysate טסיות האנושי (pHPL). ואז להוסיף 0.2 הידרוקורטיזון מ"ל, 2 מ"ל hFGF-B, VEGF 0.5 מ"ל, 0.5 מ"ל EGF, 0.5 מ"ל IGF-1 ו - 0.5 מ"ל חומצה אסקורבית (כאמור SingleQuots, כל Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience. com / ). סטרילי תסנין המדיום דרך נקבוביות 0.2 מ-500 גודל מסנן ואקום מ"ל Millipore. מאז pHPL צורות קרישי קטן ייתכן שתצטרך שני מסננים עבור מדיום אחד. טרום חם מסוננים EGM-2-37 ° C באמבט מים
- איסוף דגימות דם על ידי ציור 5 מ"ל של דם היקפיים אדם מבוגר מן הווריד cubital לתוך משמר 6ml חינם צינור נתרן הדם הפרין vacutainer. אתה צריך תהליך דגימות דם בתוך לכל היותר שעתיים.
- התחל להכין את אחד 75 ס"מ 2 (T75, שחקן המשנה) בקבוק עם כובע פרקו, אחד פיפטה 25 מ"ל ושני pipettes 5 מ"ל ספסל זרימה למינרית.
- טרום למלא 15 מ"ל מראש חימם בתוספת EGM-2 לתוך בקבוק עם פיפטה 25 מ"ל. עכשיו לפתוח את הבקבוקון דם מדגם כל 5 מ"ל עם פיפטה 5 מ"ל לתוך הבקבוק. יש לשטוף את הבקבוקון דם ריק עם 5 מ"ל נוספים של EGM-2 עם second פיפטה 5 מ"ל. ההיקף הכולל בתוך T75 הוא 25 מ"ל. סגור את מכסה פרקו של הבקבוק ואת המקום באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו - 95% לחות למשך 24 שעות.
יום 2:
- לאחר כ 24 שעות (מעל בלילה) אתה צריך להסיר את התערובת בינוני דם להיפטר של תאים שאינם חסיד. בשביל זה להכין שתי pipettes 25 מ"ל ושלושה pipettes 5 מ"ל בזרימה למינרית, טרום חמים 20 מ"ל בתוספת EGM-2 (שהוכן ביום הקודם) ו - 30 מ"ל PBS על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הסר את הבקבוק עם המדגם מן החממה להסיר את כל supernatant עם טפטפת 25 מ"ל. יש להיזהר שלא לשרוט את משטח הבקבוק כדי למנוע נזק כלשהו המושבה פוטנציאליים. לשטוף את הבקבוק הפנימי בתא השטח דבקות שלוש פעמים בעדינות על ידי הוספת 10 מ"ל בבקבוק מראש חימם את PBS ו הטיה מצד אחד לצד השני. הסר את PBS מיד בכל פעם וזורקים.
- הוסף 20 מ"ל של EGM-2 מראש חימם טריים הבקבוק ולשים אותו בחזרה לתוך החממה. תהליך זה צריך להתבצע מהר ועדין ככל האפשר עבור התאים המצורפת לא לנתק. ECFCs לנתק בקלות אם הם נשמרים PBS או בטמפרטורת החדר עד ארוך.
- מסך דרך הבקבוק מערכתית בכל יום שני החל מהשעה יום שני שימוש בהגדלה נמוכה של מיקרוסקופ אור מחפש תוצאה ECFC. כאשר המושבה נמצא סימן על גבי בצד החיצוני של הבקבוק המציין את מיקום המושבה. שים לב פלקס לא צריך להיות מחוץ בחממה במשך יותר מ 5 דקות.
יום 5:
- ביום החמישי לאחר זריעת לבצע שינוי בינוני מלא כדי להסיר אי - חסיד תאים. לשם כך מראש חמים 20 מ"ל של EGM-2-37 ° C באמבט מים להכין שתי pipettes 25 מ"ל.
- הסר את המדיום להשלים בעזרת פיפטה 25 מ"ל ולהוסיף טרי, מחומם מראש EGM-2 להשלימו בהקדם האפשרי. תאים אסור להשאיר ללא בינוני במשך יותר מדקה כדי למנוע התייבשות. מניחים בחזרה לתוך החממה וחזור ההקרנה את הבקבוק מדי יום.
- להאכיל את התאים על ידי החלפת 30% בינוני על ידי טרי בתוספת EGM-2 פעמיים בשבוע.
יום 14-28:
- מושבות אופייניות עם מורפולוגיה חלוק אבן אמור להופיע סביב יום 12. סמן את הצד החיצוני העליון של הבקבוק כדי לציין את המיקום של כל המושבה. אפשר המושבות לגדול עד 28 יום אלא אם כן תאים בודדים להתחיל לנתק. פעם, מושבות העיקרי זוהו הם ניתן לקצור בין הימים 14 ו -28, תלוי בגודל שלהם.
ב) ECFC הקציר
- טרום חם 5 מ"ל טריפסין 0.05% / EDTA, 20 מ"ל ו 5 מ"ל PBS טריים בתוספת EGM-2.
- להסיר לחלוטין בינוני מהבקבוק לתוך צינור פלקון (לדאוג לא לגעת את פני השטח של הבקבוק כדי למנוע נזק כלשהו במושבה פוטנציאל) ולשטוף היטב תאים עם 10 מ"ל PBS שחומם מראש.
- הוסף 5 מ"ל טריפסין / EDTA ו דגירה במשך 5 דקות בחממה. התאים לא אמור להיות חשוף טריפסין דקות יותר מ 7 כי הוא הופך להיות רעיל. ביסודיות הקשה על צידי הבקבוק מסייעת לתאי לנתק. להרוות את פעילות הפרוטאז טריפסין על ידי הוספת כ 10 מ"ל של מדיום לשמר את התרבות בשימוש.
- הסרת ההשעיה התא לתוך 50 מ"ל פאלקוn צינור. לשטוף את הבקבוק פעם עם 10 מ"ל PBS אשר לאחר מכן הוסיף את ההשעיה תא שנקטפו. צנטריפוגה ההשעיה התא גרם 300 דקות 7 ב 4 ° C כדי לאסוף את התאים להסיר את טריפסין. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה מיד 1 מ"ל PBS. שמור על הקרח.
- קביעת מספר התא כמתואר בפרוטוקול יופיטר על ידי ר 'ריקרדו ק Phelani 5.
ג) הרחבת ECFC
- מוסף 500 מ"ל EGM-2 כפי שמתואר 1.1). טרום חמים 37 ° C באמבט מים.
- במשך כ 2500 רווח 2 ס"מ תרבות להכין או 11 T220 (225 ס"מ 2) או 15 T175 (175 ס"מ 2) או ארבע שכבות מפעל תא (CF-4; Nunc, Naperville, IL, http://www.nuncbrand . com ). בנוסף תוכלו צריכים שני טרי פורקן, כובעים משפך סטרילי מיוחד הספסל זרימה למינרית.
- כדי ECFCs זרע בצפיפות תא המוצא של 100 ג / 2 ס"מ חישוב מספר תאים הכרחי. עבור אחד CF-4 252,800 תאים resuspended ב 500 מ"ל טרי EGM-2 ו שפך לתוך ה-CF-4 באמצעות משפך סטרילית. קרוב אחד פורקן עם כובע האוורור ו להטות את CF-4 אל צד אחד האורך, המאפשר חלוקה שווה של המדיום בין כל 4 קמח. ואז להטות את החדר האחורי ולפתוח את מכסה כובע האוורור. המקום CF-4 באינקובטור.
- שנה 20% של המדיום לפחות פעם בשבוע עד CF-4 הוא ומחוברות.
- תאים קציר כמתואר ב) באמצעות 70 מ"ל של טריפסין / EDTA וכ 200 מ"ל PBS.
נציג תוצאות
באמצעות שיטה זו בידוד צפינו היווצרות מושבה העיקרי ביום 12. במחקר הקודם הצליחו להתאושש ממוצע של 4.0 ± 0,8 ECFC-מושבות שמקורם מ"ל כל אחד דם היקפיים. 4 ECFCs הראו הופעה טיפוסית חלוק אבן. לאחר התרחבות בקנה מידה גדול, עם צפיפות זריעה של 100 תאים / 2 ס"מ, השגנו> 1 x 10 8 תאים בסך של כ 30 ימים 3 זכרים ו 1 נקבה מתנדבים (בין גיל 26 ו - 50 שנים).
ECFC בתרבית בתנאים אלה הוצגו להיות שגשוג, פונקציונלי יציב genomically. 4 יתר על כן התאים ניתן לאחסן (ב 10% DMSO) בחנקן נוזלי לשימוש נוסף. 3,4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה בידוד הרומן שיטת ההרחבה הוא תהליך פשוט ויעיל כי הוא יעיל יותר, לצרוך פחות זמן על ידי הימנעות מכל הפרדת תאים (ללא שיפוע צפיפות הצורך) ופחות יקר מאשר טכניקות קונבנציונאלי. באמצעות מגע pHPL לאנטיגנים שור ו xenoimmunization הבאים המשוערת היא מחוץ לתחום. בתקופת התרבות קרישי קטן יכול להיווצר, הנגרמת על ידי pHPL. בהתבסס על הניסיון שלנו קרישי אלה אינם היווצרות אפקט המושבה ובחלוקה של תאים או פונקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר קתרינה Schallmoser למתן pHPL ו מרגרטה Frühwirth ודניאלה טלר לקבלת סיוע טכני מעולה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
|
| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
|
| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
|
| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
