Summary
Эндотелиальная колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs) являются перспективным инструментом для изучения сосудистого гомеостаза и ремонта.
Abstract
В данной статье представлена новая стратегия восстановления эндотелия колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs) с гепарином, но в остальном unmanipulated взрослого человека периферической крови в среднем 12 дней. После большого расширения масштабов> 1x10 8 ECFCs могут быть получены для дальнейших испытаний. Преимущественно с помощью pHPL контакта клеток человека с бычьей сыворотки антигены могут быть исключены. По проточной цитометрии и иммуногистохимии изолированных клеток можно охарактеризовать как ECFC и их функциональность в пробирке для формирования сосудистого подобных структур может быть протестирована в анализе Матригель. В дальнейшем эти клетки могут быть подкожно вводили в модель мыши для формирования функциональной, перфузии судов в естественных условиях. После долгосрочного расширения и распространения криоконсервации, функции и геномной стабильности по всей видимости, сохранится. 3,4
Это животное-белковые свободной изоляции и расширения метод легко применимы для создания большого количества ECFCs.
Protocol
А.) ECFC ISOLATON
ДЕНЬ 1:
- Перед тем, как начать с эксперимента подготовить среду клеточной культуры среднего роста эндотелия-2 (EGM-2). Дополнение 500мл эндотелиальной базальной среды-2 с гепарином (1 мл 1000 ЕД / мл), 5 мл 100x раствор пенициллина / стрептомицина (все Sigma, Сент-Луис, штат Миссури; www.sigmaaldrich.com ), L-глютамин (2 мМ конечной концентрации ), и 50 мл объединенных человека лизат тромбоцитов (pHPL). Затем добавить 0,2 мл гидрокортизона, 2 мл hFGF-B, 0,5 мл VEGF, 0,5 мл EGF, 0,5 мл IGF-1 и 0,5 мл аскорбиновой кислоты (при условии, как SingleQuots, все Lonza, Уолкерсвилл, MD; http://www.lonzabioscience. COM / ). Стерильный фильтрат среды, через 0,2 м, размер пор 500 мл вакуумных фильтров Millipore. С pHPL образует небольшие сгустки вам может понадобиться два фильтра для одной среды. Предварительно теплой фильтруется EGM-2 до 37 ° С на водяной бане
- Сбор образцов крови, нарисовав 5 мл взрослого человека периферической крови из локтевой вены в 6 мл без консервантов натрий-гепарином трубки Vacutainer крови. Вы должны обрабатывать образцы крови в течение максимум двух часов.
- Начните с подготовки один 75 см 2 (T75; Costar) колбу с вентилируемый колпачок, один 25 мл пипетки и два 5 мл пипетки в лавке ламинарного потока.
- Предварительное заполнение 15 мл подогретого дополнен EGM-2 в колбу с 25 мл пипетки. Теперь откройте флакон крови и образцы всех 5 мл с 5 мл пипетки в колбу. Промыть пустой флакон крови с 5 мл дополнительного EGM-2 со вторым 5 мл пипетки. Общий объем в пределах T75 составляет 25 мл. Закрыть АС в вентилируемом шапка колбу и место в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2 и 95% влажности в течение 24 часов.
ДЕНЬ 2:
- Примерно через 24 часов (на ночь), Вы должны удалить среднего крови смесь, чтобы избавиться от не являющихся прилипшие клетки. Для этого подготовить два 25 мл пипетки и три 5 мл пипетки в ламинарный поток, предварительно теплой 20 мл дополнен EGM-2 (подготовленные на предыдущий день) и 30 мл PBS до 37 ° С на водяной бане.
- Удалить колба с образцом из инкубатора и удалить все супернатанта с пипеткой 25 мл. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность колбы, чтобы не повредить любые потенциальные колонии. Вымойте внутреннюю колбу ячейки соблюдение поверхности в три раза, осторожно добавляя 10 мл подогретого PBS и наклона колбы с одной стороны на другую. Удалить PBS немедленно каждый раз и выбросить.
- Добавьте 20 мл свежего подогретого EGM-2 в колбу и поместить его обратно в инкубатор. Этот процесс должен выполняться так же быстро и нежный насколько это возможно для прилагается клетки не оторвать. ECFCs отделить легко, если они хранятся в PBS или при комнатной температуре в течение долго.
- Экран через колбу системно каждый второй день, начиная с дня два использованием низких увеличении светового микроскопа искал ECFC нарост. Когда колония находится знак сверху на внешней стороне колбы, указывающий положение колонии. Обратите внимание, что flaks не должны быть вне инкубатора в течение более 5 минут.
День 5:
- На пятый день после посева выполнять полное изменение среды для удаления не соблюдают клеток. Для этого предварительно теплой 20 мл EGM-2 до 37 ° С на водяной бане и подготовить два 25 мл пипетки.
- Удалить полной среде с помощью пипетки 25 мл и добавляют свежий, подогретого дополнен EGM-2 как можно скорее. Клетки не следует оставлять без средой для более минуты, чтобы избежать высыхания. Место обратно в инкубатор и повторить скрининг колбу ежедневно.
- Поток клетки заменить 30% среднего по свежим дополнен EGM-2 раза в неделю.
День 14-28:
- Типичные колонии с булыжником морфологии каменных должно появиться около 12-й день. Марк верхней внешней стороне колбы, чтобы указать положение каждой колонии. Разрешить колонии расти до 28-й день, если отдельные клетки начинают отделяться. Однажды, первичной колонии были определены, они могут быть собраны между днями 14 и 28, в зависимости от их размера.
Б) ECFC УРОЖАЙ
- Предварительно теплой 5 мл 0,05% трипсин / ЭДТА, 20 мл и 5 мл PBS свежие дополнен EGM-2.
- Полностью удалить среды из колбы в пробирку Falcon (старайтесь не прикасаться к поверхности колбы, чтобы не повредить любые потенциальные колонии) и промойте клетки тщательно с 10 мл разогретой PBS.
- Добавьте 5 мл трипсин / ЭДТА и инкубировать 5 минут в инкубаторе. Клетки не должны подвергаться воздействию трипсина более 7 минут, поскольку он становится токсичным. Тщательно нажав стороны колбы помогает клеткам необходимо отсоединить. Quench активности трипсина протеазы, добавив примерно 10 мл сохранились использовать питательную среду.
- Удалить клеточной суспензии в 50 мл Falcoн трубки. Промыть колбу раз с 10 мл PBS, который после этого добавляется собрано клеточной суспензии. Центрифуга клеточной суспензии в 300 г в течение 7 мин при 4 ° С для сбора клеток и удаления трипсина. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток сразу в 1 мл PBS. Держите на льду.
- Определить число клеток, как описано в протоколе Юпитер Р. Рикардо и К. Phelani 5.
C) ECFC РАСШИРЕНИЯ
- Дополнение 500 мл EGM-2, как описано в 1.1). Предварительно теплой до 37 ° С на водяной бане.
- В течение примерно 2500 см 2 пространство культуры подготовить либо 11 T220 (225 см 2) или 15 T175 (175 см 2) или один-четыре слоистых фабрики ячеек (CF-4; Nunc, Naperville, Иллинойс; http://www.nuncbrand . COM ). Кроме того, вы будете нуждаться в двух свежих вентиляционные крышки и специальные стерильные воронки в жиме ламинарного потока.
- Для семян ECFCs на начальной ячейки плотностью 100 с / см 2 Расчет количества клеток необходимо. С одной стороны CF-4 252 800 клетки ресуспендировали в 500 мл свежего EGM-2 и выливают в CF-4 с использованием стерильных воронку. Закройте один выход с вентиляционные крышки и наклона CF-4 одной долготе сторону, что позволяет равномерное распределение среды между всеми 4 муки. Затем наклоните камеру назад и открытой крышке вентиляционные крышки. Место CF-4 в инкубаторе.
- Изменение 20% средний по крайней мере раз в неделю до CF-4 является вырожденным.
- Урожай клетки, как описано в б) с помощью 70 мл трипсин / ЭДТА и примерно 200 мл PBS.
ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ
Используя этот метод изоляции мы наблюдали первичное образование колонии в 12-й день. В предыдущем исследовании смогли восстановить среднем 4,0 ± 0,8 ECFC-колоний производным от каждого мл периферической крови. 4 ECFCs показал типичный внешний вид булыжника камня. После большого расширения масштабов, с посевом плотностью 100 клеток / см 2, мы получили> 1 х 10 8 клеток в общей сложности примерно 30 дней с 3 мужчин и 1 женщины-добровольцы (в возрасте от 26 до 50 лет).
ECFC культивируют в этих условиях было показано, что пролиферативный, функциональный и genomically стабильной. 4 Кроме того клетки могут храниться (в 10% ДМСО) в жидком азоте для дальнейшего использования. 3,4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта изоляция романа и расширение метод простой и эффективный процесс, который является более эффективным и менее затратным по времени, избегая любой ячейке разделения (без градиента плотности необходимости) и дешевле, чем традиционные методы. При использовании pHPL контакт с бычьей антигенов и предполагаемых последующих xenoimmunization исключается. Во время периода культивирования небольшие сгустки могут образовываться, вызванные pHPL. Основываясь на нашем опыте эти сгустки не влияют на формирование колонии и пролиферации клеток или функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Катарина Schallmoser за предоставление pHPL и Маргарета Frühwirth и Даниэла Талер за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
|
| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
|
| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
|
| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
