1. Vorbereitung von Embryonen/Larven
- Übertragen Sie 100 Embryonen in eine 100 mm große Petrischale mit 25 ml Eiwasser. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale und ziehen Sie sie bei 28 °C auf.
- Um die Pigmentierung zu hemmen, geben Sie Phenylthioharnstoff (PTU) vor 10 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in die Petrischalen und ziehen Sie Embryonen/Larven bis zu 80 hpf auf. Die Endkonzentration von PTU beträgt 0,2 mM.
ACHTUNG: PTU ist giftig. Verwendung in Übereinstimmung mit den entsprechenden Handhabungsrichtlinien.
- Betäuben Sie die Larven, indem Sie 3-Aminobenzoesäureethylester (Tricain) in einer Endkonzentration von 0,016 % in die Petrischalen geben. Anschließend sortieren Sie mit einem Epifluoreszenzmikroskop CFP-positive Larven. Verwenden Sie Larven mit ähnlicher Lebergröße und entsorgen Sie Larven mit kleinerer oder größerer Leber.
HINWEIS: Alle CFP-positiven Larven, unabhängig von ihrer Intensität, können verwendet werden, da es keinen Unterschied im Ausmaß der Hepatozytenablation zwischen den hemizygoten und homozygoten Larven gibt.
ACHTUNG: Tricain ist giftig. Verwendung in Übereinstimmung mit den entsprechenden Handhabungsrichtlinien.
- Entfernen Sie das Tricainhaltige Eiwasser und fügen Sie Eiwasser hinzu, das mit 0,2 mM PTU angereichert ist. Halten Sie die Embryonen/Larven bei 28 °C.
2. Mtz Behandlung
- Bereiten Sie eine frische 10 mM Mtz Lösung vor, indem Sie 0,171 g Mtz Pulver in 100 ml Eiwasser lösen, das mit 0,2 % DMSO und 0,2 mM PTU versetzt wird. Um das Mtz vollständig aufzulösen, mischen Sie die Lösung bei RT unter schnellem Rühren für 20-30 Minuten. Um die Solubilisierung von Mtz zu unterstützen und die Mtz-Permeation in die Larven zu verbessern, fügen Sie DMSO bei der Zubereitung von Mtz.
ACHTUNG: Längere Exposition oder erhöhte Konzentration von Mtz ist toxisch. Verwendung in Übereinstimmung mit den entsprechenden Handhabungsrichtlinien.
- Trennen Sie die Larven in Kontroll- und Versuchsgruppen, indem Sie die gewünschte Anzahl von Larven in zwei verschiedene 100-mm-Petrischalen oder Multi-Well-Platten umfüllen. Für die Versuchsgruppe werden die Larven in einer 10 mM Mtz Lösung aufbewahrt; Bewahren Sie die Kontrollgruppe in Eiwasser mit 0,2 % DMSO auf.
- Die Platten oder Petrischale, die die Mtz-Lösung enthalten, werden mit Alufolie abgedeckt, um die Photoinaktivierung von Mtz zu verhindern, und bei 28 °C inkubiert. Die Dauer der Mtz-Behandlung hängt vom Larvenstadium und der transgenen Linie ab.
3. Analyse der bilylär gesteuerten Leberregeneration
- Entfernen Sie am Ende der Ablationsphase die Mtz-Lösung von den Platten. Waschen Sie die mit Mtz behandelten Larven mit 25 ml Eiwasser. Schwenken Sie den Teller 2-3 Mal, um die Larven zu waschen, bevor Sie das Eiwasser wegwerfen. Wiederholen Sie dies dreimal und tauchen Sie die Larven dann erneut in Eiwasser. Um Herzödeme und Larventod bei den mit Mtz behandelten Larven zu vermeiden, fügen Sie eine niedrigere Konzentration von Tricain in einer Endkonzentration von 0,008 % hinzu, um die Larven zu immobilisieren.
- Für die Leberanalyse ist die Lebergröße der mit Mtz behandelten Larven unter einem Epifluoreszenzmikroskop mit dem CFP-Filter zu untersuchen. Beurteilen Sie die Hepatozytenablation basierend auf der relativen Lebergröße: groß (nicht abliert; 0-10 % der Larven), mittel (teilweise abliert; 10-20 %) und sehr klein (vollständig abliert; 80-90 %).
