표적 간 절제: 트랜스제닉 제브라피시 애벌레에서 메트로니다졸로 간세포 죽음을 유도

이 기사는 표적 간 절제, 형질형 제브라피시 애벌레에서 메트로니다졸로 간세포 죽음을 유도하는 방법을 설명합니다. 샘플 프로토콜은 제브라피시의 표적 간 절제를 생성, 조작 및 평가하는 과정을 설명합니다.

1. 배아/애벌레의 준비

100개의 배아를 달걀 물 25ml와 함께 100mm 페트리 접시에 옮긴다. 페트리 접시 당 100 배아를 더 이상 보관하고 28 ° C에서 올립니다.
색소 침착을 억제하기 위해 페닐티우레아(PTU)를 10시간 전에 페트리 접시에 넣고 수정 후(hpf)하고 배아/유충을 80hpf까지 올립니다. PTU의 최종 농도는 0.2 mM입니다.
주의: PTU는 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침에 따라 사용하십시오.
페트리 접시에 0.016%의 최종 농도로 3아미노산 에틸 에스테르(Tricaine)를 첨가하여 애벌레를 마취시합니다. 그런 다음, 상피 현미경을 사용하여 CFP 양성 애벌레를 정렬하십시오. 비슷한 간 크기로 애벌레를 사용하고 더 작거나 더 큰 간을 가진 유충을 폐기하십시오.
참고: 강도에 관계없이 모든 CFP 양성 애벌레는 헤미지구스와 호마시구스 애벌레 사이의 간세포 절제 의 정도에 차이가 없기 때문에 사용할 수 있습니다.
주의: 트리카인은 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침에 따라 사용하십시오.
트리카인이 함유된 달걀 물을 제거하고 0.2mM PTU로 보충된 달걀 물을 추가합니다. 배아/애벌레를 28°C로 유지한다.

2. Mtz 치료

0.2% DMSO 와 0.2 mM PTU로 보충된 100ml 달걀 물에 Mtz 분말 0.171 g을 용해하여 신선한 10m Mtz 솔루션을 준비하십시오. Mtz를 완전히 용해하려면 RT의 용액을 20-30분 동안 빠른 교반과 혼합합니다. Mtz를 용해시키고 유충에 Mtz 투고를 향상시키기 위해 Mtz를 준비할 때 DMSO를 추가하십시오.
주의: Mtz의 장기간 노출 또는 농도 증가가 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침에 따라 사용하십시오.
원하는 수의 유충을 2개의 다른 100mm 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트로 이송하여 애벌레를 제어 및 실험 그룹으로 분리합니다. 실험군의 경우, 애벌레를 10mM Mtz 용액으로 유지한다. 대조군의 경우 0.2% DMSO를 함유한 달걀 물에 보관하십시오.
Mtz용 의 사진 비활성화를 방지하기 위해 Mtz 용액을 함유한 접시 또는 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮고 28°C에서 배양합니다. Mtz 처리의 기간은 애벌레 단계 및 형질 전환선에 달려 있습니다.

3. 담즙 구동 간 재생 분석

절제 기간이 끝나면 플레이트에서 Mtz 용액을 제거합니다. 25 ml의 달걀 물을 추가하여 Mtz 처리 된 애벌레를 씻으시면 하십시오. 접시를 2-3번 소용돌이치며 애벌레를 씻은 후 달걀 물을 버립니다. 세 번 반복한 다음 애벌레를 달걀 물에 한 번 더 담급다. Mtz 처리애애에서 심장 부종과 애벌레 죽음을 피하기 위해, 트리카인의 낮은 농도를 추가, 0.008 %의 최종 농도에서, 애벌레를 고정.
간 분석을 위해, CFP 필터를 가진 상피 현미경의 밑에 Mtz 처리한 애벌레의 간 크기를 검사합니다. 상대간 크기에 따라 간세포 절제 수준을 평가합니다: 큰 (비 압계; 0-10% 애벌레), 중간 (부분적으로 ab류; 10-20%), 그리고 아주 작은 (완전히 ablated; 80-90%).

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Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA