Ablation ciblée du foie : Induire la mort des hépatocytes avec le métronidazole chez les larves transgéniques de poisson zèbre

Overview

L’article décrit l’ablation ciblée du foie, une méthode pour induire la mort des hépatocytes avec du métronidazole chez les larves transgéniques de poisson zèbre. Le protocole de l’échantillon décrit le processus de génération, de manipulation et d’évaluation de l’ablation ciblée du foie chez le poisson zèbre.

Protocol

1. Préparation d’embryons/larves

1. Transférer 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 25 ml d’eau d’œuf. Ne gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri et augmentez-les à 28 °C.
2. Pour inhiber la pigmentation, ajouter la phénylthiourea (PTU) dans les boîtes de Pétri avant 10 heures après la fécondation (hpf), et élever les embryons/larves jusqu’à 80 hpf. La concentration finale de PTU est de 0,2 mM.
   ATTENTION: La PTU est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
3. Anesthésier les larves en ajoutant de l’ester éthyle à 3 acides benzoïques (Tricaine), à une concentration finale de 0,016 %, dans les boîtes de Pétri. Ensuite, à l’aide d’un microscope à épifluorescence, trier les larves positives à la PCP. Utilisez des larves ayant une taille hépatique similaire et jetez celles dont le foie est plus petit ou plus grand.
   REMARQUE: toutes les larves positives à la PCP, quelle que soit leur intensité, peuvent être utilisées parce qu’il n’y a pas de différence dans l’étendue de l’ablation des hépatocytes entre les larves d’hémizygotes et d’homozygotes.
   ATTENTION: la tricaine est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
4. Retirer l’eau de l’œuf contenant de la tricaine et ajouter l’eau d’œuf complétée par 0,2 mM PTU. Gardez les embryons/larves à 28 °C.

2. Traitement Mtz

1. Préparer une solution fraîche de 10 mM Mtz en dissolvant 0,171 g de poudre de Mtz dans de l’eau d’œuf de 100 ml complétée par 0,2 % de DMSO et 0,2 mM de PTU. Pour dissoudre complètement le Mtz, mélanger la solution à RT avec une agitation rapide pendant 20-30 minutes. Pour aider à solubiliser Mtz et à améliorer la perméation de Mtz dans les larves, ajouter DMSO lors de la préparation de Mtz.
   ATTENTION: une exposition prolongée ou une concentration accrue de Mtz est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
2. Séparez les larves en groupes de contrôle et expérimentaux en transférant le nombre désiré de larves en deux boîtes de Pétri de 100 mm différentes ou en plaques multi-puits. Pour le groupe expérimental, gardez les larves dans la solution Mtz de 10 mM; pour le groupe témoin, gardez-les dans de l’eau d’œuf contenant 0,2 % de DMSO.
3. Couvrir les assiettes ou les boîtes de Pétri contenant la solution Mtz de papier d’aluminium pour éviter l’inactivation photo de Mtz et incuber à 28 °C. La durée du traitement Mtz dépend du stade larvaire et de la lignée transgénique.

3. Analyse de la régénération hépatique entraînée par Biliary

1. À la fin de la période d’ablation, retirer la solution Mtz des plaques. Laver les larves traitées par Mtz en ajoutant 25 ml d’eau d’œuf. Faites tourbillonner la plaque 2-3 fois pour laver les larves avant de jeter l’eau de l’œuf. Répétez trois fois, puis plongez les larves une fois de plus dans l’eau des œufs. Pour éviter l’oedème cardiaque et la mort larvaire chez les larves traitées par Mtz, ajoutez une plus faible concentration de Tricaine, à une concentration finale de 0,008 %, pour immobiliser les larves.
2. Pour l’analyse hépatique, examiner la taille hépatique des larves traitées par Mtz au microscope à épifluorescence à l’aide du filtre CFP. Évaluer les niveaux d’ablation des hépatocytes en fonction de la taille relative du foie : gros (non ablated; 0-10% larves), moyen (partiellement ablated; 10-20%), et très petit (entièrement ablated ; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA