Riktad leverablation: Inducerande hepatocytdöd med metronidazol i transgena zebrafisklarver

Overview

Artikeln beskriver riktad leverablation, en metod för att inducera hepatocytdöd med metronidazol i transgena zebrafisklarver. Provprotokollet beskriver processen för att generera, manipulera och bedöma riktad leverablation hos zebrafisk.

Protocol

1. Beredning av embryon/larver

1. Överför 100 embryon till en 100 mm petriskål med 25 ml äggvatten. Förvara högst 100 embryon per petriskål och höj dem vid 28 °C.
2. För att hämma pigmentering, tillsätt fenylthiourea (PTU) i petriskålarna före 10 timmars eftergödsling (hpf) och höj embryon /larver till 80 hpf. Den slutliga koncentrationen av PTU är 0,2 mM.
   VARNING: PTU är giftigt. Användning i enlighet med lämpliga hanteringsriktlinjer.
3. Söv larverna genom att tillsätta 3-aminobensoesyraetylester (Tricaine), vid en slutlig koncentration av 0,016%, i petriskålarna. Sortera sedan CFP-positiva larver med hjälp av ett epifluorescensmikroskop. Använd larver med liknande leverstorlek och kassera dem med en mindre eller större lever.
   OBS:Alla CFP-positiva larver, oavsett intensitet, kan användas eftersom det inte finns någon skillnad i omfattningen av hepatocytablation mellan de hemizygous och homozygous larverna.
   VARNING: trikain är giftigt. Användning i enlighet med lämpliga hanteringsriktlinjer.
4. Ta bort äggvattnet som innehåller Tricaine och tillsätt äggvatten kompletterat med 0,2 mM PTU. Håll embryona/larverna vid 28 °C.

2. Mtz Behandling

1. Förbered färsk 10 mM Mtz lösning genom att lösa upp 0,171 g Mtz pulver i 100 ml äggvatten kompletterat med 0,2% DMSO och 0,2 mM PTU. För att helt lösa upp Mtz, blanda lösningen på RT med snabb omrörning i 20-30 minuter. För att hjälpa till att lösliga Mtz och för att förbättra Mtz permeation i larverna, tillsätt DMSO när du förbereder Mtz.
   VARNING: Långvarig exponering eller ökad koncentration av Mtz är giftig. Användning i enlighet med lämpliga hanteringsriktlinjer.
2. Separera larverna i kontroll- och experimentgrupper genom att överföra önskat antal larver till två olika 100 mm petriskål eller multibrunnsplatta. För den experimentella gruppen, håll larverna i 10 mM Mtz lösning; för kontrollgruppen, förvara dem i äggvatten som innehåller 0,2% DMSO.
3. Täck plattorna eller petriskålarna som innehåller Mtz-lösningen med aluminiumfolie för att förhindra fotoinaktivering av Mtz och inkubera vid 28 °C. Varaktigheten av Mtz behandling beror på larvstadiet och den transgena linjen.

3. Analys av galldriven leverregenerering

1. I slutet av ablationsperioden, ta bort Mtz-lösningen från plattorna. Tvätta de Mtz-behandlade larverna genom att tillsätta 25 ml äggvatten. Snurra plattan 2-3 gånger för att tvätta larverna innan du kasserar äggvattnet. Upprepa tre gånger och sänk sedan ner larverna ännu en gång i äggvatten. För att undvika hjärtödem och larvdöd i de Mtz-behandlade larverna, tillsätt en lägre koncentration av Tricaine, vid en slutlig koncentration av 0,008%, för att immobilisera larverna.
2. För leveranalys, undersöka leverstorleken på de Mtz-behandlade larverna under ett epifluorescensmikroskop med CFP-filtret. Utvärdera hepatocytablationsnivåer baserat på den relativa leverstorleken: stor (icke-ablated; 0-10% larver), medium (delvis ablated; 10-20%), och mycket liten (helt ablated; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA