Ablazione epatica mirata: indurre la morte degli epatociti con metronidazolo nelle larve transgeniche di zebrafish

Overview

L'articolo descrive l'ablazione mirata del fegato, un metodo per indurre la morte degli epatociti con metronidazolo nelle larve transgeniche di zebrafish. Il protocollo di esempio descrive il processo per generare, manipolare e valutare l'ablazione mirata del fegato nei pesci zebra.

Protocol

1. Preparazione di embrioni/larve

1. Trasferire 100 embrioni in una piastra di petri da 100 mm con 25 ml di acqua d'uovo. Conservare non più di 100 embrioni per piastra di Petri e sollevarli a 28 °C.
2. Per inibire la pigmentazione, aggiungere la feniltiourea (PTU) nelle piastre di Petri prima della post-fecondazione di 10 ore (HPF) e sollevare embrioni / larve fino a 80 hpf. La concentrazione finale di PTU è di 0,2 mM.
   ATTENZIONE: La PTU è tossica. Utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate.
3. Anestetizzare le larve aggiungendo 3-ammino benzoico acido etilico estere (Tricaina), ad una concentrazione finale dello 0,016%, nelle piastre di Petri. Quindi, usando un microscopio a epifluorescenza, ordina le larve positive della PCP. Usa larve con una dimensione epatica simile e scarta quelle con un fegato più piccolo o più grande.
   NOTA: qualsiasi larva positiva alla PCP, indipendentemente dall'intensità, può essere utilizzata perché non vi è alcuna differenza nell'estensione dell'ablazione degli epatociti tra le larve emizigote e omozigoti.
   ATTENZIONE: la tricaina è tossica. Utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate.
4. Rimuovere l'acqua dell'uovo contenente Tricaine e aggiungere acqua d'uovo integrata con 0,2 mM PTU. Mantenere gli embrioni/larve a 28 °C.

2. Trattamento Mtz

1. Preparare una soluzione mtz fresca da 10 mM sciogliendo 0,171 g di polvere di Mtz in acqua d'uovo da 100 ml integrata con DMSO 0,2% e PTU da 0,2 mM. Per sciogliere completamente l'Mtz, mescolare la soluzione a RT con agitazione rapida per 20-30 minuti. Per aiutare a solubilizzare Mtz e migliorare la permeazione Mtz nelle larve, aggiungere DMSO durante la preparazione di Mtz.
   ATTENZIONE: l'esposizione prolungata o l'aumento della concentrazione di Mtz è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate.
2. Separare le larve in gruppi di controllo e sperimentali trasferendo il numero desiderato di larve in due diverse piastre di petri da 100 mm o piastra multi-pozzo. Per il gruppo sperimentale, mantenere le larve in soluzione Mtz da 10 mM; per il gruppo di controllo, conservarli in acqua di uova contenente lo 0,2% di DMSO.
3. Coprire le piastre o le piastre di petri contenenti la soluzione Mtz con un foglio di alluminio per evitare la foto-inattivazione di Mtz e incubare a 28 °C. La durata del trattamento Mtz dipende dallo stadio larvale e dalla linea transgenica.

3. Analisi della rigenerazione epatica guidata da biliari

1. Alla fine del periodo di ablazione, rimuovere la soluzione Mtz dalle piastre. Lavare le larve trattate con Mtz aggiungendo 25 ml di acqua d'uovo. Ruotare il piatto 2-3 volte per lavare le larve prima di scartare l'acqua dell'uovo. Ripetere tre volte e quindi immergere nuovamente le larve nell'acqua delle uova. Per evitare edema cardiaco e morte larvale nelle larve trattate con Mtz, aggiungere una concentrazione inferiore di Tricaina, a una concentrazione finale dello 0,008%, per immobilizzare le larve.
2. Per l'analisi del fegato, esaminare le dimensioni epatiche delle larve trattate con Mtz al microscopio a epifluorescenza con il filtro CFP. Valutare i livelli di ablazione degli epatociti in base alle dimensioni relative del fegato: grandi (non ablati; larve 0-10%), medie (parzialmente ablate; 10-20%) e molto piccole (completamente ablate; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA