Overview
本文描述了靶向肝消融，这是一种在转基因斑马鱼幼虫中用甲基苯丙酮诱导肝细胞死亡的方法。样本协议描述了斑马鱼产生、操纵和评估目标肝消融的过程。
Protocol
1. 胚胎/幼虫的准备
- 将100个胚胎转移到100毫米的培养皿中，并加入25毫升的蛋水。每个培养皿的胚胎不超过100个，并在28°C时进行培养。
- 为了抑制色素化，在受精后 10 小时 （hpf） 之前将苯甲基硫尿 （PTU） 添加到培养皿中，并将胚胎/幼虫培养至 80 hpf。PTU 的最终浓度为 0.2 mM。
警告：PTU是有毒的。按照适当的处理准则使用。 - 麻醉幼虫，在培养皿中加入3-氨基苯甲酸乙酯（三甲酸），最终浓度为0.016%。然后，使用表观荧光显微镜，对CFP阳性幼虫进行排序。使用肝脏大小相似的幼虫，丢弃肝脏较小或较大的幼虫。
注意：任何CFP阳性幼虫，无论强度如何，都可以使用，因为同源幼虫和同源幼虫之间的肝细胞消融程度没有差异。
警告：三角是有毒的。按照适当的处理准则使用。 - 取出含有三卡因的蛋水，并加入补充 0.2 mM PTU 的鸡蛋水。将胚胎/幼虫保持在28°C。
2. Mtz 治疗
- 通过在 100 毫升蛋水中溶解 0.171 克 Mtz 粉末，并辅以 0.2% DMSO 和 0.2 mM PTU，准备新鲜的 10 mM Mtz 解决方案。要完全溶解 Mtz，请将 RT 溶液与快速搅拌混合 20-30 分钟。为了帮助溶解Mtz，并增强Mtz渗透到幼虫中，在准备Mtz时添加DMSO。
注意：长时间暴露或增加Mtz浓度是有毒的。按照适当的处理准则使用。 - 将幼虫分成控制组和实验组，将所需的幼虫数量转移到两个不同的100毫米培养皿或多井板中。对于实验组，将幼虫保存在10mM Mtz溶液中：对于对照组，将其保存在含有0.2%DMSO的鸡蛋水中。
- 用铝箔覆盖含有 Mtz 溶液的盘子或培养皿，以防止 Mtz 的照片失活，并在 28 °C 下孵化。 Mtz 治疗的持续时间取决于幼虫阶段和转基因系。
3. 胆汁驱动的肝脏再生分析
- 在消融期结束时，从板中取出 Mtz 溶液。加入25毫升蛋水，清洗Mtz处理的幼虫。在丢弃蛋水之前，将盘子旋转2-3次以清洗幼虫。重复三次，然后再次将幼虫浸入蛋水中。为了避免Mtz治疗的幼虫中的心脏水肿和幼虫死亡，在最终浓度为0.008%时加入较低的三卡因浓度，以固定幼虫。
- 有关肝脏分析，请使用 CFP 过滤器在显微镜下检查 Mtz 处理幼虫的肝脏大小。根据相对肝脏大小评估肝细胞消融水平：大（非消融;0-10%幼虫）、中等（部分消融;10-20%）和非常小（完全消融;80-90%）。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA |
