Ablação hepática direcionada: Induzir morte de hepatocito com Metronidazol em Larvas transgênicas de zebrafish

Overview

O artigo descreve a ablação hepática direcionada, um método para induzir a morte de hepatocitte com metronidazol em larvas transgênicas de zebrafish. O protocolo amostral descreve o processo de geração, manipulação e avaliação da ablação hepática direcionada em zebrafish.

Protocol

1. Preparação de embriões/larvas

1. Transfira 100 embriões para uma placa de petri de 100 mm com 25 ml de água de ovo. Mantenha não mais do que 100 embriões por placa de petri e elevá-los a 28 °C.
2. Para inibir a pigmentação, adicione fenilhiourea (PTU) nas placas de petri antes das 10 horas pós-fertilização (hpf), e eleve embriões/larvas até 80 hpf. A concentração final de PTU é de 0,2 mM.
   ATENÇÃO: A TEPT é tóxica. Use de acordo com as diretrizes de manuseio adequadas.
3. Anestesiar as larvas adicionando 3 amino benzoicos ácidos etil ester (Tricaine), em uma concentração final de 0,016%, nas placas de petri. Em seguida, usando um microscópio de epifluorescência, classifique larvas positivas cfp. Use larvas com tamanho de fígado semelhante e descarte aquelas com um fígado menor ou maior.
   NOTA: qualquer larva cfp positiva, independentemente da intensidade, pode ser utilizada porque não há diferença na extensão da ablação hepatocitada entre as larvas hemizigólicas e homozigosas.
   ATENÇÃO: a tricaine é tóxica. Use de acordo com as diretrizes de manuseio adequadas.
4. Retire a água do ovo que contém Tricaine e adicione água de ovo suplementada com 0,2 mM PTU. Mantenha os embriões/larvas a 28 °C.

2. Tratamento mtz

1. Prepare a solução fresca de 10 mM Mtz dissolvendo 0,171 g de pó Mtz em 100 ml de água de ovo suplementada com DMSO de 0,2% e 0,2 mM PTU. Para dissolver completamente o Mtz, misture a solução em RT com agitação rápida por 20-30 minutos. Para ajudar a solubilizar Mtz e melhorar a permeação de Mtz nas larvas, adicione DMSO ao preparar Mtz.
   ATENÇÃO: a exposição prolongada ou o aumento da concentração de Mtz é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manuseio adequadas.
2. Separe as larvas em grupos de controle e experimentais transferindo o número desejado de larvas em duas placas de petri diferentes de 100 mm ou placa multi-bem. Para o grupo experimental, mantenha as larvas em solução Mtz de 10 mM; para o grupo controle, mantenha-os em água de ovo contendo 0,2% DMSO.
3. Cubra as placas ou placas de petri contendo a solução Mtz com papel alumínio para evitar a foto-inativação de Mtz e incubar a 28 °C. A duração do tratamento de Mtz depende do estágio larval e da linha transgênica.

3. Análise da regeneração hepática movida por biliar

1. No final do período de ablação, remova a solução Mtz das placas. Lave as larvas tratadas com Mtz adicionando 25 ml de água de ovo. Gire a placa 2-3 vezes para lavar as larvas antes de descartar a água do ovo. Repita três vezes e depois mergulhe as larvas mais uma vez na água do ovo. Para evitar edema cardíaco e morte larval nas larvas tratadas com Mtz, adicione uma menor concentração de Tricaine, em uma concentração final de 0,008%, para imobilizar as larvas.
2. Para análise hepática, examine o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz sob um microscópio de epifluorescência com o filtro CFP. Avaliar os níveis de ablação hepatocito com base no tamanho relativo do fígado: grande (não ablado; 0-10% larvas), médio (parcialmente ablado; 10-20%) e muito pequeno (totalmente ablado; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA