Overview
تصف المقالة استئصال الكبد المستهدف ، وهو طريقة لتحفيز موت خلايا الكبد مع الميترونيدازول في يرقات حمار وحشي معدلة وراثيا. يصف بروتوكول العينة عملية توليد ومعالجة وتقييم استئصال الكبد المستهدف في سمك الحمار الوحشي.
Protocol
1. إعداد الأجنة / اليرقات
- نقل 100 جنين إلى طبق بتري 100 ملم مع 25 مل من ماء البيض. احتفظ بما لا يزيد عن 100 جنين لكل طبق بتري وربيها عند 28 درجة مئوية.
- لتثبيط التصبغ، أضف الفينيلثيوريا (PTU) إلى أطباق البتري قبل 10 ساعات بعد الإخصاب (hpf)، ورفع الأجنة / اليرقات حتى 80 حصان. التركيز النهائي ل PTU هو 0.2 mM.
تنبيه:وحدة مكافحة الإرهاب سامة. الاستخدام وفقا لإرشادات المناولة المناسبة. - تخدير اليرقات عن طريق إضافة 3-أمينية حمض البنزويك إيثيل استر (تريكين)، بتركيز نهائي من 0.016٪، في أطباق بيتري. ثم ، باستخدام المجهر epifluorescence ، فرز اليرقات إيجابية CFP. استخدم اليرقات ذات حجم كبد مماثل وتخلص من تلك التي بها كبد أصغر أو أكبر.
ملاحظة:يمكن استخدام أي يرقات إيجابية CFP ، بغض النظر عن شدتها ، لأنه لا يوجد فرق في مدى استئصال خلايا الكبد بين يرقات hemizygous و homozygous.
تنبيه: tricaine سامة. الاستخدام وفقا لإرشادات المناولة المناسبة. - إزالة ماء البيض التي تحتوي على Tricaine وإضافة ماء البيض تستكمل مع 0.2 M M وحدة حرارية بريطانية. الحفاظ على الأجنة / اليرقات عند 28 درجة مئوية.
2. Mtz العلاج
- إعداد الطازجة 10 MM Mtz الحل عن طريق حل 0.171 غرام من مسحوق ميتز في 100 مل ماء البيض تكملها مع 0.2٪ DMSO و 0.2 M M وحدة حرارية بريطانية. لإذابة Mtz تماما، اخلطي الحل في RT مع التحريك السريع لمدة 20-30 دقيقة. للمساعدة في تشحيم Mtz وتعزيز تتغلغل Mtz في اليرقات ، أضف DMSO عند إعداد Mtz.
تنبيه:التعرض لفترات طويلة أو زيادة تركيز متز سامة. الاستخدام وفقا لإرشادات المناولة المناسبة. - قم بفصل اليرقات إلى مجموعات تحكم وتجريبية عن طريق نقل العدد المطلوب من اليرقات إلى طبقين بتري مختلفين عيار 100 مم أو طبق متعدد الآبار. بالنسبة للمجموعة التجريبية ، احتفظ باليرقات في محلول Mtz 10 mM ؛ لمجموعة التحكم، والاحتفاظ بها في ماء البيض التي تحتوي على 0.2٪ DMSO.
- تغطية لوحات أو أطباق بيتري التي تحتوي على محلول ميتز مع رقائق الألومنيوم لمنع تعطيل الصورة من ميتز، واحتضان في 28 درجة مئوية. تعتمد مدة علاج Mtz على مرحلة اليرقات والخط المعدل وراثيا.
3. تحليل تجديد الكبد القائم على الصفراوية
- في نهاية فترة الاستئصال، قم بإزالة محلول Mtz من اللوحات. اغسل اليرقات المعالجة ب Mtz بإضافة 25 مل من ماء البيض. دوامة لوحة 2-3 مرات لغسل اليرقات قبل التخلص من ماء البيض. كرر ثلاث مرات ثم تزج اليرقات مرة أخرى في ماء البيض. لتجنب وذمة القلب وموت اليرقات في اليرقات المعالجة ب Mtz ، أضف تركيزا أقل من Tricaine ، بتركيز نهائي قدره 0.008٪ ، لشل حركة اليرقات.
- لتحليل الكبد ، قم بفحص حجم الكبد لليرقات المعالجة ب Mtz تحت مجهر الفلورورية مع فلتر CFP. تقييم مستويات الاستئصال الكبدي على أساس حجم الكبد النسبي: كبير (غير مشحوب؛ 0-10٪ يرقات)، متوسط (مشحح جزئيا؛ 10-20٪)، وصغير جدا (مائل بالكامل؛ 80-90٪).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA |
