3D 배양 지하 막 분석: 세포 침공을 연구하기 위해 3D 지하 막 단백질 매트릭스에 암세포를 배양

Overview

이 비디오는 3D 지하 막 단백질 매트릭스에서 유방암 세포를 성장시키는 상세한 방법론을 제공하여 주변 환경으로의 세포 침입 평가에서 3D 배양의 잠재력을 예시합니다.

Protocol

1. 지하 막 매트릭스에서 유방암 세포의 3 차원 배양 (임베먼트 기술)

1. 마모리겔 지하 멤브레인 매트릭스 처리: 4°C에서 하룻밤 동안 얼음에 해동. 지하 멤브레인 매트릭스는 저온에서 액체이지만 실온에서 고화됩니다. 얼음에 지하 막 매트릭스를 유지(그림 1A-B).
2. 나선형 패턴으로 P-200 Pipetman의 끝을 사용하여 매트릭스를 확산시켜 지하 멤브레인 매트릭스의 50 μl으로 공초점 No.1 유리 바닥 접시를 덮는다(도 1C). 기포의 형성을 피하기 위해 지하 멤브레인 매트릭스를 확산 할 때주의하십시오. 마찬가지로 반월 상 연골 형성을 방지하기 위해 유리 바닥 접시의 경계에 가깝게 매트릭스를 퍼뜨리지 마십시오. 미숙한 처리 지하 멤브레인 매트릭스경우, 접시를 미리 냉각한 다음 P-200 Pipetman 및 파이펫이 얼음 위에 있을 수 있습니다(또는 4°C의 냉장고에 하룻밤 동안 방치). 이 단계는 응고하기 전에 지하 막 매트릭스를 확산하는 추가 시간을 제공합니다. 상기 상기 디쉬(es)를 세포배양인배양(37°C에서 5% CO2)에 30분 이상 배치하여 지하 막 매트릭스가 고화(도1D)를가능하게 한다.
3. 매트릭스가 응고를 받는 동안, 트립시니화70-80% 컨할락수 100mm 의 셀 플레이트. 일단 세포가 플레이트에서 들어올리기 시작하면, 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 1640 배지 10ml에서 이를 재연하여 트립신(도 1E)을 비활성화한다. 그런 다음 다시 중단된 세포를 15ml 원문튜브(도 1F)로옮킨다.
4. 전용 세포 배양 원심분리기(그림1G-H)에서3분 동안 100 x g에서 세포(원상관에 존재)를 회전시한다.
5. 세포가 아래로 스펀되는 동안, 1 ml 마이크로 센트 심분리기 튜브에 매트릭스의 알리 쿼트 50 μl (참고 : 각 유리 바닥 접시는 하나의 미세 원심 분리기 튜브를 할당; 따라서, 실험이 필요한 경우 3 접시, 다음 3 미세 원심 분리 튜브뿐만 아니라 필요하다는 것을 다음과, 다음 얼음에 튜브를 배치(그림 1B).
6. 원물 튜브로부터 배지를 1.4단계에서 흡인하고 펠릿을 방해하지 않고 방치한다(도1I). FBS 보충 RPMI 배지의 1 ml에서 세포 (아래로 스펀 된) 재중단(도 1J).
7. 세포가 혈류계(도 1K) 또는 세포 입자 카운터 알리쿼트 2.5 x 104 세포를 마이크로센트심분리기 튜브로 계산하고 적절한 매체를 사용하여 위로 올라가서 총 50 μl(도1L)을얻습니다.
8. 1단계 1.7(50 μl에서 25,000세포)에서 세포를 1:1 비율로 1.5단계에서 매트릭스 함유 미세원심분리기 튜브와 혼합; 최종 부피는 100 μl(그림1M)입니다.
9. 매트릭스의 100 μl을 부드럽게 판화: 1.8 단계에서 세포 혼합물을 고화 된 지하 막 매트릭스 코팅 접시에 1.2 단계(도 1N). 이를 통해 세포가 지하 막 매트릭스에 내장될 수 있습니다.
10. 접시(es)를 세포 배양 인큐베이터(5%CO2로 37°C)로 옮기고 매트릭스:셀 혼합물이 30분 이상 고화되도록 한다.
11. 매트릭스:세포 혼합물이 고화되면, 접시에 FBS 보충 RPMI 매체 2ml를추가하고(도 1O)나머지 실험에 저장될 인큐베이터를 다시 접시를 가져 가라(도1P).
12. 매일 5일 동안 미디어를 변경합니다(또는 분석에 필요한 경우, MDA-MB-231 셀에 대한 분석 기간은 길이가 5일입니다).
13. 경현미경을 이용하여, 지하막 매트릭스에서 중단된 MDA-MB-231 콜로니의 차동 간섭 대비(DIC) 영상을 취한다(도2A). 이미지 20 대표 영역은 식민지 형태 발생(그림 2C)을 결정하기 위해 5일 동안 하루에 한 번 10X 목표에서10배의 목표이다.
14. 맹목적으로 이미지를 분석하여 세포 식민지 형성(도2B)을결정합니다. 식민지는 세포의 스페로이드에서 하나 이상의 투영이 인식되는 경우에 stellate 것으로 간주됩니다. 침습적 인 stellate 콜로니의 비율을 결정하기 위해, 획득 된 이미지 당 세포 식민지의 총 수로 stellate 식민지의 수를 분할한 다음 매일 20 이미지의 스텔레이트 콜로니 비율을 평균합니다.

Representative Results

그림 1. 지하 막 매트릭스에서 MDA-MB-231 유방암 세포의 3차원 배양 (임베디드 기술). A-B) 실험용 설정의 회로도(연기 후드에서 수행). C) 지하 멤브레인 매트릭스의 50 μl로 코팅 유리 바닥 접시의 우물. D) 접시(es)는 세포 배양 인큐베이터(37°C에서 5% CO2)에 배치되어 매트릭스가 적어도 30분 동안 고화되는 것을 허용하였다. F) 세포는 15ml 원문 관으로 재축되었다. G-H) 세포(원색 관에 존재)는 조직 배양 원심분리기에서 3분 동안 100 x g로 분해하였다. I) 셀 펠릿. J) 세포(즉, 아래로 스펀)는 FBS 보충 RPMI 배지 의 1 ml에서 재중단되었다. K) 세포는 혈종계를 사용하여 계산하였다. L) 2.5 x 104 세포가 마이크로 센심 분리기 튜브에 알리인용되어 적절한 매체를 사용하여 50 μl의 총 부피를 얻었다. M) 1단계 1.5에서 1.5단계로부터 매트릭스 함유 미세원심분리기 튜브와 1.7(50 μl내 25,000세포)로부터 세포를 혼합; 최종 부피는 100 μl이 됩니다. N) 매트릭스의 100 μl을 부드럽게 판: 8단계에서부터 고화매트릭스 코팅 된 접시에 세포 혼합물을 1.2 단계로부터 부드럽게 플레이트. O) 매트릭스 :세포 혼합물이 고화되면, 접시에 FBS 보충 RPMI 매체 2 ml을 추가합니다. P) 접시를 인큐베이터에 놓고 나머지 실험을 위해 보관합니다.

그림 2. 대표 이미지의 이미지 수집 및 일러스트레이션. A) 현미경으로 찍은 이미지. B) 이미지 및 이후 이미지를 획득하는 데 사용되는 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 이미징 현미경및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된 이미지. C) MDA-MB-231 세포의 샘플 대표 DIC 이미지 (5 일 동안 하루에 한 번 촬영)가 표시됩니다. 단방향 ANOVA 다음에 던넷의 여러 비교 테스트: *, P< 0.05. 스케일 바, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)