Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
أولا، صب مصفوفة غشاء الطابق السفلي الباردة في طبق الزجاج القاع ونشرها بالتساوي مع طرف ماصة. دع الغشاء يترسخ عند 37 درجة مئوية ، مع إمدادات مستمرة من ثاني أكسيد الكربون. جرب الخلايا السرطانية ذات العلامات الفلورية لفصلها عن سطح اللوحة وإعادة إنفاقها في وسط ثقافي.
نقل هذه الخلايا resuspended في أنبوب مخروطي وتدور. إزالة supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في وسط الثقافة. بعد العد، اخلط تعليق الخلية هذا الذي يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا مع مصفوفة الطابق السفلي بنسبة متساوية.
لوحة بلطف خليط مصفوفة الخلية على طبق غشاء غشاء الطابق السفلي الصلبة المغلفة. دع خليط مصفوفة الخلية يترسخ عند 37 درجة مئوية ، مع إمدادات مستمرة من ثاني أكسيد الكربون. بمجرد أن يتماسك الخليط، أضف وسيط الثقافة إلى الطبق واحتضانه للفترة المطلوبة.
يمكن أن تشكل الخلايا السرطانية نتوءات غشاء غنية بال أكتين ، وتطلق البروتياز لتحلل المصفوفة خارج الخلية ، وبالتالي غزو المصفوفة. ضع الطبق تحت مجهر فلوري على فترات زمنية مختلفة لتحليل الخلايا التي تشكل نتوءات. في بروتوكول المثال، سنقوم بزراعة خلايا سرطان الثدي على مصفوفة غشاء الطابق السفلي ثلاثي الأبعاد لدراسة عملية الغزو.
قبل البدء في إجراء الثقافة، ضع مصفوفة غشاء الطابق السفلي، ونصائح P200 ماصة وماصة على الجليد بين عشية وضحاها، في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، استخدم غيض من ماصة الجليد الباردة 200 ميكرولتر لنشر 50 ميكرولتر من المصفوفة في نمط حلزوني على الجزء السفلي من طبق كونفوجال رقم 1 الزجاج القاع. ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، لمدة 30 دقيقة على الأقل.
في حين أن المصفوفة تمر التصلب، جرب 70٪ إلى 80٪ التقاء لوحة من الخلايا 100 ملليمتر. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الانفصال ، قم بتعطيل التريبسين مع 10 ملليلتر من المتوسط ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
الطرد المركزي الخلايا لمدة ثلاث دقائق في 100 Gs و 4 درجة مئوية. في حين أن الخلايا تدور إلى أسفل، aliquot 50 ميكرولتر من مصفوفة في أنبوب واحد 1 ملليلتر الطرد المركزي الدقيق لكل طبق من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ووضع الأنابيب على الجليد. عندما تنتهي الخلايا من الدوران ، يستنشق العملاق دون إزعاج بيليه ثم يعيد إنفاق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسائط وإحصائها.
بعد ذلك، نقل 2.5 مرات 10 إلى الخلايا 4 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد، تتصدر قبالة تعليق الخلية مع وسائل الإعلام إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر. ثم أضف 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي البارد الجليدي إلى الخلايا بنسبة 1:1 ، لحجم نهائي قدره 100 ميكرولتر. لوحة بلطف المصفوفة إلى خليط الخلية على مصفوفة غشاء الطابق السفلي الصلبة والسماح للخلايا لتصبح جزءا لا يتجزأ من المصفوفة في حاضنة ثقافة الخلية.
بعد 30 دقيقة، قم بتغطية المصفوفة بمليلترين من الوسائط، ثم ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة، وغير الوسائط كل يوم طوال مدة التجربة. استخدم الهدف 10x من المجهر الخفيف مرة واحدة كل يوم طوال مدة التجربة لالتقاط 20 صورة تباين تداخل تفاضلي للمستعمرة المعلقة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. تحليل الصور بشكل أعمى لتحديد تشكيل الخلايا ستيلاتي مستعمرة. تعتبر المستعمرة ستيلاتية إذا لوحظ إسقاط واحد أو أكثر من كروية الخلايا.
