Analyse de membrane de sous-sol de culture 3D : Culturing Cellules cancéreuses sur la matrice de protéine de membrane de sous-sol 3D pour étudier l’invasion cellulaire

Tout d’abord, versez la matrice froide de membrane de sous-sol dans un plat en verre-fond et étalez-la uniformément avec une pointe de pipette. Laissez la membrane se solidifier à 37 degrés Celsius, avec un approvisionnement continu en dioxyde de carbone. Essayez de trypsiniser les cellules cancéreuses étiquetées fluorescentes pour les détacher de la surface de la plaque et les réutiliser dans un milieu de culture.

Transférez ces cellules résuspendées dans un tube conique et tournez. Enlever le surnatant et réutiliser les cellules dans le milieu de la culture. Après compter, mélanger cette suspension cellulaire contenant le nombre désiré de cellules avec la matrice du sous-sol dans un rapport égal.

Plaquez délicatement le mélange de matrice cellulaire sur le plat enduit de matrice de membrane de sous-sol solidifié. Laissez le mélange de matrice cellulaire se solidifier à 37 degrés Celsius, avec un approvisionnement continu en dioxyde de carbone. Une fois que le mélange se solidifie, ajouter le milieu de culture au plat et l’incuber pendant la période désirée.

Les cellules cancéreuses peuvent former des saillies membranaires riches en actine, et libérer des protéases pour dégrader la matrice extracellulaire, envahissant ainsi la matrice. Placez le plat sous un microscope fluorescent à différents intervalles de temps pour analyser les cellules formant des saillies. Dans le protocole d’exemple, nous allons la culture des cellules cancéreuses du sein sur une matrice membranaire du sous-sol 3D pour étudier le processus d’invasion.

Avant de commencer la procédure de culture, placez la matrice membranaire du sous-sol, une pipette P200 et des pointes de pipette sur la glace pendant la nuit, à 4 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez la pointe de la pipette glacée de 200 microlitres pour étendre 50 microlitres de la matrice en spirale au fond d’un plat confocal numéro 1 à fond de verre. Ensuite, placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone, pendant au moins 30 minutes.

Alors que la matrice est en cours de solidification, trypsiniser une plaque de 70% à 80% confluent 100 millimètres de cellules. Une fois que les cellules ont commencé à se détacher, inactiver la trypsine avec 10 millilitres de milieu, puis transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifuger les cellules pendant trois minutes à 100 Gs et 4 degrés Celsius. Pendant que les cellules tournent vers le bas, aliquot 50 microlitres de matrice dans un tube de microcentrifugeuse de 1 millilitre par plat de matrice de membrane de sous-sol et placent les tubes sur la glace. Lorsque les cellules ont fini de tourner, aspirer le supernatant sans déranger la pastille, puis resuspendre les cellules en 1 millilitre de médias et les compter.

Ensuite, transférez 2,5 fois 10 à la 4ème cellule dans un nouveau tube de microcentrifugeuse, en issant la suspension cellulaire avec des supports à un volume final de 50 microlitres. Ajoutez ensuite les 50 microlitres de la matrice membranaire glacée du sous-sol aux cellules à un rapport de 1:1, pour un volume final de 100 microlitres. Plaquez doucement la matrice au mélange cellulaire sur la matrice solidifiée de membrane de sous-sol et permettez aux cellules de s’intégrer dans la matrice dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après 30 minutes, couvrir la matrice de 2 millilitres de médias, et remettre le plat dans l’incubateur, en changeant les médias tous les jours pendant toute la durée de l’expérience. Utilisez l’objectif 10x d’un microscope léger une fois par jour pendant toute la durée de l’expérience pour prendre 20 images différentielle de contraste d’interférence de la colonie suspendues dans la matrice membranaire du sous-sol. Analyser les images à l’aveuglette pour déterminer la formation stellaire de la colonie cellulaire. Une colonie est réputée stellaire si l’on observe une ou plusieurs projections du sphéroïde des cellules.