Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
ראשית, יוצקים מטריצת קרום מרתף קרה בצלחת תחתית זכוכית ומפיצים אותה באופן שווה עם קצה פיפטה. תן לקרום להתחזק ב-37 מעלות צלזיוס, עם אספקה רציפה של פחמן דו-חמצני. טריפסיניזציה של תאים סרטניים עם תווית פלואורסצנטית כדי לנתק אותם מפני השטח של הלוחית ולהניח אותם מחדש במדיום תרבות.
העבר תאים אלה לשימוש חוזר לתוך צינור חרוט וספין. הסר את supernatant ו resuspend התאים במדיום התרבות. לאחר הספירה, מערבבים את השעיית התא המכילה את מספר התאים הרצוי עם מטריצת המרתף ביחס שווה.
בעדינות צלחת תערובת מטריצת התא על צלחת מטריצת מרתף מוצק מצופה. תן לתערובת מטריצת התאים להתחזק ב-37 מעלות צלזיוס, עם אספקה רציפה של פחמן דו חמצני. לאחר שהתערובת מתגבשת, מוסיפים מדיום תרבות למנה ומדגירה אותה לתקופה הרצויה.
תאים סרטניים יכולים ליצור בליטות קרום עשירות באקטין, ולשחרר פרוטאזות כדי להשפיל את המטריצה החוץ תאית, ובכך לפלוש למטריצה. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במרווחי זמן שונים כדי לנתח את התאים היוצרים בליטות. בפרוטוקול הדוגמה, נרבה תאים סרטניים בשד על מטריצת קרום מרתף תלת מימדית כדי לחקור את תהליך הפלישה.
לפני תחילת הליך התרבות, מניחים את מטריצת קרום המרתף, פיפטה P200 וטיפים פיפט על קרח לילה, ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, השתמש בקצה של פיפטה 200 מיקרוליטר קר כקרח כדי להפיץ 50 microliters של המטריצה בתבנית ספירלה מעל החלק התחתון של צלחת Confocal מספר 1 זכוכית תחתית. ואז למקם את המנה באינקובטור תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, לפחות 30 דקות.
בעוד המטריצה עוברת התמצקות, לנסות 70% עד 80% משולב צלחת 100 מילימטר של תאים. ברגע שהתאים החלו להתנתק, להשבית את טריפסין עם 10 מיליליטר של בינוני ולאחר מכן להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר.
צנטריפוגה התאים במשך שלוש דקות ב 100 Gs ו 4 מעלות צלזיוס. בזמן שהתאים מסתובבים למטה, aliquot 50 microliters של מטריקס לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד 1 מיליליטר לכל צלחת של מטריצת קרום מרתף ומניחים את הצינורות על קרח. כאשר התאים סיימו להסתובב, לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולה ולאחר מכן resuspend התאים ב 1 מיליליטר של מדיה לספור אותם.
לאחר מכן, להעביר 2.5 פעמים 10 לתאים 4 לתוך צינור microcentrifuge חדש, ציפוי את המתלה התא עם מדיה לנפח הסופי של 50 microliters. לאחר מכן הוסיפו את 50 המיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח לתאים ביחס של 1:1, לנפח סופי של 100 מיקרוליטרים. בעדינות צלחת את המטריצה לתערובת תאים על מטריצת קרום מרתף מוצק ולאפשר לתאים להיות מוטבעים במטריצה באינקובטור תרבות התא.
לאחר 30 דקות, לכסות את המטריצה עם 2 מיליליטר של מדיה, ומניחים את המנה בחזרה לתוך החממה, שינוי התקשורת כל יום למשך הניסוי. השתמש במטרה 10x של מיקרוסקופ אור פעם ביום למשך הניסוי לקחת 20 תמונות ניגוד הפרעה דיפרנציאלית של המושבה תלויה במטריצת קרום המרתף. לנתח את התמונות באופן עיוור כדי לקבוע את היווצרות כוכבי מושבת התא. מושבה נחשבת לסטלה אם נצפו תחזיות אחת או יותר מהספרואיד של התאים.
