Ensayo de membrana del sótano de cultivo 3D: Culturing Cancer Cells on 3D Basement Membrane Protein Matrix to Study Cell Invasion

Primero, vierta la matriz de membrana fría del sótano en un plato con fondo de vidrio y esparce uniformemente con una punta de pipeta. Deje que la membrana se solidifique a 37 grados Centígrados, con un suministro continuo de dióxido de carbono. Trate de probar las células cancerosas etiquetadas fluorescentemente para separarlas de la superficie de la placa y volver a usarlas en un medio de cultivo.

Transfiera estas células resuspended a un tubo cónico y gire. Retire el sobrenadante y vuelva a abrir las celdas en el medio de cultivo. Después de contar, mezcle esta suspensión celular que contiene el número deseado de células con la matriz del sótano en una proporción igual.

Coloque suavemente la mezcla de matriz celular en el plato solidificado recubierto de matriz de membrana del sótano. Deje que la mezcla de matriz celular se solidifique a 37 grados Centígrados, con un suministro continuo de dióxido de carbono. Una vez que la mezcla se solidifique, agregue el medio de cultivo al plato e incubarlo durante el período deseado.

Las células cancerosas pueden formar protuberancias de membrana ricas en actina, y liberar proteasas para degradar la matriz extracelular, invadiendo así la matriz. Coloque el plato bajo un microscopio fluorescente en diferentes intervalos de tiempo para analizar las células que forman protuberancias. En el protocolo de ejemplo, cultivaremos células de cáncer de mama en una matriz de membrana del sótano 3D para estudiar el proceso de invasión.

Antes de comenzar el procedimiento de cultivo, coloque la matriz de membrana del sótano, una pipeta P200 y puntas de pipeta sobre hielo durante la noche, a 4 grados Celsius. Al día siguiente, utilice la punta de la pipeta helada de 200 microlitros para extender 50 microlitros de la matriz en un patrón espiral sobre la parte inferior de un plato confocal número 1 de fondo de vidrio. Luego coloca el plato en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius, con 5% de dióxido de carbono, durante al menos 30 minutos.

Mientras que la matriz está en proceso de solidificación, intentes hacer una placa de células de 70% a 80% confluente de 100 milímetros. Una vez que las células han comenzado a desprenderse, inactive la triptina con 10 mililitros de medio y luego transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrífuga las células durante tres minutos a 100 Gs y 4 grados Celsius. Mientras las células giran hacia abajo, aliquot 50 microlitros de matriz en un tubo de microcentrífuga de 1 mililitro por plato de matriz de membrana del sótano y colocar los tubos en hielo. Cuando las células hayan terminado de girar, aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet y luego resuspend las células en 1 mililitro de medios y contarlas.

A continuación, transfiera 2,5 por 10 a las 4.ªs células a un nuevo tubo de microcentrífuga, rematando la suspensión celular con medios a un volumen final de 50 microlitros. A continuación, agregue los 50 microlitros de matriz de membrana del sótano frío al hielo a las células con una relación de 1:1, para un volumen final de 100 microlitros. Coloque suavemente la matriz en la mezcla celular en la matriz de membrana del sótano solidificada y permita que las células se incrusifiquen en la matriz en la incubadora de cultivo celular.

Después de 30 minutos, cubra la matriz con 2 mililitros de medios, y coloque el plato de nuevo en la incubadora, cambiando los medios todos los días durante la duración del experimento. Utilice el objetivo 10x de un microscopio de luz una vez al día durante la duración del experimento para tomar 20 imágenes de contraste de interferencia diferencial de la colonia suspendidas en la matriz de membrana del sótano. Analice las imágenes a ciegas para determinar la formación estelar de la colonia celular. Una colonia se considera estelar si se observan una o más proyecciones del esferoide de las células.