Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
İlk olarak, soğuk bodrum membran matrisini cam tabanlı bir tabağa dökün ve pipet ucuyla eşit şekilde yayın. Membran, sürekli karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede katılaşın. Floresan etiketli kanser hücrelerini plaka yüzeyinden ayırmak ve bir kültür ortamında yeniden depolamak için deneyin.
Bu yeniden dirilen hücreleri konik bir tüpe aktarın ve döndürün. Süpernatant kaldırın ve kültür ortamındaki hücreleri yeniden biriktirin. Saydıktan sonra, istenen sayıda hücre içeren bu hücre süspansiyonu ile bodrum matrisini eşit oranda karıştırın.
Hücre matrisi karışımını katılaşmış bodrum membran matrisi kaplı kabın üzerine hafifçe plakalayın. Hücre matrisi karışımının sürekli karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede katılaşmasını sağlayın. Karışım katılaştıktan sonra, yemeğe kültür ortamı ekleyin ve istediğiniz süre boyunca kuluçkaya yatırın.
Kanser hücreleri aksin bakımından zengin membran çıkıntıları oluşturabilir ve hücre dışı matrisi bozmak için proteazları serbest bırakabilir, böylece matrisi istila edebilir. Çıkıntı oluşturan hücreleri analiz etmek için yemeği farklı zaman aralıklarında floresan mikroskop altına yerleştirin. Örnek protokolde, istila sürecini incelemek için meme kanseri hücrelerini 3D bodrum membran matrisinde kültüre edeceğiz.
Kültür prosedürüne başlamadan önce, bodrum membran matrisini, bir P200 pipet ve pipet uçlarını bir gecede 4 santigrat derecede buza yerleştirin. Ertesi gün, buz gibi 200 mikrolitre pipet ucunu kullanarak matrisin 50 mikrolitresini spiral bir desende 1 numaralı cam taban kabının altına yayın. Daha sonra yemeği en az 30 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
Matris katılaşma sürecindeyken, %70 ila %80 bir konflüent 100 milimetrelik hücre plakasını deneyin. Hücreler kopmaya başladıktan sonra, tripini 10 mililitre orta ile aktif hale getir ve ardından hücre süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Hücreleri 100 Gs ve 4 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin. Hücreler aşağı dönerken, aliquot 50 mikrolitre matris, bodrum membran matrisinin çanağı başına bir 1 mililitre mikrosantrifüj tüpüne girer ve tüpleri buza yerleştirir. Hücreler dönmeyi bitirdiğinde, peleni bozmadan süpernatantı epire edin ve ardından hücreleri 1 mililitrelik medyada yeniden biriktirin ve sayın.
Daha sonra, 2,5 kez 10'u 4'üncü hücrelere yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, hücre süspansiyonunu ortamla 50 mikrolitrelik son bir hacme aktarın. Daha sonra 100 mikrolitrelik son hacim için 50 mikrolitre buz gibi bodrum membran matrisini hücrelere 1:1 oranında ekleyin. Matrisi hücre karışımına katılaştırılmış bodrum membran matrisine hafifçe plakalayın ve hücrelerin hücre kültürü inkübatöründeki matrise gömülmesini sağlar.
30 dakika sonra, matrisi 2 mililitre medya ile örtün ve çanağı tekrar inkübatöre yerleştirin, deney süresince her gün medyayı değiştirebilirsiniz. Bodrum membran matrisinde asılı koloninin 20 diferansiyel girişim kontrastı görüntüsü almak için deney süresince her gün bir ışık mikroskopunun 10x hedefini kullanın. Hücre kolonisi yıldız oluşumunu belirlemek için görüntüleri körü körüne analiz edin. Hücrelerin küreselinden bir veya daha fazla projeksiyon gözlenirse koloninin yıldız olduğu kabul edilir.
