3D-kultur Källare Membrananalys: Odling av cancerceller på 3D källarmembranproteinmatris för att studera cellinvasion

Overview

Denna video ger en detaljerad metodik för att odla bröstcancerceller i en 3D källarmembranproteinmatris, vilket exemplifierar potentialen hos 3D-kulturen vid bedömning av cellinvasion i den omgivande miljön.

Protocol

1. Tredimensionell kultur av bröstcancerceller i källarmembranmatris (inbäddningstekniken)

1. Hantering av Matrigel källarmembranmatris: Tina på is över natten vid 4 °C. Källarmembranmatrisen är flytande vid låg temperatur men stelnar vid rumstemperatur. Håll källarmembranmatrisen på is( figurerna 1A-B).
2. Täck den konfokala glasbottnen nr 1 med 50 μl källarmembranmatris genom att sprida matrisen med hjälp av spetsen på en P-200 Pipetman i ett spiralmönster (figur 1C). Var försiktig när du sprider källarmembranmatrisen för att undvika bildandet av luftbubblor. På samma sätt, undvik att sprida matrisen för att stänga gränserna för glasbottenskålen för att förhindra meniskbildning. Om oerfaren hantering källare membran matris, sedan precooled skålen, P-200 Pipetman och pipetter kan vara på is (alternativt lämnas över natten i ett kylskåp vid 4 °C). Detta steg ger ytterligare tid att sprida källarmembranmatrisen före stelning. Placera skålen(es) i en cellkulturinkubator (vid 37 °C med 5 % CO2) i minst 30 minuter så att källarmembranmatrisen kan stelna (figur 1D).
3. Medan matrisen genomgår stelning, trypsinize en 70-80% sammanflöde 100 mm platta av celler. När cellerna har börjat lyfta av plattan, återanvänd dem i 10 ml RPMI 1640 medium som innehåller 10% (v/v) fetala nötkreatursserum (FBS), för att inaktivera trypsin (figur 1E). Överför sedan de återanvända cellerna till ett 15 ml koniskt rör (Figur 1F).
4. Snurra cellerna (finns i koniskt rör) vid 100 x g i 3 min i en dedikerad cellkulturcentrifug (Figur 1G-H).
5. Medan cellerna snurras ner, alikvot 50 μl matris i ett 1 ml mikrocentrifugrör (obs: varje glasbottnad maträtt tilldelas ett mikrocentrifugrör; därför, om experimentet kräver 3 rätter, följer det att 3 mikrocentrifugrör också är nödvändiga) och placera sedan röret på is (Figur 1B).
6. Aspirera mediet från det koniska röret från steg 1.4, samtidigt som pelleten är ostörd (figur 1I). Återanvändbara celler (som har spunnits ned) i 1 ml FBS-kompletterat RPMI-medium (figur 1J).
7. När cellerna har räknats med hjälp av en hemocytometer (figur 1K) eller en cellpartikelräknare alikvot 2,5 x 104 celler i mikrocentrifugröret och toppa det med lämpligt medium för att erhålla en total volym på 50 μl (figur 1L).
8. Blanda cellerna från steg 1.7 (25 000 celler i 50 μl) med det matrisinnehållande mikrocentrifugröret från steg 1.5 i ett 1:1-förhållande. slutvolymen blir 100 μl (figur 1M).
9. Plätera försiktigt 100 μl av matrisen:cellblandning från steg 1.8 till den stelnade källarmembranmatrisbelagda skålen från steg 1.2 (Figur 1N). Detta gör det möjligt att bädda in celler i källarmembranmatrisen.
10. Överför skålen(es) till cellkulturinkubatorn (vid 37 °C med 5 % CO2) och låt matrisen:cellblandningen stelna i minst 30 minuter.
11. När matrisen:cellblandningen har stelnat, tillsätt 2 ml FBS-kompletterat RPMI-medium i skålen (figur 1O) och ta tillbaka skålen i inkubatorn där den kommer att lagras under återstoden av försöket (figur 1P).
12. Byt media varje dag under en period av 5 dagar (eller enligt vad som krävs för en analys; analysens varaktighet för MDA-MB-231-celler är 5 dagar lång).
13. Använd ett ljusmikroskop, ta DIC-bilder (Differential Interference Contrast) av MDA-MB-231-kolonierna upphängda i källarmembranmatris (Figur 2A). Bild 20 representativa områden vid 10X mål en gång om dagen i fem dagar för att bestämma kolonins morfogenes (Figur 2C).
14. Analysera bilder blint för att bestämma cellkolonins stellatbildning (Figur 2B). En koloni anses vara stellat om en eller flera projektioner från cellernas sfäroid uppfattas. För att bestämma procentandelen invasiva stellatkolonier, dividera antalet stellatkolonier med det totala antalet cellkolonier per förvärvad bild och sedan i genomsnitt stellatkolonierna procent av de 20 bilderna för varje dag.

Representative Results

Figur 1. Tredimensionell kultur av MDA-MB-231 bröstcancerceller i källaren membran matris (inbäddningstekniken). A-B) Ett schema över den experimentella installationen (utförs i rökhuven). C) Brunnen på den glasbottnade skålen belagd med 50 μl källarmembranmatris. D) Skålar(er) placerade i en cellkulturinkubator (vid 37 °C med 5% CO2) för att tillåta matrisen att stelna i minst 30 min. E) Cellerna trypsiniserades. F) Cellerna återanvändes i ett 15 ml koniskt rör. G-H) Celler (finns i koniskt rör) snurrades ner vid 100 x g i 3 min i en vävnad kultur centrifuge. I) Cellpellet. J) Celler (som har spunnits ner) återanvändes i 1 ml FBS-kompletterat RPMI-medium. K) Cellerna räknades med hjälp av en hemocytometer. L) 2,5 x 104 celler alikvoterade i mikrocentrifugröret och toppade med lämpliga medier för att erhålla en total volym på 50 μl. M) Blanda celler från steg 1.7 (25 000 celler i 50 μl) med det matrisinnehållande mikrocentrifugröret från steg 1.5 i ett 1:1-förhållande. slutvolymen blir 100 μl. N) Plätera försiktigt matrisens 100 μl: cellblandning från steg 8 till den stelnade matrisbelagda skålen från steg 1.2. O) När matrisen:cellblandningen har stelnat, tillsätt 2 ml FBS-kompletterat RPMI-medium till skålen. P) Placera skålen i inkubatorn där den kommer att förvaras under återstoden av försöket.

Figur 2. Bildförvärv och illustration av representativa bilder. A) Bilder tagna med mikroskop. B) Differential interferens kontrast (DIC) bild mikroskop används för att förvärva bilder och därefter bilder analyseras med hjälp av bild analys programvara. C) Exempel på representativa DIC-bilder av MDA-MB-231-celler (tagna en gång om dagen i fem dagar) visas. Enkelvägs ANOVA följt av Dunnetts flerfaldiga jämförelsetest: *, P < 0,05. Skalstång, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)