Ensaio de membrana de porão da cultura 3D: Culturing Cancer Cells on 3D Basement Membrane Protein Matrix to Study Cell Cell Invasion

Overview

Este vídeo fornece uma metodologia detalhada para o crescimento das células cancerígenas de mama em uma matriz proteica de membrana 3D, exemplificando o potencial da cultura 3D na avaliação da invasão celular no ambiente circundante.

Protocol

1. Cultura tridimensional de células cancerígenas de mama na Matriz de Membrana do Porão (Técnica de Incorporação)

1. Manuseando matrigel matriz de membrana do porão: Descongele no gelo durante a noite a 4 °C. A matriz de membrana do porão é líquida a baixa temperatura, mas se solidifica à temperatura ambiente. Mantenha a matriz de membrana do porão no gelo(Figuras 1A-B).
2. Cubra o prato confocal no.1 de fundo de vidro com 50 μl de matriz de membrana de porão por meio da disseminação da matriz usando a ponta de um Pipetman P-200 em um padrão espiral (Figura 1C). Tenha cuidado ao espalhar a matriz de membrana do porão para evitar a formação de bolhas de ar. Da mesma forma, evite espalhar a matriz para fechar as bordas do prato de fundo de vidro para evitar a formação de menisco. Se inexperientes manuseando a matriz de membrana do porão, então pré-cozido o prato, P-200 Pipetman e pipetas podem estar no gelo (alternativamente deixado durante a noite em uma geladeira a 4 °C). Esta etapa oferece tempo adicional para espalhar a matriz de membrana do porão antes da solidificação. Coloque o prato em uma incubadora de cultura celular (a 37 °C com 5% de CO2) por pelo menos 30 minutos para permitir que a matriz de membrana do porão se solidifique(Figura 1D).
3. Enquanto a matriz está passando por solidificação, trippsinize uma placa de 70-80% confluente de 100 mm de células. Uma vez que as células tenham começado a decolar da placa, resuspenque-as em 10 ml de RPMI 1640 médio contendo 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS), para inativar a trippsina (Figura 1E). Em seguida, transfira as células resuspended em um tubo cônico de 15 ml(Figura 1F).
4. Gire as células (presentes em tubo cônico) a 100 x g por 3 min em uma centrífuga de cultura celular dedicada(Figuras 1G-H).
5. Enquanto as células estão sendo giradas para baixo, aliquot 50 μl de matriz em um tubo de microcentrifuge de 1 ml (nota: cada prato com fundo de vidro é alocado um tubo de microcentrifuuge; portanto, se o experimento requer 3 pratos, então segue-se que 3 tubos de microcentrifuge são necessários também), e então colocar o tubo no gelo(Figura 1B).
6. Aspire o meio do tubo cônico a partir do passo 1.4, deixando a pelota intacta(Figura 1I). Células resuspendas (que foram giradas) em 1 ml de meio RPMI suplementado por FBS(Figura 1J).
7. Uma vez que as células são contadas usando um hemambitót (Figura 1K), ou uma alíquota de contador de partículas celular 2,5 x 104 células no tubo de microcentrifuuagem e topá-lo usando mídia apropriada de modo a obter volume total de 50 μl(Figura 1L).
8. Misture as células da etapa 1.7 (25.000 células em 50 μl) com o tubo de microcentrifuge contendo matriz a partir da etapa 1.5 em uma razão de 1:1; o volume final será de 100 μl(Figura 1M).
9. Placa suave 100 μl da matriz:mistura celular do passo 1.8 para o prato solidificado de membrana de porão revestido de matriz da etapa 1.2(Figura 1N). Isso permite que as células sejam incorporadas na matriz de membrana do porão.
10. Transfira o prato(es) para a incubadora de cultura celular (a 37 °C com 5% de CO2) e permita que a mistura matriz:célula se solidifique por pelo menos 30 minutos.
11. Uma vez que a mistura matriz:célula seja solidificada, adicione 2 ml de mídia RPMI suplementada por FBS ao prato (Figura 1O) e leve o prato de volta à incubadora onde será armazenado para o restante do experimento(Figura 1P).
12. Alterar a mídia todos os dias por um período de 5 dias (ou conforme necessário para um ensaio; a duração do ensaio para células MDA-MB-231 é de 5 dias de duração).
13. Utilizando um microscópio leve, pegue imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) das colônias MDA-MB-231 suspensas na matriz de membrana do porão(Figura 2A). Imagem 20 áreas representativas em 10X objetivo uma vez por dia durante cinco dias para determinar morfogênese colônia(Figura 2C).
14. Analise as imagens cegamente para determinar a formação estelar da colônia celular(Figura 2B). Uma colônia é considerada estelar se uma ou mais projeções do esferoide das células forem percebidas. Para determinar a porcentagem de colônias estelares invasivas, divida o número de colônias estelares pelo número total de colônias celulares por imagem adquirida, e, em seguida, média das porcentagens das colônias estelares das 20 imagens para cada dia.

Representative Results

Figura 1. Cultura tridimensional de células cancerígenas de mama MDA-MB-231 na matriz de membrana do porão (a técnica de incorporação). A-B) Um esquema da configuração experimental (realizado no capô da fumaça). C) O poço do prato com fundo de vidro revestido com 50 μl de matriz de membrana de porão. D) Prato(es) colocado em uma incubadora de cultura celular (a 37 °C com 5% de CO2) para permitir que a matriz se solidificar por pelo menos 30 min. E) As células foram experimentadas. F) As células foram resuspendidas em um tubo cônico de 15 ml. G-H) As células (presentes em tubo cônico) foram giradas a 100 x g por 3 min em uma centrífuga de cultura tecidual. I) Pelota de célula. J) As células (que foram giradas para baixo) foram resuspended em 1 ml de meio RPMI suplementado pelo FBS. K) As células foram contadas usando um hemótmetro. L) 2,5 x 104 células alicotadas no tubo de microcentrifuuge e tampadas usando mídia apropriada para obter volume total de 50 μl. M) Misture as células da etapa 1.7 (25.000 células em 50 μl) com o tubo de microcentrifuge contendo matriz a partir da etapa 1.5 em uma razão de 1:1; o volume final será de 100 μl. N) Placa suave 100 μl da matriz: mistura celular do passo 8 para o prato solidificado revestido de matriz a partir do passo 1.2. O) Uma vez que a mistura matrix:cell seja solidificada, adicione 2 ml de mídia RPMI suplementada por FBS ao prato. P) Coloque o prato na incubadora onde será armazenado durante o restante do experimento.

Figura 2. Aquisição de imagens e ilustração de imagens representativas. A) Imagens tiradas com um microscópio. B) Microscópio de imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) usado para adquirir imagens e, posteriormente, imagens analisadas por meio de software de análise de imagem. C) São mostradas imagens dic representativas da amostra das células MDA-MB-231 (tiradas uma vez por dia durante cinco dias). Anova unidirecional seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett: *, P < 0,05. Barra de escala, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)