Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay ist ein in vitro Assay, bei dem hämatopoetischen Vorläuferzellen bilden Kolonien in einem halbfesten Medium. Eine Kombination aus Koloniemorphologie, Zellmorphologie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung entlang der verschiedenen hämatopoetischen Linien zu beurteilen.
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Methodenartikel
Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen sind in der Regel aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder dem peripheren Blut gewonnen und genutzt werden, um die Blutbildung und Leukämogenese studieren. Sie haben die Fähigkeit, sich in lymphoiden und myeloischen Linien zu differenzieren. Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay wird verwendet, um die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster durch ihre Fähigkeit, Kolonien in einem halbfesten Medium Form zu studieren. Die Anzahl und die Morphologie der Kolonien, die durch eine feste Anzahl von Input-Zellen gebildet vorläufige Angaben über die Fähigkeit der Vorläuferzellen zu differenzieren und zu vermehren. Die Zellen können aus einzelnen Kolonien oder die ganze Platte geerntet werden, um weiter zu prüfen ihre Zahl und Differenzierung Staaten mittels Durchflusszytometrie und morphologische Beurteilung der Giemsa-gefärbten Objektträgern. Dieser Test ist nützlich für die Beurteilung der myeloischen aber nicht lymphoide Differenzierung. Der Begriff myeloischer in diesem Zusammenhang ist im weiteren Sinne verwendet, um granulozytäre, Monozyten, erythroiden und Megakaryozyten Linien umfassen.
Wir haben diesen Test verwendet werden, um die Auswirkungen der Onkogene auf die Differenzierung von primären humanen CD34 +-Zellen aus dem peripheren Blut gewonnen zu beurteilen. Zu diesem Zweck Zellen sind entweder mit Kontrolle retroviralen Konstrukt oder ein Konstrukt Expression des Onkogens von Interesse transduziert, in diesem Fall NUP98-HOXA9. Wir beschäftigen eine häufig verwendete retrovirale Vektor, MSCV-IRES-GFP, dass eine bicistronische mRNA, die das Gen von Interesse und ein GFP-Marker produziert ausdrückt. Die Zellen werden durch die in Gegenwart von Zytokinen für zwei Tage vor der retroviralen Transduktion voraktiviert. Nach zwei weiteren Tagen werden GFP +-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert und mit einer Methylcellulose-haltigen halbfesten Medium mit Zytokinen ergänzt und inkubiert, bis Kolonien auf der Oberfläche, in der Regel 14 Tage angezeigt werden. Die Anzahl und Morphologie der Kolonien sind dokumentiert. Die Zellen werden dann von den Platten entfernt, gewaschen, gezählt und einer Durchflusszytometrie und morphologische Untersuchung. Durchflusszytometrie mit spezifischen Antikörpern an die Zelloberfläche Marker während der Hämatopoese ausgedrückt gibt Auskunft über Herkunft und Reifung der Bühne. Morphologische Untersuchungen von einzelnen Zellen unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa-Färbung liefern weitere Informationen in Bezug auf Herkunft und Reifung. Vergleich von Zellen transduziert mit Kontrolle leeren Vektor zu den transduzierten mit einem Onkogen zeigt die Auswirkungen des Onkogens auf hämatopoetischen Differenzierung.
Protokoll
1. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
- Bereiten Sie sterile 1000x Stammlösungen von FMS-bezogene Tyrosinkinase 3 (FLT-3)-Liganden, Granulozyten / Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), stem cell factor (SCF), Thrombopoietin (TPO), Interleukin (IL) -3 und IL-6 nach den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie sterile Retronectin Stammlösung (1mg/ml) auch nach den Anweisungen des Herstellers. Teilen Sie diesen Stammlösungen in kleinen Portionen und halten bei -20 ° C bis wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.
- Bereiten Sie 2% FBS in IMDM.
- Bereiten Sie komplette IMDM-Medium mit einer Endkonzentration von 20% FBS, 2 mM Glut....
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Diskussion
Der CFC-Assay wurde intensiv auf die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster zu ermitteln und die Auswirkungen der Onkogene (4, 5) Studie verwendet. Es hat den Vorteil gegenüber flüssigen Kulturen zu einer klonalen Assay, so dass die Kolonien die Nachkommen eines einzigen Stammvater vertreten und können individuell für die weitere Analyse entfernt werden. Die Begrenzung der FCKW-Test ist, dass es nicht für den Nachweis von mehr unreife Vorläuferzellen oder hämatopoetische Stammzelle.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken der Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine and Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, für den Einsatz der High Speed Cell Sorter Core, die Durchflusszytometrie Geräte und Sortieren Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants R01 HL082549 und K02 HL084179 (NRY) unterstützt. Die Siteman Cancer Center ist zum Teil durch eine NCI Cancer Center Support Grant P30 CA91842 unterstützt.....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3-Ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypanblau-Lösung (0,4 %) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Menschliche Methylcelluloseangereicherte Medien | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright-/Giemsa-Färbung | Harleco | 64571 | |
| Phosphatpufferlösung, pH 6,4 – Giordano-Formel | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normales Mausserum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-Human CD11b Phy–coerythrin-konjugiert | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-Human CD33 Allophycocyanin-konjugiert | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Human CD45 Phy–coerythrin-Cy7-konjugiert | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-Human CD71 Phy–coerythrin-konjugiert | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-Human CD235a Allophycocyanin-konjugiert | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Human CD45 Phy–coerythrin-Cy7-konjugiert | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-Loch-Zellkulturplatten, nicht beschichtet | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30-mm-Schale, nicht beschichtet | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100-mm-Zellkulturschale | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Rasterierte Auswerteschalen | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15-ml-Zentrifugenröhrchen | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50-ml-Zentrifugenröhrchen | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Spritzen, 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16-Gauge stumpfe Kanüle, 1½ Zoll | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics Zellfilter | Partec | 04-004-2327 | |
| Neubauer-Zählkammer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX-Probenkammern | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus-Mikroskopobjektträger, vorgereinigt | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon-Filterkarten | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon-Zytospin-Objektträgerhalter | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm Filterpapier | VWR international | 28307-134 | |
| Invertiertes Mikroskop | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Mikroskopkamera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Mikroskop | Olympus Corporation | BX51 | |
| Mikroskopkamera | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vortex-Mischer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Zellkultur-Inkubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Tischzentrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
| Wasseraufreinigungssystem | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Referenzen
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
