In vivo ¹⁹ F MRI para Rastreamento celular

Summary

Nós descrevemos um protocolo geral para no rastreamento de células in vivo utilizando ressonância magnética em um modelo de rato com ex vivo células marcadas. Um protocolo típico para a marcação de células, o processamento de aquisição de imagem e a quantificação é incluído.

Abstract

In vivo ¹⁹ F MRI permite o acompanhamento quantitativo de células sem o uso de radiação ionizante. É uma técnica não-invasiva, que pode ser aplicado aos seres humanos. Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para marcação celular, imagem e processamento de imagem. A técnica é aplicável a vários tipos de células e modelos animais, embora aqui nos concentramos em um modelo típico do mouse para rastrear células do sistema imunológico murino. As questões mais importantes para a rotulagem de células são descritos, uma vez que estes são relevantes para todos os modelos. Do mesmo modo, os principais parâmetros de imagem são listados, embora os pormenores irão variar dependendo do sistema de ressonância magnética e a configuração do indivíduo. Finalmente, incluímos um protocolo de processamento de imagem para quantificação. Variações para esta e outras partes do protocolo, são avaliados na seção Discussão. Com base no procedimento detalhado descrito aqui, o usuário terá de adaptar o protocolo para cada tipo específico de célula, etiqueta de pilha, modelo animal, e configuração de imagem. Note-se que o protocolo também pode ser adaptado para uso humano, desde que sejam satisfeitas as restrições clínicos.

Introduction

Em rastreamento celular vivo é essencial para a otimização e monitoramento de terapias celulares ^1. Devido à sua natureza não-invasiva, a imagem oferece excelentes oportunidades para monitorar as células in vivo. Imagem por Ressonância Magnética (MRI) é independente da radiação ionizante e permite uma resolução de imagem superior e contraste intrínseco dos tecidos moles. Rastreamento de células baseado em MRI já foi utilizada clinicamente para seguir as células dendríticas em pacientes com melanoma, ^2. IRM clínica convencional é realizada sobre o núcleo ¹ H, presentes na água celular em tecidos. Também é possível realizar a RM em outros núcleos activos, tais como ¹³ C, ¹⁹ F e ²³ de Na. No entanto, apenas ¹⁹ F RM tem sido aplicado com sucesso no rastreamento de células in vivo, uma vez que oferece a mais alta sensibilidade após ¹ H. A ausência de MRI-detectável endógena ¹⁹ M nos tecidos permite alta seletividade sinal para odetecção de agentes de contraste exógenos, ¹⁹ F e permite a quantificação da concentração de flúor directamente a partir dos dados de imagem. Para uma discussão detalhada em ^{19 de} F MRI, consulte ^3-5. Uma questão fundamental com ¹⁹ M MRI é a necessidade de desenvolver e otimizar os rótulos de células ¹⁹ f adequado, apesar de vários rótulos foram desenvolvidos, com uma tendência para os agentes multimodais ^6.

O protocolo aqui descrito é baseado em estudos realizados por nossos grupos de ^7-9, incluindo os primeiros artigos que descreviam in vivo quantitativa ¹⁹ célula baseada em ressonância magnética F rastreamento ^10,11. O procedimento geral de rastreamento de células utilizando ^19F MRI está sumariado na Figura 1. Nós descrevemos um protocolo geral para a rotulagem e de imagem de células dendríticas (DCs), utilizando um agente de contraste perfluorocarbono custom-made ^8. O protocolo de imagem é geralmente aplicável a diferentes tipos de células, as etiquetas e os modelos animais. Otipo de célula animal e modelo descrito aqui só deve ser tomada como um exemplo, e, portanto, nós não fornecemos detalhes sobre o isolamento de células e rotulagem, mas sim concentrar-se no protocolo de imagem. Modificações serão necessárias para cada rótulo, tipo de célula, o modelo animal, e configuração de imagem, e estes podem ser encontrados na literatura ou podem precisar de ser otimizada pelos pesquisadores. Algumas modificações comuns estão incluídas na discussão.

Protocol

Nota: Todos os experimentos e procedimentos que envolvem animais devem ser realizados de acordo com as diretrizes éticas relevantes e em conformidade com a norma cuidados com os animais e as exigências humanas.

1. Rotulagem celular (protocolo padrão com coincubação)

1. Adicionar ¹⁹ F etiqueta ⁸ a DC imaturas a uma concentração de 4 mg/10 ⁶ células (em 2 ml de meio). Agitar suavemente para misturar.
2. Incubar as células com a etiqueta, durante 3 dias antes da maturação e colheita das DCs.
3. Recolha os DCs e remover o excesso de etiqueta por lavagem pelo menos 3x em PBS. Contar as células.
4. Ressuspender em um pequeno volume de PBS para injecção ou mais testes.

Nota: Este protocolo é relevante para esses DCs e etiqueta específicas. O procedimento foi otimizado em outra publicação ⁸ e incluídos aqui são apenas os passos para preparar uma amostra de imagem, uma vez que o foco deste protocolo está na imagem. Hcia, o protocolo para o isolamento, cultura e rotulagem de um tipo específico de célula nem precisa ser encontrados na literatura ou otimizado pelo pesquisador. Um resumo de todos os outros ¹⁹ F rótulos que têm sido utilizados na literatura está apresentada noutros ^6.

2. Determinação de ¹⁹ F / celular Usando RMN ^19F

1. Colocar um número conhecido de células marcadas (tipicamente mais do que 0,5 x 10 ^6, ou um número que resulta em suficiente do sinal) num tubo de NMR.
2. Adicionar 10 ul de 5% de ácido trifluoroacético (TFA). Se a frequência de ressonância de ATF não é adequado devido à sobreposição com o rótulo, utilizar um composto solúvel em alternativa, de preferência, com uma única ¹⁹ F de ressonância.
3. Coloque a amostra em um espectrômetro de RMN e obter o espectro de ¹⁹ M. Certifique-se de que a largura de banda é suficiente tanto para o TFA (de referência) e o agente.

Nota: A TR deve ser longa o suficiente para full relaxamento da referência ea amostra gira (cerca de 5 vezes o tempo T ₁ relaxamento do maior componente T ₁ no tubo, normalmente TR ~ 5-8 segundos). Alguns espectrômetros exigem D ₂ O para um sinal de bloqueio de freqüência. Um espectro de ^19F padrão é suficiente. Números de média ou superior celulares Extensas será necessário se a captação celular da etiqueta é pobre ou se o número de células são baixos. O espectro deve ser centrada entre a referência e picos de etiquetas relevantes, a não ser que as correções são feitas para dar conta de excitação parcial.

4. Calcular as áreas relativas sob os picos de referência e da amostra (ou o pico principal da amostra), e, em seguida, calcular o número médio de ¹⁹ de F / células na amostra.

Nota: Todo o processo deve ser repetido e média extensivamente o suficiente para alcançar significância estatística. Isto também pode ser feito usando espectroscopia directamente no aparelho de ressonância magnética. However, notar que este procedimento revela apenas a média de ¹⁹ F carregamento para um grande número de células, não a variabilidade entre as células. Verificando a uniformidade de captação celular requer a presença de um componente fluorescente com o F agente ^19, de modo que a captação celular pode ser analisada por microscopia ou por citometria de fluxo.

3. Considerações sobre o Projeto Experimental - Injeção celular

Devido ao sucesso é necessário para a relativamente baixa sensibilidade de ¹⁹ F MRI para o rastreamento de pilha, um modelo animal onde as células vão localizar em grandes números na imagem in vivo. Os valores de sensibilidade típicas variam de 1,000-100,000 cells/voxel/1 horas de tempo de verificação ^6, com uma carga de células na gama de 10 ¹¹ -10 ¹³ átomos de flúor.

O número ea frequência das sessões de imagem deve ser cuidadosamente planejado, pois isso influencia a escolha do anestésico. Note-se que pode não ser isoflurano suitable para ¹⁹ F MRI se a freqüência de ressonância de ¹⁹ F isoflurano é próximo ao do composto rótulo usado. isoflurano pode ainda ser adequado se as sessões de imagem são curtos o suficiente para evitar acumulação significativa. Vários anestésicos alternativas têm sido utilizados na literatura ^10,11; exemplo é incluído no protocolo de geração de imagens. Os anestésicos podem precisar de ser optimizada para diferentes estirpes de ratinho e os modelos de doença.

4. Projeto de um ¹⁹ M Referência Externa

1. Use uma referência externa contendo uma quantidade conhecida de ¹⁹ sinal de F para a quantificação ^12. Escolha a intensidade do sinal da referência a ser mais ou menos comparável à espera do assunto.

Nota: Em geral, é mais simples, se o composto de referência é a mesma que a placa de célula, para coincidir com os parâmetros de relaxamento. Se forem utilizadas as sequências de espectroscopia ou seqüências sem localização espacial, então acompound com um desvio químico diferente pode ser necessário.

2. Modificar o posicionamento, o tamanho e forma da referência, se necessário, dependendo da região de interesse (ROI). Nota: É geralmente mais fácil de utilizar tubos com uma secção transversal uniforme para a referência.

5. Imagem e Rato Preparação

1. Dilui-se disponível comercialmente de cetamina e xilazina 01:10 v / v, com uma solução salina fisiológica para produzir soluções de reserva de 10 mg de cetamina / ml e 2 mg / ml de xilazina.
2. Ligue o sistema de aquecimento no scanner (ar tipicamente quente) para garantir o furo vai ser quente antes de o rato é trabalhada.
3. Injectar 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina intraperitoneal para iniciar a anestesia. Nota: Estas doses foram testadas por CD1 (ICR) e NU-Foxn1 ^nu 8 semanas de idade os ratos do sexo masculino. Outras cepas podem precisar de um pouco diferentes doses, que devem ser otimizadas em um experimento separado. Esta dose vai manter o rato anestesiado para umataque 45 min. Nota: A profundidade da anestesia é normalmente suficiente, se o animal não apresenta reacção com uma pitada do pé.
4. Uma vez anestesiados, coloque o animal em um berço animal e imobilizar para impedir o movimento durante a ressonância magnética. Se necessário, posicionar a referência externa ao lado do animal. Tanto a referência e a ROI (localização das células injectadas esperado) deve estar no centro da bobina. O animal deve ser conectado ao controle de temperatura e respiração para monitorização fisiológica durante a digitalização.
5. Cubra os olhos do rato com pomada estéril para evitar que sequem durante longas sessões de imagem.
6. Se o tempo de imagem superior a 40 min, preparar cateteres adicionais para injeção de cetamina / xilazina adicional antes de o animal pode acordar. Posição dois cateteres subcutâneos separados com as soluções de trabalho de cetamina e xilazina. Utilizar este catéter para dar o mouse de um adicional de 2,5 mg de cetamina a cada 20 minutos após os primeiros 40 min. Se necessário, prolongar ainda mais a anestesia por injecção de 0,5 mg de xilazina adicional através do cateter, 100 min após a injecção inicial. Em todos os casos, o tempo experimental, não deve ser superior a 3 horas, excepto, possivelmente, sob anestesia terminal.
7. Certifique-se de que o rato é aquecida directamente após a primeira injecção e mantida a 37 ° C a temperatura do corpo. Com este protocolo, <80% a oxigenação do sangue foi detectado em atmosfera de respiração do ar. Para evitar os efeitos secundários da oxigenação do sangue reduzido, com 100% de oxigénio (0,3 L / min). A temperatura do corpo ea respiração deve ser controlada durante todo o experimento e até a recuperação completa do animal. Note-se que a taxa de respiração espontânea com cetamina / xilazina é muito elevado (200-250/min). As irregularidades no padrão respiratório, em vez da taxa de respiração, pode indicar que uma dose mais elevada é necessária para manter um estado adequado de anestesia. O rato vai despertar espontaneamente dentro de 20-30 min after a última dose do anestésico.

Nota: Para rastreamento de células, é necessário para a imagem do mesmo animal mais de uma vez. Nesse caso, as sessões de imagem deve ser agendada com consideração ao tempo necessário para a liberação de anestesia das diretrizes de uso do sistema e animais do instituto.

6. Imagem

¹ ajustes H e de imagem

1. Posicione o animal dentro do scanner para que o ROI é no isocentro usando uma baixa resolução, varredura anatômica com diferentes orientações fatia (um localizador).
2. Utilizar o protocolo de calços regular sobre ^um H, por exemplo, um calço global sobre todo o volume no interior da bobina.
3. Ajuste o ganho de pulso de referência (RG), ou seja, a potência do transmissor medido em dB por 1 ms Hermite 90 ° pulso RF, usando a digitalização de ajuste fornecido pelo fornecedor.

Nota: Este ajustevariam com o tipo de bobina de RF e é essencial para o ^19F MRI uma vez que o sinal na frequência F ¹⁹ é geralmente demasiado baixo para ajustamentos directos. Como conseqüência, uma estimativa do RG deve ser feita a partir de medições no sinal ^1H. Para a transmissão de RF com uma bobina de superfície, o RG ^1H deve ser ajustado para um plano paralelo ao da bobina através da parte de interesse, para uma bobina de volume com _um perfil B homogéneo, as definições exactas do ajuste são menos importantes.

4. A seguir o protocolo de ¹⁹ de referência de ajuste de ganho de pulso F só funciona se ambos ¹ H e ¹⁹ F transmissão RF é realizada com a mesma bobina de RF (single ou duplo sintonizado). Para uma tal estrutura de imagem, o perfil da bobina (B _um campo de transmissão) em ¹ H deve ser proporcional ao perfil da bobina ¹⁹ F, quando um RG fixo é aplicado, ou seja, _1,1 B ₌ C * B _{1,19 F} com uma proportionality constante C.
   1. Para confirmar que os perfis de bobina são proporcionais para uma configuração específica, adquirir um ¹ H e F aleta mapa ¹⁹ ângulo (ver secção seguinte em B ₁ correção) em um tubo com alta concentração ¹⁹ M, por exemplo TFA em água (1:1 v / v) usando idênticos campos de visão, como (FOVs), antes (Figura 3).
   2. Usando o mesmo RG, verifique se ambos os mapas são idênticos, exceto para o fator C. mundial
   3. Uma vez que o ¹ H RG é determinado, anote este número para baixo.
5. Realizar um convencional ^1H ressonância magnética como uma referência anatômica para a imagem ¹⁹ M. Sintonize o sistema para o ¹⁹ F freqüência do marcador de células e levar a cabo um ¹⁹ F MR digitalizar. O ideal é a digitalização ¹⁹ F MRI terá o mesmo campo de visão e seleção fatia como o ^1H ressonância magnética, embora geralmente com menor resolução. O animal pode ser revivido tão logo a imaginaçãong é completa. O processamento de imagem pode então ser levada a cabo fora de linha.
6. Determine o ¹⁹ F RG via a relação dB _19F = dB _1H -20 * log ₁₀ (C). Estimar a freqüência agente ¹⁹ F em uma experiência separada in vitro.

Nota: In vivo, a freqüência exata pode variar um pouco de experiência para experiência devido a diferentes condições shimming. Para evitar artefatos de deslocamento químico a freqüência exata deve ser determinado em cada experimento por ¹⁹ M MRS, se possível. Uma varredura típica de sinal muito baixo ¹⁹ F seria global (pulse-aquisição), espectroscopia (TR = 200 ms, NEX = 3.000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX, assim TA, pode ser reduzido drasticamente para sinal de alta F ^19. A frequência de agente ^19, F é determinado a partir do espectro depois da transformação de Fourier e correcção de fase. NEX refere-se ao número de excitações, TA é o tempo de aquisição e BW é ode largura de banda.

Nota: Os parâmetros de imagem típicos ⁹ em um scanner de animais dedicado 11.7T/16 cm são: Uma varredura anatômica ^1H imagem usando um turbo spin echo (TSE) seqüência com TR / tempo de eco efetiva (TE _ef) = 2.200 ms msec/42.8, 8 ecos por excitação, NEX = 2, 10, 1 mm de espessura consecutivos, FOV = 1,92 x 1,92 centímetros ^2, 128 de matriz de 128 x, ou seja, uma resolução de 150 x 150 x 1000 mM ^3, TA = 1 min, PN = 50 kHz e um esquema de codificação de fase linear. ¹⁹ F imagens foram obtidas com a mesma sequência e geometria combinando, mas com menor resolução no plano e menor PN (NEX = 256, 48 x 48 matriz, ou seja, uma resolução de 400 x 400 x 1000 mM ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B correção ₁
   Usando uma bobina de RF com inhomogeneous B ₁ de perfil, por exemplo, uma bobina de superfície, pode dificultar a quantificação de dados ¹⁹ F já que o sinal dependeNão só em ^{19 de} concentração de F, mas também em função da distância a partir da bobina. Adquirir um mapa B ₁ no canal ¹ h para ¹⁹ retrospectivamente dados corretos F. Isto requer que ^um H e ¹⁹ perfis de bobina F são idênticos, excepto para o factor de proporcionalidade C, e que o sinal de fundo suficiente ^1H é fornecido em regiões de ¹⁹ F. Um protocolo de exemplo para a correção de uma sequência de eco ¹⁹ M rotação é apresentada, usando um único sintonizado Tx / Rx bobina de superfície ajustável para ambos ¹ H e ¹⁹ F e com proporcional B ₁ perfis ^13.
   1. Adquirir um mapa ângulo de inclinação ¹ H com o método de duas ângulo de inclinação ^14. Adquirir um gradiente eco varredura com muito TR (> 3 vezes ¹ HT ₁₎ com um ângulo de inclinação estimada de pouco menos de 90 °. Feche para a bobina. Adquirir uma segunda varredura gradiente eco com um RG = dB _1H -6, ou seja, duas vezes o flipângulo do primeiro exame.
   2. Calcular o ângulo de inclinação ¹ H, α, em voxel (x, y, z), através de intensidades de sinal (SI) do primeiro e do segundo gradiente de varreduras de eco: α (x, y, z) = Arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. O ângulo de inclinação ¹⁹ F é idêntico (exceto para o fator 1 / C), devido à proporcional B ₁ perfis. De acordo com o princípio de Faraday da reciprocidade ^15, a atenuação de ¹⁹ F intensidade do sinal a partir de um spin seqüência echo (α ângulo de excitação aleta, reorientação 2α ângulo de inclinação) durante a recepção do sinal é att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). A atenuação devido à excitação imperfeita é att _Tx (x, y, z) ~ ³ sin (α (x, y, z)) ^16. A atenuação total é escrita como att = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Note que é normalizado para 1, no caso de perfeita ângulo de 90 ° / 180 ° excitação / reorientação flip. A B ₁ corrigido19 F imagem intensidades de sinal SI _{19F, corr} são calculados através de SI _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z).
   3. A fim de comparar as intensidades de sinal a partir de experiências diferentes, colocar um tubo de referência com a concentração de F ¹⁹ definido no campo de visão, e normalizar a SI _{19F, corr} a média do sinal de referência.

Nota: Outros ¹ HB métodos ₁ / mapeamento de ângulo de inclinação pode ser usado e diferentes seqüências de pulsos ¹⁹ F exigir modificações de att _{Tx, 19F.} Qualquer tipo de esquema de correção B1 irá introduzir erros adicionais no processo de quantificação celular. Se quantificação celular precisa é a premissa principal, uma bobina de RF com o perfil homogêneo B1 pode ser usado para contornar esta parte do protocolo.

7. Processamento de Imagem

1. Fazendo ¹ H e ¹⁹ imagens de sobreposição F
   1. Exportar os dados da imagempara o ¹ H final e ¹⁹ F imagens magnitude do scanner.
   2. Abra os arquivos em um programa de processamento de imagens, tais como ImageJ (freeware, NIH).
   3. Realizar ajustes de imagem, se necessário (o corte, brilho, contraste), mantendo os ajustes a mesma para todas as imagens. Os ¹⁹ F imagens normalmente precisam ser aprimoradas para uma resolução mais alta para combinar com as imagens ¹ H correspondentes.
   4. Renderização os ¹⁹ F imagens em cor falsa (selecione uma tabela look-up diferente, no menu "imagem" em Imagem J) e, em seguida, sobrepor as imagens ¹ H correspondentes, a fim de localizar o sinal.
2. ¹⁹ F Quantificação
   1. Selecione uma imagem F ¹⁹ (imagem magnitude) com as células relevantes e a referência visível.
   2. Em um programa como o da Imagem J, desenhe ROIs sobre as células relevantes, a referência e uma região fora do sujeito (ruído).
   3. Use o comando Analisare depois medir (ou simplesmente Ctrl + M) para o cálculo da intensidade média de pixels dentro dessas regiões, e sua área. Seja S (células) referem-se à intensidade média de pixels na ROI sobre as células. Multiplique isso pelo volume (= área x espessura de corte) para calcular o sinal total.
   4. Calcular o SNR, por exemplo, utilizando a fórmula SNR = 0,65 x S (células) / σ, onde σ é o desvio padrão de intensidade de pixel em uma ROI fora da amostra que está livre de qualquer artefacto desvio químico (tipicamente no ar fundo) ^17. Se a SNR for inferior a 5, uma correcção para o sinal, devido ao ruído pode ser necessária e pode ser realizada como descrito em outro lugar ^{11 10.}
   5. Caso contrário, o cálculo da quantidade total de ¹⁹ F responsável pelo sinal na ROI sobre a referência através da multiplicação da área de referência na fatia de espessura do corte (para calcular o volume) pela concentração de ¹⁹ M no referência,que é conhecida e considerada homogênea.
   6. Multiplicar esse valor pelo sinal total na ROI sobre as células, dividido pelo sinal total em relação à referência para calcular a quantidade de ¹⁹ M nas células.
   7. Calcular o número de células, dividindo esse número pelo valor de ¹⁹ M / célula, a qual foi calculada na secção 2.

Representative Results

Aqui mostramos os resultados típicos para um protocolo que envolve a transferência de ¹⁹ células marcadas F-homing a um nodo de drenagem linfática. Figura 2 mostra um espectro de RMN ^{de 19F} de 10 ⁶ células marcadas, utilizando uma referência de TFA. A estrutura de imagem foi realizada como descrito no protocolo (Figura 3). Para a imagem in vivo em, utilizou-se uma referência que consiste de um cilindro selado da mesma etiqueta utilizada para as células colocadas entre os pés do rato. Uma imagem processada representativo é mostrado na Figura 4. Ao aplicar o protocolo descrito na seção 7.2, foi calculado um número de celular de aprox. 1,2 x 10 ⁶ com base na imagem magnitude ¹⁹ F-prima em.

Figura 1. As principais etapas para rastreamento de células baseado em MRI ¹⁹ F. in vivo. Figura reproduzida com autorização ^6. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Representante ¹⁹ espectro F RMN. Espectro A mostra o sinal de ^19F obtidodevido à quantidade conhecida de referência, neste caso, de TFA, e o número conhecido de células, rotulado como "amostra". Isto pode ser utilizado para calcular a quantidade de flúor por célula, o que é necessário para a quantificação in vivo a partir de dados de imagem MR.

Figura 3. Mapas ângulo de inclinação de tubos com TFA em água foram adquiridos no ¹ H e ¹⁹ F canal. O factor de proporcionalidade foi calculada em 1,03 ± 0,08 para esta configuração. FA: virar ângulo.

Figura 4. In vivo ¹ H / ¹⁹ F imagem de células dendríticas teleguiados para um linfonodo de drenagem. A figura mostra uma imagem representativa de um rato, com ¹⁹ F sinal visível,em cores falsas, na referência (R) e as células marcadas. Apenas as pernas do rato foram fotografadas aqui. Neste exemplo, as células marcadas injectados migrado para o nodo de drenagem linfática. Os parâmetros de imagem são resumidos no texto principal. A figura é apenas para fins ilustrativos.

Discussion

O protocolo descrito aqui descreve o procedimento geral para a in vivo ¹⁹ de rastreamento de células F ressonância magnética. Apesar do método de co-incubação descritas, existem vários protocolos diferentes para a marcação das células com um agente de F ^19. No entanto, a co-incubação é mais frequentemente utilizado e pode ser optimizado adicional, por exemplo, por adição de agentes de transfecção ^6. O protocolo de marcação celular real dependerá do tipo de célula. Apenas os passos chave de etiquetagem são descritos no protocolo aqui. Geralmente, a etiqueta é preparada e adicionada às células durante um tempo seleccionado variando de algumas horas a alguns dias. Finalmente, as células têm de ser cuidadosamente lavadas para remover qualquer excesso de etiqueta, especialmente se a quantificação dos dados de imagem será efectuada ^3. Se o agente de F ¹⁹ inclui uma etiqueta fluorescente, a presença da etiqueta no exterior (ou não ligado a) as células podem ser detectadas usando microscopia. Após a marcação, é necessário estudar o celulara viabilidade e a funcionalidade, em relação às células não marcado (por exemplo, por ensaio de exclusão de azul de tripano). Testes de funcionalidade específica de células, tais como a capacidade de activar células T, no caso de DCs, também deve ser levada a cabo. Finalmente, como alguns ^não-19 etiquetas F de ressonância magnética tem um efeito sobre a migração das células ^18, tais testes devem ser também incluídos para ¹⁹ F etiquetas, especialmente com carga elevada de células.

O protocolo para o modelo animal também é dependente das necessidades do usuário. No entanto, é importante lembrar-se dos limites de sensibilidade estritas de ¹⁹ F MRI ao planejar experimentos. Os valores de sensibilidade publicadas variam entre 1,000-00,000 cells/voxel/1 tempo hr ^6, com uma carga de células na gama de 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. Sensibilidade e concentração rótulo esperado na região de juros também afetam os parâmetros de imagem. Por exemplo, a espessura da fatia de imagem usado para o ¹⁹ F pode ser adj usted para coincidir com as imagens de ^um H ou para cobrir uma área muito mais espessa (tal como todo o linfonodo ou região de interesse em uma única fatia). Tipicamente, a ¹⁹ M de imagem é realizada com baixa resolução, para maximizar a detecção de sinal, especialmente desde alta resolução não é normalmente necessário para distinguir as estruturas, tais como os nódulos linfáticos. Se o sinal for suficiente, um maior número de cortes mais finos podem ser adquiridos e o sinal total sobre o volume de interesse calculados a partir destes. No entanto, os parâmetros ideais terá de ser determinado para cada aplicação individual.

Nós descrevemos um protocolo de anestesia injeção com cetamina / xilazina evitando gases fluorados de inalação, como o isoflurano. Outros protocolos têm sido utilizados na literatura ^10,11. No entanto, em todos os casos, esses protocolos precisarão ser ajustados para a tensão do mouse, idade, sexo, saúde e o comprimento ea frequência das sessões de imagem.

ONTEÚDO "> Vários ¹⁹ seqüências de imagens de ressonância magnética F têm sido usados ​​para o rastreamento de pilha, para uma revisão ver ^6. Nosso protocolo de imagem pode ser facilmente modificado para incluir outras seqüências de imagem. No entanto, o método de quantificação descrita aqui não leva em conta qualquer volume parcial efeitos, discrepâncias na seleção de ROIs, alterações nos parâmetros de relaxamento da etiqueta in vivo, ou mudanças de celular ¹⁹ F carregamento. Estes problemas são descritos em outro lugar ^3. Em suma, o erro foi encontrado para estar dentro dos limites toleráveis ​​para rastreamento de células longitudinal ^10. Comparado a esses trabalhos anteriores que, adicionalmente, propor um esquema de correção de imagem para o uso de bobinas de RF de superfície, mapeando o campo B1. Dependendo da configuração específica da bobina RF é importante estar ciente das limitações das técnicas de mapeamento B1, que têm sido bem estudado no contexto de ¹ H RM ^16. Por exemplo, para o método do ângulo duplo apresentado aqui a B1mapa é mais preciso para pares Flip angle só abaixo de 90 ° -180 ° ¹⁴ e erro significativo pode ser introduzido em outras regiões. Ainda assim, após a validação adequada in vitro, tal correção retrospectiva pode melhorar ainda mais a quantificação celular. Em geral, recomendamos corroboração dos dados com as técnicas mais tradicionais, pelo menos inicialmente. Isso geralmente é feito em combinação com outras técnicas de imagem in vivo, por exemplo, imagens ópticas, para ajudar a excluir grandes erros. Na maioria dos casos, a avaliação histológica é necessário avaliar ^19F local etiqueta e precisamente para permitir correlação com os dados de imagem. Isto pode requerer a adição de um corante fluorescente com o agente de F ^19.

Finalmente, embora ^19F MRI não tenha ainda sido aplicada ao sistema de localização de células clínico, seria possível modificar este protocolo para a utilização humana. As principais modificações necessárias seria para realizar o máximo de optimção e configuração de antemão quanto possível (para minimizar o tempo em que o sujeito está no scanner), e para ajustar os parâmetros de imagem para manter dentro clínica taxa de absorção específica (SAR) restrições.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec