In vivo MRI ^{de 19F} para el seguimiento de la célula

Summary

Se describe un protocolo general para el seguimiento de las células in vivo mediante resonancia magnética en un modelo de ratón con ex vivo las células marcadas. Un protocolo típico para el etiquetado de células, el procesamiento de adquisición de imágenes y la cuantificación se incluye.

Abstract

In vivo ¹⁹ F MRI permite el seguimiento cuantitativo de células sin el uso de la radiación ionizante. Es una técnica no invasiva que se puede aplicar a los seres humanos. Aquí se describe un protocolo general para el etiquetado de células, formación de imágenes y procesamiento de imágenes. La técnica es aplicable a diversos tipos de células y modelos animales, aunque en este caso nos centramos en un modelo típico de ratón para el seguimiento de las células inmunes murinos. Los temas más importantes para el etiquetado de las células se describen, ya que son relevantes para todos los modelos. Del mismo modo, los parámetros clave de formación de imágenes se enumeran, aunque los detalles pueden variar dependiendo del sistema de resonancia magnética y la configuración individual. Por último, se incluye un protocolo de tratamiento de la imagen para la cuantificación. Variaciones para esta y otras partes del protocolo, se evalúan en la sección de Discusión. Basándose en el procedimiento detallado se describe aquí, el usuario tendrá que adaptar el protocolo para cada tipo específico de células, etiqueta celular, modelo animal, y la configuración de imágenes. Tenga en cuenta que la pROTOCOLO también se puede adaptar para el uso humano, siempre y cuando se cumplan las restricciones clínicos.

Introduction

En el seguimiento de células in vivo es esencial para la optimización y la supervisión de la terapia celular ^1. Debido a su naturaleza no invasiva, tratamiento de imágenes ofrece excelentes oportunidades de observar las células in vivo. Imagen de Resonancia Magnética (IRM) es independiente de la radiación ionizante y permite una resolución de imagen superior y el contraste intrínseco de tejido blando. Seguimiento de células basada en RM ya se ha utilizado clínicamente para seguir las células dendríticas en pacientes con melanoma ^2. MRI clínica convencional se lleva a cabo en el núcleo ¹ H, presentes en el agua móvil en los tejidos. También es posible llevar a cabo resonancia magnética en otros núcleos activos, tales como ¹³ C, ¹⁹ F y ²³ Na. Sin embargo, sólo ^{el 19} F MRI se ha aplicado con éxito para el seguimiento in vivo de células, ya que ofrece la más alta sensibilidad después del ¹ de H. La ausencia de la RM-detectable endógena ¹⁹ F en los tejidos permite una alta selectividad de la señal para lala detección de agentes de contraste exógenos ¹⁹ F y permite la cuantificación de la concentración de flúor directamente de los datos de imagen. Para una discusión detallada sobre ^19F MRI, consulte ^3-5. Una cuestión clave con ¹⁹ F RM es la necesidad de desarrollar y optimizar los marcadores adecuados de células ¹⁹ F, aunque se han desarrollado varias etiquetas, con una tendencia hacia los agentes multimodales ^6.

El protocolo se describe aquí se basa en los estudios realizados por nuestros grupos de ^7-9, incluyendo los primeros artículos que describían in vivo cuantitativa ¹⁹ celular basada en RM F seguimiento ^10,11. El procedimiento general de seguimiento celular utilizando ¹⁹ F RMN se resume en la Figura 1. Se describe un protocolo general para el etiquetado y la formación de imágenes de células dendríticas (DCs) utilizando un agente de contraste de perfluorocarbono a medida ^8. El protocolo de formación de imágenes es generalmente aplicable a diferentes tipos de células, las etiquetas y los modelos animales. Lamodelo de tipo celular y animal descrito aquí debe tomarse sólo como un ejemplo, y por lo tanto no proporcionan información sobre el aislamiento de células y el etiquetado, sino que más bien se centran en el protocolo de obtención de imágenes. Las modificaciones serán necesarias para cada etiqueta, tipo de célula, modelo animal, y la configuración de la imagen, y estos se pueden encontrar en la literatura o pueden necesitar ser optimizado por los investigadores. Algunas modificaciones comunes se incluyen en la discusión.

Protocol

Nota: Todos los experimentos y procedimientos con animales deben llevarse a cabo de conformidad con las normas éticas pertinentes y se ajustan con el cuidado animal estándar y los requisitos humanos.

1. Etiquetado celular (Protocolo Estándar con coincubación)

1. Añadir ¹⁹ F etiqueta ⁸ a países en desarrollo inmaduro a una concentración de 4 mg/10 ⁶ células (en el medio 2 ml). Agitar suavemente para mezclar.
2. Se incuban las células con la etiqueta durante 3 días antes de la maduración y la cosecha de los países en desarrollo.
3. Recoge los centros de datos y eliminar el exceso de etiqueta lavando por lo menos 3 veces en PBS. Contar las células.
4. Resuspender en un pequeño volumen de PBS para inyección o más pruebas.

Nota: este protocolo es relevante para estos países en desarrollo y la etiqueta concretas. El procedimiento fue optimizado en otra publicación ⁸ e incluyó aquí son sólo los pasos para preparar una muestra de imagen, ya que el enfoque de este protocolo es en la obtención de imágenes. Hcia, el protocolo para el aislamiento, la cultura y el etiquetado de un tipo celular específico, ya sea que tenga que ser encontrado en la literatura u optimizado por el investigador. Un resumen de todas las otras ¹⁹ etiquetas F que se han utilizado en la literatura se presenta en otro lugar ^6.

2. Determinación de ¹⁹ F / célula usando ¹⁹ F RMN

1. Coloque un número conocido de células marcadas (típicamente más de 0,5 x 10 ^6, o un número que da como resultado una señal suficientemente) en un tubo de RMN.
2. Añadir 10 l de ácido trifluoroacético 5% (TFA). Si la frecuencia de resonancia de TFA no es adecuado debido al solapamiento con la etiqueta, utilizar un compuesto soluble alternativa, preferiblemente con una sola ¹⁹ F resonancia.
3. Colocar la muestra en un espectrómetro de RMN y obtener el espectro de ^19F. Asegúrese de que el ancho de banda es suficiente tanto para el TFA (referencia) y el agente.

Nota: El TR debe ser lo suficientemente larga para full relajación de la referencia y de la muestra hace girar (alrededor de 5 veces el tiempo T ₁ relajación de la T ₁ componente más largo del tubo, por lo general TR ~ 5.8 seg). Algunos espectrómetros requieren D ₂ O para una señal de bloqueo de frecuencia. Un espectro estándar ^{de 19} F es suficiente. De promedio o mayor número de células extensas serán necesarios si la captación celular de la etiqueta no es buena o si el número de células es baja. El espectro debe estar centrado entre la referencia y picos de etiquetas pertinentes, si no se hacen correcciones para tener en cuenta para la excitación parcial.

4. Calcular las áreas relativas bajo los picos de la referencia y la muestra (o el pico principal de la muestra), y a continuación, calcular el número medio de / célula ¹⁹ de F en la muestra.

Nota: Todo el proceso debe ser repetido y promedió ampliamente suficiente para llegar a la significación estadística. Esto también se puede hacer uso de la espectroscopia directamente en el escáner de resonancia magnética. Hin embargo, tenga en cuenta que este procedimiento sólo revela la media ¹⁹ F de carga para un gran número de células, no la variabilidad entre las células. Comprobación de la uniformidad de la captación celular requiere la presencia de un componente fluorescente en el agente ¹⁹ F, de modo que la captación celular puede ser analizada mediante microscopía o citometría de flujo.

3. Consideraciones para el Diseño Experimental - Inyección de la célula

Debido a es necesario para el éxito de la relativamente pobre sensibilidad de ¹⁹ F RMN para el seguimiento de la célula, un modelo animal donde las células se localizarán en un gran número de imágenes in vivo. Valores de sensibilidad típicas varían de 1.000-100.000 cells/voxel/1 hr tiempo de exploración ^6, con una carga de las células en el rango de 10 ¹¹ -10 ¹³ átomos de flúor.

El número y la frecuencia de las sesiones de formación de imágenes deben ser cuidadosamente planeadas, ya que esto influye en la elección del anestésico. Tenga en cuenta que el isoflurano puede no ser suitablE para ¹⁹ F resonancia magnética si la frecuencia de resonancia F ¹⁹ de isoflurano está cerca de la del compuesto de etiqueta utilizada. isoflurano aún puede ser adecuado si las sesiones de formación de imágenes son lo suficientemente cortos para evitar acumulación significativa. Varios anestésicos alternativos se han utilizado en la literatura ^10,11; se incluye un ejemplo en el protocolo de formación de imágenes. Los anestésicos pueden necesitar ser optimizado para diferentes cepas de ratón y modelos de enfermedad.

4. Diseño de una unidad externa de ¹⁹ F Referencia

1. Utilice una referencia externa que contiene una cantidad conocida de ¹⁹ señal de F para la cuantificación ^12. Elige la intensidad de la señal de la referencia a ser más o menos comparable a la que se espera a partir del sujeto.

Nota: En general, es más simple si el compuesto de referencia es la misma que la etiqueta de células, para que coincida con los parámetros de relajación. Si se utilizan secuencias espectroscópicas o secuencias sin localización espacial, entonces acompound con un desplazamiento químico diferente puede ser necesario.

2. Modificar la colocación, tamaño y forma de la referencia, según sea necesario, dependiendo de la región de interés (ROI). Nota: En general, es más fácil de utilizar tubos con una sección transversal uniforme para la referencia.

5. Imaging y Preparación de Ratón

1. Diluir disponibles comercialmente ketamina y xilazina 1:10 v / v con solución salina fisiológica para producir soluciones madre de 10 mg de ketamina / ml y 2 mg / ml de xilazina.
2. Encienda el sistema de calefacción en el escáner (típicamente aire caliente) para garantizar la perforación se caliente antes se crea una imagen con el ratón.
3. Inyectar 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal para iniciar la anestesia. Nota: Estas dosis se han probado para CD1 (ICR) y NU-Foxn1 ^nu 8 semanas de edad ratones machos. Otras cepas pueden necesitar ligeramente diferentes dosis, que deben ser optimizados en un experimento separado. Esta dosis se mantendrá el ratón anestesiado para unpelea de 45 min. Nota: La profundidad de la anestesia general, es suficiente si el animal no muestra ninguna reacción a una pizca pie.
4. Una vez anestesiados, colocar al animal en una cuna animales e inmovilizar para evitar el movimiento durante la RMN. Si es necesario, la posición de la referencia externa próxima al animal. Tanto la referencia y el retorno de la inversión (ubicación esperada de las células inyectadas) debe estar en el centro de la bobina. El animal debe ser conectado a la temperatura y el control de la respiración para la monitorización fisiológica durante la exploración.
5. Cubra los ojos del ratón con ungüento oftálmico estéril para evitar que se sequen durante las sesiones de formación de imágenes de largo.
6. Si el tiempo de formación de imágenes es superior a 40 minutos, preparar catéteres adicionales para la inyección de ketamina / xilazina adicional antes de que el animal puede despertar. Posicion dos catéteres subcutáneos separadas con las soluciones de trabajo de la ketamina y xilazina. Utilice este catéter para dar el ratón un 2,5 mg adicionales de ketamina cada 20 minutos después de los primeros 40 min. Si es necesario, prolongar aún más la anestesia mediante la inyección de 0,5 mg de xilazina adicional a través del catéter, 100 min después de la inyección inicial. En todos los casos, el tiempo de experimentación no debe exceder de 3 horas, excepto posiblemente bajo anestesia terminales.
7. Asegúrese de que el ratón se calienta directamente después de la primera inyección y se mantuvo a 37 ° C la temperatura del cuerpo. Con este protocolo, <80% la oxigenación de la sangre se detectó bajo respirar aire ambiente. Para evitar los efectos secundarios de la oxigenación de la sangre baja, utilizar el 100% de oxígeno (0,3 l / min). La temperatura del cuerpo y la respiración debe ser controlada a lo largo de todo el experimento y hasta la recuperación total del animal. Tenga en cuenta que la tasa de respiración espontánea bajo la ketamina / xilazina es muy alta (200-250/min). Las irregularidades en el patrón de respiración, en lugar de la tasa de respiración, pueden indicar que una dosis más alta es necesaria para mantener un estado adecuado de la anestesia. El ratón va a despertar espontáneamente en 20-30 min faetR de la última dosis de anestésico.

Nota: Para el seguimiento de la célula, es necesario a la imagen del mismo animal más de una vez. En ese caso, las sesiones de formación de imágenes se deben programar teniendo en cuenta el tiempo necesario para el despacho de la anestesia de las pautas de uso del sistema y de los animales del instituto.

6. Imaging

¹ H y ajustes de imagen

1. Colocar el animal en el interior del escáner de manera que el retorno de la inversión está en el isocentro utilizando una baja resolución, exploración anatómica con diferentes orientaciones rebanada (localizador).
2. Utilice el protocolo calce ordinaria del ¹ H, por ejemplo, una cuña global sobre todo el volumen interior de la bobina.
3. Ajuste la ganancia de impulso de referencia (RG), es decir, la potencia de transmisión se mide en dB durante 1 mseg Hermite 90 ° pulso de RF, utilizando el análisis de ajuste proporcionada por el vendedor.

Nota: Este ajuste sevariar con el tipo de bobina de RF y es esencial para MRI ^{de 19F} ya que la señal en la frecuencia F ¹⁹ es por lo general demasiado baja para ajustes directos. Como consecuencia, una estimación de la RG se debe hacer a partir de mediciones en la señal ¹ H. Para la transmisión de RF con una bobina de superficie, el RG ¹ H se debe ajustar a un plano paralelo a la bobina a través de la parte de interés, para una bobina de volumen con homogéneo B ₁ de perfil, la configuración exacta del ajuste son menos importantes.

4. El siguiente protocolo de ¹⁹ de referencia para el ajuste de ganancia de impulso F sólo funciona si ambos ¹ H y ¹⁹ C de transmisión RF se lleva a cabo con la misma bobina de RF (single o doble sintonizado). Para una configuración de tales imágenes, el perfil de la bobina (B ₁ campo de transmisión) en ¹ H debe ser proporcional a la bobina de perfil ¹⁹ F, cuando se aplica una RG fijo, es decir, B _{1,1 H} = C * B _{1,19 C} con un puntalortionality constante C.
   1. Para confirmar que los perfiles de las bobinas son proporcionales para una configuración específica, adquirir un ¹ H y una F flip mapa ángulo ¹⁹ (véase la siguiente sección sobre B ₁ corrección) en un tubo con alta concentración ¹⁹ M, por ejemplo, TFA en agua (01:01 v / v) usando idénticos campos-de-vista (FOV), de antemano (figura 3).
   2. Usando el mismo RG, comprobar que ambos mapas son idénticos excepto por el factor de C. mundial
   3. Una vez que el ¹ H RG se determina, nota de este número.
5. Llevar a cabo una convencional ¹ H resonancia magnética como referencia anatómica para la proyección de imagen ¹⁹ M. Sintonice el sistema a la ¹⁹ F frecuencia del marcador de células y llevar a cabo una exploración de ¹⁹ F MR. Lo ideal sería que la exploración MRI ^{de 19F} tendrá el mismo campo de visión y la selección de sector como la ¹ H RMN, aunque por lo general con una resolución más baja. El animal puede ser revivido en cuanto la imaginaciónng es completa. El procesamiento de imágenes puede entonces ser llevada a cabo fuera de línea.
6. Determinar el ¹⁹ F RG a través de la relación dB _19F = dB _1H -20 * log ₁₀ (C). Estimar la frecuencia agente ¹⁹ F en un experimento separado in vitro.

Nota: En vivo, la frecuencia exacta puede variar ligeramente de un experimento a otro, debido a las diferentes condiciones de engrosamiento. Para evitar artefactos de desplazamiento químico, por lo tanto la frecuencia exacta debe determinarse en cada experimento por ¹⁹ F MRS, si es posible. Una exploración típica para una señal muy bajo ¹⁹ F sería global (pulso-adquisición) Espectroscopia (TR = 200 ms, NEX = 3000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX, así TA, se puede reducir de manera espectacular para la señal de alta ¹⁹ F. El agente ¹⁹ de frecuencia F se determina a partir del espectro después de la transformación de Fourier y de corrección de fase. NEX se refiere al número de excitaciones, TA es el tiempo de adquisición y BW es elancho de banda.

Nota: Los parámetros de imagen típicos ⁹ sobre un escáner de animales dedicado 11.7T/16 cm son: una exploración anatómica de imágenes ¹ H usando un turbo spin-echo secuencia (TSE) con TR / tiempo de eco efectiva (TE _ef) = 2,200 msec/42.8 ms, 8 ecos por excitación, NEX = 2, 10, 1 mm rodajas gruesas consecutivos, FOV = 1,92 x 1,92 cm ^2, 128 x 128 de la matriz, es decir, una resolución de 150 x 150 x 1.000 m ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz y un esquema de codificación de fase lineal. ¹⁹ F imágenes fueron adquiridas con la misma secuencia y la geometría a juego, pero a menor resolución en el plano inferior y BW (NEX = 256, 48 x 48 matriz, es decir, una resolución de 400 x 400 x 1000 m ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ corrección
   El uso de una bobina de RF con homogéneo B ₁ perfil, por ejemplo, una bobina de superficie, puede dificultar la cuantificación de ¹⁹ datos de F ya que la señal dependeno sólo en la concentración de ¹⁹ F sino también de la distancia desde la bobina. Adquirir un B ₁ mapa en el canal ¹ h para corregir retrospectivamente ¹⁹ datos de F. Esto requiere que ¹ H y ¹⁹ perfiles de bobina F son idénticos, excepto por el factor de proporcionalidad C, y que la señal de fondo suficiente ¹ H se proporciona en las regiones de ¹⁹ F. Un ejemplo de protocolo para la corrección de una secuencia de eco ¹⁹ F giro se presenta, utilizando una sola sintonía Tx / Rx bobina superficial sintonizable para ambos ¹ H y ¹⁹ C y con proporcional B ₁ perfiles ^13.
   1. Adquirir un flip mapa ángulo ¹ H con el método de dos flip ángulo ^14. Adquirir un eco de gradiente de exploración con TR muy larga (> 3 veces ¹ HT ₁₎ con un ángulo de inclinación estimada de poco menos de 90 °. Cerca de la bobina. Adquirir una segunda exploración eco de gradiente con un RG = dB _1H -6, es decir, el doble de la tapaángulo de la primera exploración.
   2. Calcular el ángulo de giro ¹ H, α, en vóxel (x, y, z) a través de las intensidades de señal (SI) de las primera y segunda exploraciones eco de gradiente: α (x, y, z) = Arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. El ángulo de inclinación ¹⁹ F es idéntico (excepto por el factor 1 / C) debido a la proporcional B ₁ perfiles. Según el principio de Faraday de la reciprocidad ^15, la atenuación de ¹⁹ de intensidad de la señal F de una secuencia de eco de espín (α ángulo flip excitación, reorientar las 2α ángulo flip) durante la recepción de la señal es att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). La atenuación debida a la excitación es imperfecta att _Tx (x, y, z) ~ pecado ³ (α (x, y, z)) ^16. La atenuación en general se escribe como att = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Tenga en cuenta que se normaliza a 1 en caso de perfecto ángulo de 90 ° / 180 ° excitación / reorientación flip. El B ₁ corregida19 F de imágenes intensidades de señal SI _{19F, corr} se calculan a través de la IS _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z).
   3. Con el fin de comparar las intensidades de señal de diferentes experimentos, colocar un tubo de referencia con concentración definida ¹⁹ F en el campo de visión, y normalizar la SI _{19F, corr} a la media de la señal en la referencia.

Nota: Otros ¹ HB métodos ₁ / mapeo ángulo de inclinación se pueden utilizar y diferentes secuencias de pulsos ¹⁹ F requieren modificaciones de att _{Tx, 19F.} Cualquier tipo de esquema de corrección B1 introducirá error adicional en el procedimiento de cuantificación celular. Si la cuantificación de células precisa es la premisa principal, una bobina de RF con perfil B1 homogénea se puede utilizar para eludir esta parte del protocolo.

7. Procesamiento de imágenes

1. Haciendo ^1H y ¹⁹ imágenes de superposición F
   1. Exportación de los datos de imagenpara el final ¹ H y ¹⁹ F imágenes magnitud del escáner.
   2. Abra los archivos en un programa de procesamiento de imágenes, tales como ImageJ (freeware, NIH).
   3. Realice los ajustes de imagen según sea necesario (cultivos, brillo, contraste) manteniendo los ajustes de la misma para todas las imágenes. Las ¹⁹ imágenes F típicamente necesitan ser adoptado como resolución más alta para que coincida con las correspondientes imágenes de H ^1.
   4. Render las ¹⁹ imágenes F en falso color (seleccione una tabla de búsqueda diferente, bajo el menú "imagen" en J de imagen) y luego superponer en las correspondientes imágenes ¹ H con el fin de localizar la señal.
2. ¹⁹ F Cuantificación
   1. Seleccione una imagen F ¹⁹ (imagen magnitud) con las células relevantes y la referencia visible.
   2. En un programa como el de imagen J, dibujar regiones de interés en las células competentes, la referencia y una región fuera del sujeto (ruido).
   3. Utilice el comando Analizary luego medir (o simplemente Ctrl + M) para calcular la intensidad de los píxeles medio dentro de estas regiones, y su área. Sea S (células) se refieren a la intensidad de los píxeles media en el retorno de la inversión a través de las células. Multiplique eso por el volumen (= área x grosor de corte) para calcular el total de la señal.
   4. Cálculo de la SNR, por ejemplo, utilizando la SNR fórmula = 0,65 x S (células) / σ, donde σ es la desviación estándar de la intensidad de los píxeles en un retorno de la inversión fuera de la muestra que está libre de cualquier artefacto desplazamiento químico (típicamente en el aire fondo) ^17. Si la SNR es menor de 5, una corrección para la señal debido al ruido puede ser necesario y se puede llevar a cabo como se describe en otra parte ^{11 10.}
   5. De lo contrario, el cálculo de la cantidad total de ¹⁹ F responsable de la señal en el retorno de la inversión sobre la referencia multiplicando el área de la referencia en la rebanada por rebanada de espesor (para calcular el volumen) por la concentración de ¹⁹ F en la referencia,que es conocido y se supone que es homogénea.
   6. Multiplique este valor por el total de la señal en el retorno de la inversión sobre las celdas, dividido por el total de la señal a través de la referencia para calcular la cantidad de ¹⁹ M en las células.
   7. Calcular el número de células dividiendo ese número por el valor de ¹⁹ M / célula, que se calculó en la sección 2.

Representative Results

Aquí se muestran los resultados típicos de un protocolo que implica la transferencia de ¹⁹ células marcadas con F mensajeras a un ganglio linfático de drenaje. Figura 2 muestra un espectro de RMN de ¹⁹ F 10 ⁶ células marcadas utilizando una referencia TFA. La configuración de formación de imágenes se llevó a cabo como se describe en el protocolo (Figura 3). Para la formación de imágenes in vivo, se utilizó una referencia consistente en un cilindro sellado de la misma etiqueta que se utiliza para las células colocadas entre los pies del ratón. Una imagen procesada representativo se muestra en la Figura 4. Aplicando el protocolo descrito en la sección 7.2, se calculó un número de células de aprox. 1,2 x 10 ⁶ basado en la imagen de magnitud ¹⁹ F prima.

Figura 1. Los pasos clave para el seguimiento de la célula basada en RM ¹⁹ F. datos in vivo. Figura reproducida con permiso ^6. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. Representante espectro ¹⁹ C RMN. El espectro muestra la señal de ¹⁹ F obtenidodebido a la cantidad conocida de referencia, en este caso de TFA, y el número conocido de células, la etiqueta "muestra". Esto se puede utilizar para calcular la cantidad de flúor por célula, lo cual es necesario para la cuantificación in vivo a partir de datos de imagen de RM.

Figura 3. Mapas ángulo de inclinación de los tubos con TFA en agua fueron adquiridas en la ¹ H y ¹⁹ C del canal. El factor de proporcionalidad que se calculó en 1,03 ± 0,08 para esta configuración. FA: flip ángulo.

Figura 4. In vivo ¹ H / ¹⁹ F de la imagen de las células dendríticas mensajeras a un ganglio linfático de drenaje. La figura muestra una imagen representativa de un ratón, con ¹⁹ F de la señal visible,en color falso, en la referencia (R) y las células marcadas. Sólo las patas del ratón se obtuvieron imágenes aquí. En este ejemplo, las células marcadas inyectadas migran al nodo linfático de drenaje. Los parámetros de imagen se resumen en el texto principal. La cifra es sólo para fines ilustrativos.

Discussion

El protocolo descrito aquí describe el procedimiento general para el seguimiento in vivo de células ¹⁹ F resonancia magnética. A pesar de el método de co-incubación descrito, hay varios protocolos diferentes para etiquetar las células con un agente de ¹⁹ F. Sin embargo, la co-incubación se usa con más frecuencia y puede optimizarse por ejemplo, mediante la adición de agentes de transfección ^6. El protocolo de etiquetado real de células dependerá del tipo de célula. Sólo los pasos clave de etiquetado se describen en el protocolo aquí. Generalmente, la etiqueta se prepara y se añadió a las células durante un tiempo seleccionado que van desde unas pocas horas a unos pocos días. Finalmente, las células se deben lavar cuidadosamente para eliminar cualquier exceso de etiqueta, sobre todo si la cuantificación de los datos de las imágenes se llevará a cabo ^3. Si el agente F ¹⁹ incluye una etiqueta de fluorescencia, la presencia de etiqueta fuera (o no unido a) las células se pueden detectar mediante microscopía. Después de etiquetado, es necesario estudiar la célulaviabilidad y funcionalidad, en relación a las células no marcado (por ejemplo, mediante el ensayo de exclusión con azul de tripano). Pruebas de funcionalidad específica de la célula, tales como la capacidad de activar las células T en el caso de los países en desarrollo, también deben llevarse a cabo. Por último, ya que algunos no ¹⁹ etiquetas F resonancia magnética tienen un efecto sobre la migración de las células ^18, dichas pruebas deben también ser incluido para ¹⁹ etiquetas F, especialmente con alta carga de la célula.

El protocolo para el modelo animal también depende de las necesidades del usuario. Sin embargo, es importante recordar los límites de sensibilidad estrictos de MRI ^{de 19F} en la planificación de los experimentos. Valores de sensibilidad Publicado van desde 1,000-00,000 cells/voxel/1 hr ^6, con una carga de las células en el rango de 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. La sensibilidad y la concentración de la etiqueta se espera en la región de interés también afectan los parámetros de imagen. Por ejemplo, el grosor del corte utilizado para la imagen ¹⁹ F puede ser adj USTED para que coincida con la de las imágenes ¹ H o para cubrir un área mucho más gruesa (como todo el ganglio linfático o región de interés en una sola rebanada). Típicamente, el F de formación de imágenes ¹⁹ se lleva a cabo a una resolución más baja para maximizar la detección de la señal, especialmente desde alta resolución no es generalmente necesario distinguir estructuras tales como los ganglios linfáticos. Si la señal es suficiente, un mayor número de cortes más finos puede ser adquirida y la señal total sobre el volumen de interés calculado a partir de éstos. Sin embargo, tendrán que ser derivada para cada aplicación de forma individual los parámetros óptimos.

Se describe un protocolo de inyección de anestesia con ketamina / xilazina evitando los gases de inhalación fluorados como isoflurano. Otros protocolos se han utilizado en la literatura ^10,11. Sin embargo, en todos los casos, tendrán que ser ajustados para la cepa de ratón, la edad, el género, la salud y la duración y frecuencia de las sesiones de formación de imágenes de estos protocolos.

ontenido "> Varios ¹⁹ secuencias de imágenes de resonancia magnética F se han utilizado para el seguimiento de la célula, para una revisión ver ^6. Nuestro protocolo de formación de imágenes puede ser fácilmente modificado para incluir otras secuencias de imágenes. Sin embargo, el método de cuantificación descrito aquí no tiene en cuenta ningún volumen parcial efectos, las discrepancias en la selección de regiones de interés, cambios en los parámetros de relajación de la etiqueta en vivo, o cambios en celular ¹⁹ F carga. Estos problemas se describen en otro lugar ^3. En resumen, se ha encontrado el error para estar dentro de los límites tolerables para el seguimiento de la célula longitudinal ^10. En comparación con estos trabajos anteriores que, además, propone un esquema de corrección de la imagen para el uso de bobinas de RF de superficie mediante la asignación del campo B1. Dependiendo de la configuración específica de la bobina de RF es importante ser consciente de las limitaciones de las técnicas de mapeo B1, que han sido bien estudiado en el contexto de ¹ H resonancia magnética ^16. Por ejemplo, para el método de doble ángulo que aquí se presenta el B1mapa es más preciso para pares de ángulos tirón justo por debajo de 90 ° -180 ° ¹⁴ y error significativo puede ser introducido en otras regiones. Aún así, después de la validación adecuada in vitro, tal corrección retrospectiva puede mejorar aún más la cuantificación celular. En general, se recomienda la corroboración de los datos con las técnicas más establecidas, al menos inicialmente. Esto normalmente se realiza en combinación con otras técnicas en vivo de imágenes, por ejemplo, las imágenes ópticas, para ayudar a excluir errores grandes. En la mayoría de los casos, la evaluación histológica es necesario evaluar ¹⁹ ubicación de la etiqueta F con precisión y para permitir la correlación con los datos de imagen. Esto puede requerir la adición de un colorante fluorescente al agente ¹⁹ F.

Por último, aunque ¹⁹ F RMN aún no se ha aplicado a la célula de seguimiento clínico, sería posible modificar este protocolo para el uso humano. Las principales modificaciones serían necesarias para llevar a cabo la mayor cantidad de optimción y puesta en marcha de antemano como sea posible (para minimizar la longitud de tiempo que el sujeto está en el escáner), y ajustar los parámetros de imagen para mantenerse dentro de la tasa de absorción específica (SAR) en clínica restricciones.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec