In vivo ¹⁹ F MRI för Cell Tracking

Summary

Vi beskriver ett generellt protokoll för in vivo cellspårning med hjälp av MRI i en musmodell med ex vivo märkta celler. Ett typiskt protokoll för cellmärkning, bildförvärvandebehandling och kvantifiering är inkluderad.

Abstract

In vivo ¹⁹ F MRI möjliggör spårning kvantitativ cell utan användning av joniserande strålning. Det är en icke-invasiv teknik som kan tillämpas på människor. Här beskriver vi ett allmänt protokoll för cellmärkning, bildframställning, och bildbehandling. Tekniken kan tillämpas på olika celltyper och djurmodeller, men här fokuserar vi på en typisk musmodell för att spåra murina immunceller. De viktigaste frågorna för cellmärkning beskrivs, eftersom dessa är relevanta för alla modeller. På samma sätt är viktiga avbildningsparametrar listas, även om detaljerna kommer att variera beroende på MR-systemet och den individuella inställningen. Slutligen inkluderar vi en bildbehandlings protokoll för kvantifiering. Variationer för detta, och andra delar av protokollet, bedöms i diskussionsavsnittet. Utifrån den detaljerade förfarande som beskrivs här, kommer användaren måste anpassa protokollet för varje specifik celltyp, celletikett, djurmodell, och bildhantering setup. Observera att protocol kan också anpassas för användning på människor, så länge kliniska begränsningar uppfylls.

Introduction

In vivo-cell-spårning är nödvändig för optimering och övervakning av cellulära terapeutika ^en. På grund av sin icke-invasiv art, erbjuder bildbehandling utmärkta möjligheter att övervaka celler in vivo. Magnetisk resonanstomografi (MRT) är oberoende av joniserande strålning och ger en överlägsen bildbehandling upplösning och inneboende mjukdelar kontrast. MRI-baserade cellspårning har redan använts kliniskt för att följa dendritiska celler i melanompatienter ^2. Konventionell klinisk MRT utförs på ^ett H nucleus, närvarande i rörligt vatten i vävnader. Det är också möjligt att genomföra MRI på andra aktiva kärnor, såsom ¹³ C, ¹⁹ C och ²³ Na. Däremot har endast ¹⁹ F MRI tillämpats med framgång på in vivo-spårning cell, eftersom det ger den högsta känsligheten efter ¹ H. Frånvaron av MR-detekterbar endogen ¹⁹ F i vävnader tillåter hög selektivitet signal fördetektering av exogena ¹⁹ F-kontrastmedel och tillåter kvantifiering av fluorkoncentrationen direkt från bilddata. För en detaljerad diskussion om ¹⁹ K MRI, se ^3-5. En nyckelfråga med ¹⁹ F MRI är behovet av att utveckla och optimera lämpliga ¹⁹ F celletiketter, även om flera etiketter har utvecklats, med en trend mot multimodala medel ^6.

Protokollet som beskrivs här är baserad på studier av våra grupper ^7-9, bland de första artiklarna som beskrivs i vivo kvantitativ ¹⁹ F MRI-baserade cell tracking ^10,11. Det allmänna förfarandet för cellspårning med hjälp av ¹⁹ F MRI sammanfattas i Figur 1. Vi beskriver ett generellt protokoll för märkning och avbildning av dendritiska celler (DC) med hjälp av en skräddarsydd perfluorkol kontrastmedel ^8. Den avbildning protokollet är allmänt för olika celltyper, etiketter och djurmodeller. Dencelltyp och djurmodell som beskrivs här bör endast ses som ett exempel, och därför vi inte tillhandahåller information om cellisolering och märkning, utan snarare fokusera på bildprotokoll. Modifieringar kommer att vara nödvändigt för varje etikett, celltyp, djurmodell, och avbildning setup, och dessa kan hittas i litteraturen eller kan behöva optimeras genom forskarna. Några vanliga modifieringar är inkluderade i diskussionen.

Protocol

OBS: Alla experiment och som deltar i djurförsök skall utföras i enlighet med gällande etiska riktlinjer och överensstämmer med standarden djuromsorg och humana krav.

1. Cell Märkning (standard protokoll med saminkubering)

1. Lägg ¹⁹ F etikett ⁸ till omogna DC vid en koncentration av 4 mg/10 ^6-celler (i 2 ml medium). Skaka försiktigt för blandning.
2. Inkubera cellerna med märket för 3 dagar före mognad och skördande av DCs.
3. Samla DCs och avlägsna överskott etikett genom att tvätta minst 3x i PBS. Räkna celler.
4. Resuspendera i en liten volym PBS för injektion eller ytterligare testning.

OBS: Detta protokoll är relevant för dessa specifika DCs och etikett. Förfarandet optimeras i en annan publikation ⁸ och med här är bara de åtgärder för att förbereda ett prov till bilden, eftersom fokus för detta protokoll är på avbildning. Hhet, protokoll för isolering, kultur och märkning av en viss celltyp kommer antingen måste hittas i litteraturen eller optimeras av forskaren. En sammanfattning av alla andra ¹⁹ F etiketter som har använts i litteraturen presenteras på annan plats ^6.

2. Bestämning av ¹⁹ F / cell med användning av ¹⁹ ^ ^ F NMR

1. Placera ett känt antal märkta celler (typiskt mer än 0,5 x 10 ^6, eller ett tal som resulterar i tillräcklig signal) i ett NMR-rör.
2. Tillsätt 10 pl av 5% trifluorättiksyra (TFA). Om resonansfrekvensen för TFA är olämpligt på grund av att överlappa med den etikett, använda en alternativ löslig förening, företrädesvis med en enda ¹⁹ F resonans.
3. Placera provet i en NMR-spektrometer och få ¹⁹ K spektrumet. Se till att bandbredden är tillräcklig för både TFA (referens) och agenten.

Obs: TR bör vara tillräckligt lång för fUll uppmjukning av referensen och provet snurrar (cirka 5 gånger _T1 relaxationstiden för längsta T ₁ komponent i röret, typiskt TR ~ 5-8 sek). Vissa spektrometrar kräver D ₂ O för en frekvens lås signal. En standard ¹⁹ F-spektrum är tillräcklig. Omfattande medelvärdes eller högre cell nummer kommer att krävas om cellupptag av etiketten är dålig eller om cell nummer är låga. Spektrum ska centreras mellan referens och relevanta etiketttoppar, om inte korrigeringar görs för att ta hänsyn till partiell excitation.

4. Beräkna de relativa areorna under topparna i referensen och provet (eller huvudtoppen av provet), och sedan beräkna det genomsnittliga antalet ¹⁹ F: s / cell i provet.

OBS: Hela processen måste upprepas och genomsnitt omfattande nog att nå statistisk signifikans. Detta kan också göras med hjälp av spektroskopi direkt vid MRI-scanner. However, observera att detta förfarande visar endast den genomsnittliga ¹⁹ K laddar för ett stort antal celler, inte variabiliteten mellan celler. Kontrollerat cellens likformighet upptag kräver närvaron av en fluorescerande komponent vid ¹⁹ F medlet, så att cellupptag kan analyseras med mikroskopi eller flödescytometri.

3. Överväganden för experimentell design - Cell Injection

På grund av den relativt dåliga känsligheten hos ¹⁹ F MRI för spårning cell, en djurmodell där cellerna kommer att lokalisera i stort antal som är nödvändigt för framgångsrik in vivo imaging. Typiska känslighetsvärdena varierar från 1,000-100,000 cells/voxel/1 hr skanningstid ^6, med en cell belastning i intervallet 10 ¹¹ -10 ¹³ fluoratomer.

Antalet och frekvensen av avbildning sessioner måste planeras noggrant, eftersom det påverkar valet av narkosmedel. Observera att isofluran kan inte vara suitable för ¹⁹ F MRI om ¹⁹ F resonansfrekvensen för isofluran är nära den för märkföreningen användas. isofluran kan ändå vara lämpligt om avbildning sessioner är tillräckligt kort för att förhindra betydande uppbyggnad. Flera alternativa anestetika har använts i litteraturen ^10,11; ett exempel ingår i avbildningsprotokoll. Anestetika kan behöva optimeras för olika musstammar och sjukdomsmodeller.

4. Design av en extern ¹⁹ F Reference

1. Använd en extern referens som innehåller en känd mängd av ¹⁹ K signal för kvantifiering ^12. Välj signalintensiteten av hänvisningen vara ungefär jämförbar med den som förväntas från motivet.

Anmärkning: I allmänhet är det enklast om referensföreningen är densamma som cellens etikett, för att matcha de relaxa parametrar. Om spektroskopiska sekvenser eller sekvenser utan rumslig lokalisering används, då acompound med en annan kemisk förskjutning kan vara nödvändig.

2. Ändra placering, storlek och form av referens vid behov beroende av regionen av intresse (ROI). OBS: Det är i allmänhet lättast att använda rör med ett likformigt tvärsnitt för referens.

5. Imaging och mus Förberedelse

1. Späd kommersiellt tillgänglig ketamin och xylazin 1:10 vol / vol med fysiologisk saltlösning för erhållande av stamlösningar av 10 mg / ml ketamin och 2 mg / ml xylazin.
2. Slå på värmesystemet i skannern (typiskt varm luft) för att se till att hålet blir varm innan musen avbildas.
3. Injicera 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin intraperitonealt för att initiera anestesi. Anm: Dessa doser har testats för CD1 (ICR) och NU-Foxn1 ^nu 8 veckor gamla hanmöss. Andra stammar kan behöva något olika doser, som bör optimeras i ett separat experiment. Denna dos kommer att hålla musen sövd för enskjutningen 45 min. Anm: Djupet av anestesi är normalt tillräckligt om djuret visar ingen reaktion på en fot nypa.
4. När sövda, placera djuret i en djurhållaren och immobilisera att förhindra rörelse under MRI. Förekommande fall, positionera den externa referensen bredvid djuret. Både referensen och ROI (förväntade placeringen av de injicerade cellerna) bör vara i centrum av spolen. Djuret ska anslutas till temperatur och andningskontroll för fysiologisk övervakning under skanning.
5. Täck ögonen på musen med steril ögonsalva för att förhindra uttorkning under långa avbildning sessioner.
6. Om avbildningstiden överstiger 40 minuter, förbereda ytterligare katetrar för tillskott av ytterligare ketamin / xylazin innan djuret kan vakna. Position två separata subkutana katetrar med arbets lösningar av ketamin och xylazin. Använd denna kateter för att ge musen en ytterligare 2,5 mg av ketamin var 20 min efter den första 40 min. Om det behövs ytterligare förlänga anestesi genom injektion av ytterligare 0,5 mg xylazin genom katetern, 100 min efter den initiala injektionen. I samtliga fall bör experimentell tid inte överstiga 3 timmar, utom möjligen under terminal anestesi.
7. Kontrollera att musen värms direkt efter den första injektionen och hölls vid 37 ° C kroppstemperatur. Med detta protokoll, <syresättning 80% blod upptäcktes i atmosfären andas fritt. För att undvika biverkningar från syresättning sänkt blod, använd 100% syre (0,3 l / min). Kroppstemperatur och andning bör kontrolleras i hela experimentet och tills fullständig återhämtning av djuret. Observera att den spontana andning enligt ketamin / xylazin är mycket hög (200-250/min). Oregelbundenheter i andningsmönster, snarare än den andningshastighet, kan indikera att en högre dos är nödvändigt att upprätthålla ett lämpligt tillstånd av anestesi. Musen kommer att väcka spontant inom 20-30 min after den sista dosen av bedövningsmedel.

Notera: För spårning cell, är det nödvändigt att avbilda samma djur mer än en gång. I så fall bör de avbildning sessioner planeras med hänsyn till den tid som krävs för godkännande av anestesi från system-och djur riktlinjer för institutets användning.

6. Imaging

¹ H justeringar och bildbehandling

1. Placera djuret inuti skannern så att ROI är i isocentret med användning av en låg upplösning, anatomical avsökning med olika segmentorienteringar (a anpassaren).
2. Använd den vanliga mellanlägg protokollet den ¹ H, t.ex. en global shim på hela volymen inuti spolen.
3. Justera referenspulsen förstärkningen (RG), dvs sändareffekten mätt i dB för ett 1 ms Hermite 90 ° RF-puls, med hjälp av justerings scan som tillhandahålls av leverantören.

OBS: Denna inställning kommervarierar med typ av RF-spole och är nödvändig för ¹⁹ F MRI eftersom signalen på ¹⁹ K frekvens är oftast för låg för direkta justeringar. Som en följd härav måste en uppskattning av RG göras från mätningar på ^en H-signal. För RF-överföring med en yta spole bör ^1H RG justeras till ett plan parallellt med spolen genom den del av intresse, för en volym pole med homogena B ₁ profil, de exakta inställningarna för justeringen är mindre viktiga.

4. Följande protokoll av ¹⁹ F referenspuls förstärkningsjustering fungerar endast om både ^ett H och ¹⁹ F RF-överföring utförs med samma (enkel eller dubbel-avstämd) RF-spole. För en sådan avbildning setup, bör spolen profil (B ₁ sändarfält) på ¹ H stå i proportion till den ¹⁹ K spole profil, när en fast RG tillämpas, det vill säga B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} med en propellerortionality konstant C.
   1. För att bekräfta att coil profiler är proportionell för en viss inställning, skaffa en ¹ H och ett ¹⁹ K flip vinkel kartan (se nästa avsnitt på B ₁ korrigering) på ett rör med högkoncentrerad ¹⁹ F, t.ex. TFA i vatten (1:1 v / volym) med användning av identiska fält-of-view (FOVs), i förväg (fig 3).
   2. Med samma RG, kontrollera att båda kartorna är identiska med undantag för den globala faktorn C.
   3. När ^1H RG bestäms, notera ner detta antal.
5. Utför en konventionell ^1H MR-undersökning som en anatomisk referens för ¹⁹ K avbildning. Anpassa systemet till ¹⁹ K frekvensen av cellmarkör och genomföra en ¹⁹ K MR skanning. Helst ¹⁹ F MRT kommer att ha samma fält-of-view och skiva val som ^1H MRI, dock oftast med lägre upplösning. Djuret kan återupplivas så snart fantasing är klar. Bildbehandling kan sedan utföras offline.
6. Bestäm ¹⁹ F RG via relationen dB _19F = dB _1H -20 * log ₁₀ (C). Uppskatta agent frekvens på ¹⁹ F i ett separat in vitro experiment.

OBS: In vivo, kan den exakta frekvensen variera något från experiment till experiment på grund av olika mellanlägg förhållanden. För att förhindra kemiska skiftartefakter den exakta frekvensen bör därför fastställas i varje experiment med ¹⁹ K MRS, om möjligt. En typisk skanning för mycket låga ¹⁹ F-signalen skulle vara global (puls-förvärva) spektroskopi (TR = 200 ms, NEX = 3,000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX, alltså TA, kan minskas drastiskt för hög ¹⁹ K-signal. Den ¹⁹ F agent frekvensen bestäms av spektrumet efter Fourier-transformation och fas korrigering. NEX avser antalet av excitationer är TA uppsugningstiden och BW är denbandbredd.

Obs: Typiska imaging parametrar ⁹ på en 11.7T/16 cm dedikerad djur skanner är: En anatomisk ^1H imaging skanning med en turbo spin eko (TSE) sekvens med TR / effektiv eko tid (TE _eff) = 2,200 msec/42.8 msek, 8 ekon per excitation, NEX = 2, 10 i rad, 1 mm tjocka skivor, FOV = 1,92 x 1,92 cm ^2, 128 x 128 matris, dvs en upplösning på 150 x 150 x 1,000 um ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz och en linjär fas kodningsschema. ¹⁹ F bilder förvärvades med samma sekvens och matchande geometri, men vid lägre i planet upplösning och lägre BW (NEX = 256, 48 x 48 matris, dvs en upplösning på 400 x 400 x 1000 um ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ rättning
   Använda en RF-spole med inhomogen B ₁ profil, t.ex. en yta spole, kan hämma kvantifiering av ¹⁹ K uppgifter eftersom signalen berorinte bara på ¹⁹ K koncentrationen utan också på avståndet från spolen. Skaffa en B ₁ karta på ^1H-kanalen för att i efterhand korrigera ¹⁹ F uppgifter. Detta kräver att ¹ H och ¹⁹ F spole profiler är identiska, med undantag för den proportionalitetsfaktor C, och att tillräcklig ^1H bakgrundssignalen finns i regioner av ¹⁹ F. Ett exempel protokoll för korrigering av en ¹⁹ K spinn eko sekvens presenteras, med en enda-trimmad Tx / Rx ytspole avstämbara till både ¹ H och ¹⁹ F och med proportionell B ₁ profiler ^13.
   1. Skaffa en ^1H flip kart vinkel med två flip vinkelmetoden ^14. Skaffa en gradient eko skanning med mycket lång TR (> 3 gånger ¹ HT ₁₎ med en uppskattad flip vinkel på strax under 90 °. Nära till spolen. Skaffa en andra gradient eko skanning med en RG = dB _1H -6, dvs dubbelt luckanvinkeln för den första avsökningen.
   2. Beräkna ^ett H flip-vinkel, α, åtmin voxel (x, y, z) via signalintensiteterna (SI) av de första och andra gradient echo avsökningar: α (x, y, z) = arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. Den ¹⁹ F flip-vinkel är identiskt (med undantag för faktor 1 / C) på grund av proportionellt B _1-profiler. Enligt Faradays reciprocitetsprincipen ^15, dämpningen av ¹⁹ F-signalintensiteten från en spin echo sekvens (excitation flip-vinkel α, omfokusering flip-vinkel 2α) under signalmottagningen är attR _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). Dämpningen beror på defekt excitation är attR _Tx (x, y, z) ~ synd ³ (α (x, y, z)) ^16. Den totala dämpningen skrivs som ATT = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Observera att det är normaliserat till 1 i fall av perfekt 90 ° / 180 ° excitation / omfokusering flip-vinkel. B ₁ korrigerade19 F-bildsignalintensiteterna SI _{19f, corr} beräknas via SI _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / attR (x, y, z).
   3. För att jämföra signalintensiteterna från olika experiment, placera en referensröret med definierad ¹⁹ F-koncentrationen i synfältet, och normalisera SI _{19F, korr} till medelvärdet signal i referensen.

OBS: Andra ¹ HB ₁ / flip vinkel karteringsmetoder kan användas och olika ¹⁹ F pulssekvenser kräver modifieringar av _{att-Tx, 19F.} Varje form av B1 korrigeringsschema kommer att införa ytterligare fel i cell kvantifiering förfarandet. Om exakt cell kvantifiering är den viktigaste förutsättningen, kan en RF-spole med homogen B1 profil användas för att kringgå denna del av protokollet.

7. Bildbehandling

1. Göra ¹ H och ¹⁹ F overlay bilder
   1. Exportera bilddataför den sista ¹ H och ¹⁹ F magnitud bilder från skannern.
   2. Öppna filerna i ett bildbehandlingsprogram, till exempel ImageJ (freeware, NIH).
   3. Utför bildjusteringar som behövs (beskära, ljusstyrka, kontrast) hålla justeringarna samma för alla bilder. De ¹⁹ F bilderna kommer normalt att behöva skalas upp till en högre upplösning för att matcha motsvarande ^en H-bilder.
   4. Rendera de ¹⁹ F bilder i falsk färg (välj ett annat uppslagstabell, under "image"-menyn i Bild J) och sedan överlagra på motsvarande ¹ H bilder för att lokalisera signalen.
2. ¹⁹ F Kvantifiering
   1. Välj en ¹⁹ F bild (storlek bild) med de relevanta cellerna och referensen synlig.
   2. I ett program som Bild J, rita ROI över de relevanta cellerna, referens och ett område utanför ämnet (buller).
   3. Använd kommandot Analyseraoch sedan mäta (eller helt enkelt på Ctrl + M) för att beräkna medelvärdet pixelintensiteten inom dessa områden, och deras område. Låt S (celler) hänvisar till den genomsnittliga pixelintensiteten i ROI över cellerna. Multiplicera det med volymen (= area x slice tjocklek) för att beräkna den totala signalen.
   4. Beräkna SNR, exempelvis med användning av formeln SNR = 0,65 x S (celler) / σ, där σ är standardavvikelsen av pixelintensiteten i en ROI utanför provet, vilket är fritt från varje kemiskt skift artefakt (typiskt i bakgrunden luft) ^17. Om SNR-förhållandet är under 5, kan en korrektion för signalen på grund av att bullret vara nödvändig och kan utföras såsom beskrivs på annan plats ^{11 10.}
   5. Annars, beräkna den totala mängden av ¹⁹ F ansvarig för signalen i ROI under referens genom att multiplicera arean av referensen i skiva för skiva tjocklek (för att beräkna volym) och koncentrationen av ¹⁹ F i referensen,som är känd och antas vara homogen.
   6. Multiplicera detta värde av den totala signalen i ROI över de celler, dividerat med den totala signalen under referens att beräkna mängden av ¹⁹ F i cellerna.
   7. Räkna antalet celler genom att dividera den siffran med värdet för ¹⁹ F / cell, som beräknades i avsnitt 2.

Representative Results

Här visar vi de typiska resultaten för ett protokoll som innebär överföring av ¹⁹ F-märkta celler målsökande till en dränerande lymfkörtel. Figur 2 visar en ¹⁹ F-NMR-spektrum av 10 ^6-märkta celler med användning av ett TFA-referens. Den avbildning installationen utfördes som beskrivs i protokollet (Figur 3). För in vivo-avbildning i använde vi en referens som består av en försluten cylinder med samma etikett som används för cellerna placerade mellan fötterna på musen. Ett representativt bearbetade bilden som visas i fig 4. Genom att tillämpa det protokoll som beskrivs i avsnitt 7.2, vi beräknat en cell nummer på ca. 1,2 x 10 ⁶ baserat på den råa ¹⁹ K magnitud bild.

Figur 1. Viktiga steg för ¹⁹ F MRI-baserade cellspårning. vivo-data. Figur återges med tillstånd ^6. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Representativa ¹⁹ F-NMR-spektrum. Spektrat visar ¹⁹ F signal erhållengrund av den kända mängden av referens, i detta fall TFA, och det kända antalet celler, betecknade "prov". Detta kan användas för att beräkna mängden fluor per cell, vilket är nödvändigt för in vivo kvantifiering av MR-bilddata.

Figur 3. Flip vinkel kartor över rör med TFA i vatten förvärvades i ¹ H och ¹⁹ K-kanalen. Proportionalitetsfaktorn beräknades till 1,03 ± 0,08 för denna inställning. FA: flip vinkel.

Figur 4. In vivo ^1H / ¹⁹ F bild av dendritiska celler målsökande till en dränerande lymfkörtel. Figuren visar en representativ bild av en mus, med ¹⁹ K-signalen syns,i falsk färg, i referensen (R) och de märkta cellerna. Endast benen hos mus avbildades här. I detta exempel är de injicerade märkta cellerna migrerat till den dränerande lymfkörteln. De avbildningsparametrarna sammanfattas i huvudtexten. Siffran är bara ett exempel.

Discussion

Protokollet som beskrivs här beskrivs den allmänna proceduren för in ^vivo-19 F MRI cellspårning. Trots den beskrivna saminkubering metod, det finns flera olika protokoll för märkning av celler med en ¹⁹ F agent. Emellertid är samtidig inkubering oftast används och kan optimeras ytterligare, t.ex. genom tillsats av transfektionsmedel ^6. Själva cellmärkning protokoll kommer att bero på celltypen. Bara viktiga märkningssteg beskrivs i protokollet här. Generellt är etiketten ställdes och sattes till cellerna under en vald tid som sträcker sig från några timmar till några dagar. Slutligen måste cellerna tvättas noggrant för att ta bort eventuellt överskott av etikett, speciellt om kvantifiering av bilddata kommer att genomföras ^3. Om ¹⁹ F-medlet innefattar en fluorescens etikett, av förekomsten av markör utanför (eller som inte är bunden till) de celler som kan detekteras med hjälp av mikroskopi. Efter märkning är det nödvändigt att studera celllivsduglighet och funktion i förhållande till nonlabeled celler (t.ex. genom exklusion med trypanblått). Cellspecifika funktionstester, såsom förmågan att aktivera T-celler i fallet med DCs måste även utföras. Slutligen, som en del ^icke-19 F MRI etiketter har en effekt på cellmigration ¹⁸ sådana tester bör också ingå för ¹⁹ F etiketter, speciellt med hög cell belastning.

Protokollet för djurmodellen är också beroende av användarens behov. Det är dock viktigt att komma ihåg de strikta känslighetsgränser för ¹⁹ F MRI vid planering av experiment. Publicerade känslighetsvärden sträcker sig från 1,000-00,000 cells/voxel/1 hr tid ^6, med en cellbelastning i området av 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. Känslighet och förväntade etikett koncentrationen i regionen av intresse också påverka avbildningsparametrarna. Till exempel kan snittjockleken används för ¹⁹ F bilden adj Usted att de matchar de ¹ H bilderna eller för att täcka ett mycket tjockare område (t.ex. hela lymfkörtel eller region av intresse i en enda bit). Typiskt är ¹⁹ F avbildning utföres vid lägre upplösning för att maximera signaldetektering, särskilt eftersom hög upplösning är oftast inte nödvändigt att skilja strukturer såsom lymfkörtlar. Om signalen är tillräckligt, kan ett större antal tunnare skivor förvärvas och den totala signalen över volymen av ränta från dessa. Dock kommer de optimala parametrar behöver härledas för varje ansökan individuellt.

Vi beskriver en injektion anestesi protokoll med ketamin / xylazin undvika fluorerade inandning gaser som isofluran. Andra protokoll har använts i litteraturen ^10,11. Men i alla fall, kommer dessa protokoll behöva justeras för musen stam, ålder, kön, hälsa och längd och frekvens avbildning sessioner.

ontent "> har flera ¹⁹ F MRI sekvenser använts för att spåra cell, för en översikt se ^6. Vår bildprotokoll kan lätt modifieras för att inkludera andra bildsekvenser. Däremot kvantifiering metod som beskrivs här inte hänsyn till någon partiell volym effekter, är skillnader i val av ROI, förändringar i avslappning parametrar för etikettens in vivo, eller förändringar i cellulär ¹⁹ F belastning. Dessa frågor beskrivs på annat håll ^3. I korthet har funnit felet vara inom acceptabla gränser för longitudinell cellspårning ^10. Jämfört med de tidigare verken vi dessutom föreslå en bildschema för användning av yt-RF-spolar korrigering genom att kartlägga B1 fältet. Beroende på den specifika RF-spole installationen är det viktigt att vara medveten om begränsningar av B1 kartläggningstekniker, som har varit väl studerade i samband med ^en H MRI ^16. Till exempel för dubbla vinkeln metod som presenteras här B1kartan är mest exakta för flip vinkel par strax under 90 ° -180 ° ¹⁴ och betydande fel kan införas i andra regioner. Fortfarande, efter ordentlig validering in vitro, t.ex. retroaktiv korrigering kan ytterligare förbättra cell kvantifiering. I allmänhet rekommenderar vi bekräftelse av data med mer etablerade tekniker, åtminstone inledningsvis. Detta görs vanligtvis i kombination med andra in vivo avbildningstekniker, till exempel optisk avbildning, för att utesluta stora fel. I de flesta fall är det nödvändigt med histologisk utvärdering för att bedöma ¹⁹ F etikett läge exakt och för att medge korrelation med bilddata. Detta kan kräva tillsats av en fluorescerande färg till ¹⁹ F medlet.

Slutligen, även om ¹⁹ F MRI har ännu inte tillämpats på klinisk spårning cell, skulle det vara möjligt att ändra detta protokoll för humant bruk. De viktigaste ändringarna som krävs skulle vara att göra så mycket av optimnisation och inställning i förväg som möjligt (för att minimera den tid motivet är i skannern), och att anpassa imaging parametrar att hålla sig inom klinisk Specific Absorption Rate (SAR) begränsningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec