Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

Published: November 16, 2013 doi: 10.3791/50844
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

Abstract

Bakteriyel hücre bölünmesi esnasında, esas teşkil eden protein FtsZ sözde Z-halka oluşturmak için hücre ortasında toplanır. FtsZ in vitro GTP varlığında, uzun lifler halinde polimerize ve polimerizasyon çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yaygın ışık saçılımı, sedimantasyon, GTP hidroliz deneyleri ve elektron mikroskopi dahil olmak üzere temel yöntemler kullanılarak in vitro incelenmiştir. Tampon koşullar etkisi de her iki FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinlerle etkileşime FtsZ yeteneği. Burada, biz FtsZ polimerizasyon çalışmalar için protokol tanımlamak ve model proteinler olarak Escherichia coli ve Bacillus subtilis FtsZ kullanarak koşulları ve denetimleri doğrulamak. Bir düşük hızlı çökelme tahlili FtsZ polimerleri paket ya tubulate proteinlerle FtsZ etkileşimi çalışma sağlayan sokulur. Geliştirilmiş bir GTPaz deney protokolü test edilmesine olanak tarif edilmektedirfosfat saptama tepki olarak renk gelişimi varyasyonu kaldırılması standart enkübasyon süreleri ile 96 oyuklu bir plaka kurulumu, çeşitli koşullar kullanılarak, zaman içinde GTP hidrolizinin. Işık saçılması çalışmaları ve elektron mikroskopisi için numunelerin hazırlanması tarif edilmektedir. Çeşitli tamponlar FtsZ polimerizasyon çalışmalar için uygun tampon ve pH, tuz konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. KCl yüksek bir konsantrasyonu, deneylerin büyük bir kısmında en iyisidir. Bizim yöntemleri E. değil sadece FtsZ in vitro karakterizasyonu için bir başlangıç ​​noktası sağlar coli ve B. subtilis ama başka bir bakteriden. Bu nedenle, bu buluşun metodları düzenleyici proteinler veya FtsZ polimerizasyonu etkileyen antibakteriyel ilaçların test ile FtsZ etkileşimi çalışmaları için kullanılabilir.

Introduction

Esansiyel bakteriyel protein FtsZ bakteriyel hücre bölünmesi makine en iyi karakterize edilmiş bir proteindir. FtsZ tubulin prokaryotik homolog olan ve bir GTP bağlı bir şekilde, in vitro olarak polimerize eder. FtsZ bakteri 1,2 onun korunmuş doğası ve teklik nedeniyle yeni antibiyotik için çok cazip bir hedeftir. Hücre bölünmesi başında, FtsZ diğer hücre bölünmesi proteinlerin montajı için bir yapı iskelesi olarak hizmet midcell bir cytokinetic halka oluşturur. Z-halka oluşumu bölme düzlemi doğru lokalizasyonu için çok önemlidir. FtsZ montajı dinamikleri gibi Minc, SepF, Zapa, UgtP, ve Ezra 2 (bakteri türlerine bağlı olarak) gibi çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yoğun in vitro ve protofilaments düz, kavisli protofilaments, filament levha, filaman demetleri ve filament tüpler dahil olmak üzere, pek çok farklı yapılarda incelenmiştir des olmuşturmontaj tampon, nükleotid ve deneyde 3 dahil ek protein bağlı cribed. Caulobacter crescentus elektron cryotomography deneyler Z-halkası geniş 4 donatılacak olmadan nispeten kısa, kesintili tek protofilaments monte edilir olduğunu göstermektedir rağmen in vivo FtsZ protofilaments mimarisi henüz tam olarak anlaşılmış değildir.

İn vitro olarak, FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinleri ile FtsZ etkileşimi reaksiyon tampon bileşimine duyarlıdır. Örneğin, son zamanlarda FtsZ C-terminüsünde SepF için etkileşim sitesi tarif edilen ve bir FtsZ Δ16 arasında C-terminal kesik artık SepF 5 bağlandığını göstermiştir. SepF-FtsZ İşletmeleri etkileşim önceki bir çalışmada, benzer bir FtsZ İşletmeleri Δ16 hala SepF FtsZ üzerinde ikincil bir siteye bağlanan önerdi SepF ile cosedimented kesilmesinden et al. SepF fonksiyonel değildir ve pH 6.5 'de görülen cosedimentation FtsZ Δ16 arasında C-terminal kesik ile SepF çökelmesi yerine etkileşimin neden olması muhtemel olduğunu gösteren, pH 6.5 7 çökeltilerini kaydetti. FtsZ polimerizasyonu pH ve KCl konsantrasyonunun etkisi daha önce incelenmiştir. E. polimerleri pH 6.5 coli FtsZ (FtsZ Ec) daha uzun ve daha bol nötr pH 8,9 oluşmuş daha vardır. Tadros et al. K + bağlayıcı FtsZ Ec polimerizasyonu ile bağlantılı ve FtsZ aktivitesi 10 için çok önemli olduğunu belirterek tek değerli katyonların mevcudiyetinde FtsZ Ec polimerizasyonunu inceledik. PH daha critica olduğuSepF önceki örnek ve FtsZ 11 MINC inhibitör etkisinin pH bağımlılığı ile gösterildiği gibi diğer proteinler ile FtsZ etkileşimi, incelenmiştir l. PH ve tuz konsantrasyonu hem de diğer proteinler ile FtsZ etkileşimini etkileyebilir gibi, bu FtsZ polimerizasyon çalışmaları için doğru koşulları ve kontrolleri seçmek önemlidir.

Burada ışık saçılması, elektron mikroskobu, sedimantasyon ve GTPaz deneyleri ile FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz aktivitesini incelemek için protokolleri açıklanmıştır. Sağ açılı ışık dağılımı gerçek zamanlı 12 FtsZ polimerizasyon okumak için standart bir yöntemdir. Biz sedimantasyon ve GTPaz tahlil için birkaç iyileştirmeler tanıttı. Biz ışık saçılması ve elektron mikroskobu için numune hazırlamak için nasıl ayrıntılı olarak mevcut. FtsZ polimerizasyonu çalışma literatürde kullanılan çeşitli tamponlar test ve her deney için en iyi şartları tarif edilmiştir. Biz de olmalıdır kontrol eden göstermeken iyi veri elde etmek tanıttı.

Bu yöntemler FtsZ polimerizasyon aktivitesi ve basit bir yöntem ve en laboratuvarlarda mevcuttur ekipman kullanılarak başka proteinlerle etkileşim hızlı bir çalışma sağlar. FtsZ polimerizasyonu incelemek için daha sofistike yöntemler var ama genellikle floresan etiketleri 8,13,14 ile daha özel ekipmana erişim ve / veya FtsZ değiştirilmesini gerektirir. Bu yazıda anlatılan basit yöntemler B. FtsZ kullanılarak gösterilmektedir subtilis ve E. coli, en yaygın Gram + ve Gram-model organizmalar. Protokoller başka FtsZ proteine ​​uyarlanabilir. Bu yeni FtsZs, zaman ile ilgili olarak küçük değişiklikler, tampon veya inkübasyon sıcaklığı ile ön deneylere dayalı olarak bir optimum bir sonuç için gerekli olabilir. Burada açıklanan deneyler bu en uygun koşulları bulmakta yardımcı olmalıdır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTP Roche 10106399001 Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes Beckman Coulter 343776 Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315 Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap Beckman Coulter 357448 Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL Raytest Isotopenmessgeräte GmbH 15000001 Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000 Fujifilm Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer Spectronic Instruments Part 5
Fluorescence Cell Hellma Analytics 105-250-15-40 Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial Electron Microscopy Sciences G400-Cu Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV Philips Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate BIOplastics B70501 Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit BioAssay System POMG-25H Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer BioTek Part 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293 (2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369 (2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Król, E., Scheffers, D. J. FtsZ … More

Król, E., Scheffers, D. J. FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations. J. Vis. Exp. (81), e50844, doi:10.3791/50844 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter