Summary
Hier beschrijven we een procedure om virale complexen in vloeistof met nanometerresolutie in beeld te brengen met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.
Abstract
Onderzoekers gebruiken regelmatig Transmission Electron Microscopes (TEMs) om biologische entiteiten te onderzoeken en nieuwe materialen te beoordelen. Hier beschrijven we een extra toepassing voor deze instrumenten- het bekijken van virale assemblages in een vloeibare omgeving. Deze spannende en nieuwe methode voor het visualiseren van biologische structuren maakt gebruik van een recent ontwikkelde op microfluïdische basis gebaseerde monsterhouder. Ons videoartikel laat zien hoe u een microfluïdische houder kunt monteren en gebruiken om vloeibare monsters binnen een TEM in beeld te brengen. In het bijzonder gebruiken we simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DMP's) als ons modelsysteem. We beschrijven ook stappen om het oppervlak van de vloeistofkamer te coaten met affiniteitsbiofilms die DMP's aan het kijkvenster vastklappen. Dit stelt ons in staat om assemblages in beeld te brengen op een manier die geschikt is voor 3D-structuurbepaling. Zo presenteren we een eerste glimp van subvirale deeltjes in een inheemse vloeibare omgeving.
Introduction
Een gemeenschappelijk doel van biologen en ingenieurs is om de innerlijke werking van moleculaire machines te begrijpen. Transmissie elektronenmicroscopen (TEM's) zijn ideale instrumenten om deze ingewikkelde details te visualiseren bij bijna-atomaire resolutie1-2. Om het hoogvacuümsysteem van een TEM in stand te houden , zijn biologische monsters doorgaans ingebed in dunne films van glasachtig ijs3, suikers4, zware metaalzouten5, of een combinatie daarvan6. Als gevolg hiervan kunnen afbeeldingen van ingesloten exemplaren slechts beperkte momentopnamen van dynamische processen onthullen.
Vroege pogingen om biologische monsters gehydrateerd in vloeibare omgevingskamers te behouden, werden uitgevoerd door Parsons en collega's met behulp van differentiële pompfasen. Elektronendiffractiepatronen van niet-aangetaste catalasekristallen werden met succes geregistreerd tot een resolutie van 3 Å in een gehydrateerde toestand7-8. Bovendien kunnen fase-gescheiden lipidedomeinen worden onderzocht in gehydrateerde membranen van menselijke erytrocyten9-10. Beweging veroorzaakt door diffusievloeistof en zijn interferentie met de elektronenbundel resulteerde echter in ernstig resolutieverlies en verdere experimenten met biologische monsters werden tot voor kort niet geprobeerd.
Nieuw ontwikkelde microfluïdische monsterhouders zijn geïntroduceerd die halfgeleidermicrochips gebruiken om een microgeschaalde milieukamer te vormen. Deze apparaten kunnen monsters in vloeistof bewaren terwijl ze in eenTEM-kolom 11-12worden geplaatst. Deze technische doorbraak in TEM-beeldvorming heeft onderzoekers in staat gesteld om voor het eerst progressieve gebeurtenissen op moleculair niveau13te bekijken. We verwijzen naar deze nieuwe modaliteit als "in situ moleculaire microscopie" omdat experimenten nu "binnen" deEM-kolom 14-15kunnen worden uitgevoerd. Het algemene doel van deze methode is om biologische assemblages in vloeistof te beelderen om hun dynamische gedrag bij nanometerresolutie te observeren. De reden achter de ontwikkelde techniek is het registreren van real-time waarnemingen en het onderzoeken van nieuwe eigenschappen van biologische machines in oplossing. Deze methodologie breidt het gebruik van TEM's uit voor bredere doeleinden in de cellulaire en moleculaire biologie12-16.
In het huidige videoartikel presenteren we een uitgebreid protocol om een in de handel verkrijgde microfluïdische monsterhouder te assembleren en te gebruiken. Deze gespecialiseerde houders maken gebruik van siliciumnitride microchips geproduceerd met geïntegreerde afstandhouders om een vloeistofkamer te vormen die minuscule hoeveelheden oplossing omsluit. Dunne, transparante ramen zijn geëtst in de microchips voor beeldvormingsdoeleinden12. We demonstreren het juiste gebruik van een microfluïdische houder om simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DLL's) in vloeistof te onderzoeken met behulp van een TEM. Om ervoor te zorgen dat biologische assemblages, zoals DMP's, niet snel over grote afstanden diffuus worden tijdens de beeldvorming, gebruiken we de Affinity Capture-benadering om ze aan het oppervlak van de microfluïdische kamer te vast temaken 16. Deze moleculaire opnamestap heeft een groot voordeel ten opzichte van alternatieve technieken voor het weergeven van biologische monsters in vloeistof, omdat het de verwerving van beelden mogelijk maakt die zullen worden gebruikt voor downstream verwerkingsroutines. Deze opnamestap die wordt gebruikt in combinatie met microfluïdische beeldvorming is uniek voor onze procedures17. Lezers die structurele biologietoepassingen gebruiken met TEM of microfluïdische beeldvormingskamers kunnen het gebruik van affiniteitsopnametechnieken overwegen wanneer dynamische observaties op moleculair niveau het einddoel zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Affiniteitsopnameapparaten voorbereiden16
- Reinig de siliciumnitride E-chips door ze gedurende 2 minuten in 15 ml aceton te incuberen, gevolgd door 15 ml methanol gedurende 2 minuten (figuur 1A). Laat chips drogen onder laminaire luchtstroom.
- Incubeer de gedroogde chips op een verwarmde roerplaat (zonder roeren) gedurende 1,5 uur bij 150 °C en laat ze vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik.
- Gebruik Hamilton spuiten om lipidemengsels samen te stellen in kleine glazen buisjes om 25% chloroform, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocholine) in chloroform (1 mg/ml) en 20% Ni-NTA lipide (1,2-dioleoyl-iminodiazijnzuur-succinyl-nikkelzout) in chloroform (1 mg/ml) te bevatten voor een totaal volume van 4 mg/ml.
- Breng een 1 μl aliquot van het mengsel aan over elke druppel Milli-Q water van 15 μl op een stuk Parafilm in een vochtige petrischaal (figuur 1B). Incubeer monsters minstens 60 minuten op ijs.
2. Leg macromoleculen vast17
- Plaats een E-chip met een geïntegreerde afstandsstuk van 150 nm bovenop een monolaagmonster en incubeer gedurende 1 min (figuur 1C).
- Til de chip voorzichtig van het monster af en voeg een 3 μl aliquot his-tagged Protein A. Incubate toe gedurende 1 min bij kamertemperatuur (Figuur 1D).
- Vlek de overtollige druppel weg met Whatman #1 filterpapier en voeg onmiddellijk een 3 μl aliquot antilichaamoplossing toe. Incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de overtollige oplossing met een Hamilton-spuit en voeg onmiddellijk een 1 μl aliquot rotavirus DLPs (0,1 mg/ml) toe in bufferoplossing met 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 en 10 mM CaCl2. Incubeer minstens 2 minuten bij kamertemperatuur. De bereiding van DMP 's is eerder beschreven18.
3. Monteer de microfluïdische kamer en laad de in situ monsterhouder
- Plaats de natte E-chip met het virale monster in de punt van de microfluïdische monsterhouder. Gloei een tweede platte E-chip gedurende 1 minuut en laad vervolgens bovenop de spacerchip(afbeelding 2, panelen 1-5).
- Als alternatief, om het contrast van biologische macromoleculen te verhogen, kan zware metaalvlek(bijv. 0,2% uranylformaat) worden toegevoegd aan natte monsters voordat de tweede E-chip op het natte monster wordt geplaatst. De E-chip die het monster bevat, moet echter worden gewassen met Milli-Q-water voordat het contrastreagens wordt toegevoegd.
- Sandwich het geheel samen tot een afgedichte behuizing, mechanisch op zijn plaats gehouden in de houder door 3 messing schroeven(afbeelding 2,panelen 6-8).
- Na montage wordt de punt van de houder met behulp van een turbogepompt drooggemaal naar10 -6 Torr gepompt voordat de houder in de TEM wordt geplaatst.
4. Beeldvorming in vloeistof met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop
- Laad de in situ monsterhouder in een Transmission Electron Microscope (FEI Company) uitgerust met een LaB6 filament en werkt bij 120 kV.
- Schakel de TEM-gloeidraad in en stel de eucentrische hoogte van het microscoopstadium ten opzichte van het monster in door de wiebelfunctie te gebruiken om het monster van -15° naar +15° heen en weer in de kolom te kantelen. Deze procedure past het stadium in de z-richting aan om rekening te houden met de juiste dikte van de vloeistofkamer. Deze stap zorgt er ook voor dat een nauwkeurige vergroting wordt gebruikt bij het opnemen van afbeeldingen.
- Neem eerst afbeeldingen op langs de randen en in de hoekgebieden van de microfluïdische kamer. Deze gebieden bevatten meestal de dunste oplossing. Neem beelden op van specimens onder lage dosisomstandigheden (1-3 elektronen/Å2) met behulp van een CCD-camera. Gebruik nominale vergrotingen van 6.000X - 30.000X.
- Bepaal de juiste defocuswaarde door scherp te stellen aan de rand van de vloeistofkamer. Gebruik een waarde van -1,5 μm om afbeeldingen op te nemen met een vergroting van 30.000 x. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen of als er geen contrastmiddel wordt gebruikt in het monsterpreparaat, gebruik dan hogere defocuswaarden in het bereik van -2 tot -4 μm.
- Om ervoor te zorgen dat de oplossing zich tijdens de experimenten in de microfluïdische kamer bevindt, richt u de elektronenbundel totdat de bellen in de vloeistof in het apparaat worden gevormd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve afbeeldingen van DMP's in vloeistof met behulp van E-chips die gloeien (figuur 3A) tonen minder DMP's in een bepaald kijkgebied, vermoedelijk als gevolg van diffusie, in vergelijking met DMP's die zijn verrijkt op Affinity Capture-apparaten (Figuur 3B). De toevoeging van uranyl formate in de beeldvormingskamer verbetert het contrast van het monster en daarmee de zichtbaarheid van individuele DLL's in oplossing(figuur 3C, bovenpaneel). Een beter contrast maakt downstream beeldverwerking mogelijk , zoals middeling van deeltjes(figuur 3C, onderste paneel) en 3D-reconstructieroutines (figuur 3C, inzet) zoals eerder beschreven17. Kortom, voor de 3D-reconstructie selecteerden we 600 deeltjes DMP's met behulp van het SPIDER-softwarepakket19. Geselecteerde deeltjes werden verfijnd tegen een eerste model van het rotavirus DLP20 dat werd gefilterd tot een resolutie van 80 Å. We gebruikten het RELION-softwarepakket21 om een 3D-reconstructie te berekenen met een resolutie van ongeveer 25 Å. Onze 3D-kaart in goede overeenstemming met het oorspronkelijke model en met een onafhankelijke cryo-EM-reconstructie die werd berekend met behulp van dezelfde parameters en DLP-monster17.
Figuur 1. Het voorbereiden van siliciumnitride microchips voor vloeibare beeldvorming. A) Siliciumnitride microchips worden gereinigd door 2 minuten onder te dompelen in aceton gevolgd door 2 minuten in methanol om restfotoresist te verwijderen die bij het fabricageproces wordt gebruikt. B) Lipide monolaagmonsters worden bereid op druppels Milli-Q-water die in een vochtige petrischaal aan Parafilm worden toegevoegd17. C) Gereinigde microchips worden bovenop de monolagen geplaatst en na een incubatiestap van 1 minuut verwijderd. D) Moleculaire adapters (d.w.z. eiwit A en antilichamen in oplossing) worden rechtstreeks aan de monolaag gecoate chips toegevoegd en de overtollige oplossing wordt verwijderd voordat DMP's worden toegevoegd. De natte monsterchip wordt vervolgens in de microfluïdische houder geladen.
Figuur 2. Montage van de vloeistofkamer van een microfluïdische monsterhouder. De punt van de monsterkamer wordt gemonteerd door O-ringfittingen aan de lege punt toe te voegen (stap 1-2). De natte monsterchip met geïntegreerde afstandhouders wordt voorzichtig in de bewerkte fittingen in de punt van de houder geplaatst (stap 3-4). Er wordt een gloeigeloosde platte chip over de monsterchip geplaatst (stap 5). De montage wordt vervolgens afgedekt met een metalen vlakplaat (stap 6) die op zijn plaats wordt gehouden door 3 messing schroeven (stap 7-8).
Figuur 3. Representatieve resultaten voor DMP's in vloeistof. A) Gloei-ontladen microchips binden zeer weinig DMP's in oplossing in vergelijking met affiniteit-verfraaide microchips (B). Schaalbalken, 2 μm. C) Representatief beeld (bovenpaneel) en 3D-reconstructie (inzet) van DLL's in vloeistof die contrastreagens bevat. Schaalbalk, 150 nm. De diameter van de reconstructie is 80 nm. Klassegemiddelden van de DMP's in vloeistof (onderste paneel) onthullen mooi gedefinieerde kenmerken langs hun buitenoppervlak. Individuele panelen zijn 110 nm.
Figuur 4. Representatieve resultaten voor bellenvorming in vloeibare monsters in de TEM. Afbeeldingen van bellen gevormd in vloeibare specimens bij de continue blootstelling van de elektronenbundel bij 5 elektronen/Å2 gedurende ongeveer 2 min (A) en 5 min (B). Schaalbalk is 100 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In ons gepresenteerde werk gebruikten we de affiniteitsregistratiebenadering om tether rotavirus DLL's tetheren naar een microfluïdisch platform. Dit maakte in situ beeldvorming van macromoleculaire complexen in een vloeibare micro-omgeving mogelijk. De vangstbenadering is belangrijk met betrekking tot andere microfluïdische beeldvormingstechnieken omdat het biologische exemplaren lokaliseert naar het beeldvormingsvenster om grote diffusieve problemen te ontkrachten die zich voordoen tijdens het opnemen van beelden in vloeistof. Een van de meest kritieke stappen in ons protocol omvat echter de overdracht van de lipidebiofilm naar het microchipoppervlak. Als de lipidemonolaag zich niet gelijkmatig over het raster verspreidt, zal dit resulteren in een gebrekkig experiment. Een indicatie van een slechte overdrachtsstap is dat weinig tot geen virale assemblages gebonden zullen zijn aan de vloeibare chip. Een beperking in de overdrachtsstap is thermische stabiliteit met betrekking tot de vloeibaarheid van de lipidelaag. Als de overdrachtsstap ontoereikend is, zoals beoordeeld door ongelijke verspreiding van de druppel, moeten de lipidelagen langer op ijs of in een trillingsvrije koude kamer incuberen. Ook moet de Petrischaal voldoende worden afgesloten met Parafilm om de juiste luchtvochtigheid te behouden.
Een overmaat aan virale complexen of adaptereiwitten in de microchipmonsters kan leiden tot overmatige clustering van de deeltjes. Dit is een beperking in het protocol die eenvoudig kan worden beheerd. Om het clustering-effect te minimaliseren, kunnen de eiwitfactoren voor een kortere periode worden geïncubeerd of moet het virusmonster verder worden verdund. Als een teveel aan niet-specifieke eiwitten wordt gedetecteerd, kan de opname van vers bereide imidazol (ongeveer 50 mM) in de bufferoplossing de achtergrond verminderen. Het gebruik van verse imidazol is een cruciale stap in het protocol. Overbelast de chips ook niet met gezuiverde eiwitten, omdat dit geen specifieke binding garandeert en zal resulteren in een gebrekkig experiment. Afbeeldingen bevatten een overmaat aan achtergrondeiwitten en zijn niet geschikt voor downstreamverwerkingsroutines. Een optimaal concentratiebereik voor gezuiverde eiwitten is ongeveer 0,01-0,1 mg/ml. Als dit bereik echter niet het verwachte deeltjesniveau biedt, moet de concentratie van het monster worden verhoogd totdat een optimaal niveau is bereikt. Een verrijking van virale deeltjes moet plaatsvinden met betrekking tot negatieve controlemonsters zonder moleculaire adapters, zoals antilichamen. Kleine hoeveelheden aspecifieke binding in uw negatieve controle kunnen zelden voorkomen, maar de affiniteits-versierde microchips moeten altijd dienen om de virale deeltjes te verrijken. In het geval van rotavirus is er momenteel geen omgekeerd genetisch systeem om zijn tags in capsid-eiwitten te introduceren als een middel om virale complexen direct op ni-NTA-versierde oppervlakken vast te leggen. Zijn gelabelde ribosomen zijn echter met succes gerekruteerd uit bacteriële lysaten op Ni-NTA versierde E-chips voor vloeibare beeldvormingsexperimenten16. Aldus het verstrekken van bewijsmateriaal, zij het beperkt op dit punt, voor inheemse biologische interacties om in vloeibare cellen terwijl in een kolom TEM voor te komen.
Het gebruik van detergentia, glycerol en hoge niveaus van sacharose moet worden vermeden voor beeldvorming in situ. Het gebruik van deze reagentia zal artefacten in EM-afbeeldingen creëren die overmatige borrelende en gedempte functies in deeltjes bevatten, wat resulteert in afbeeldingen van slechte kwaliteit. Als deze reagentia worden gebruikt in viruspreparaten, kan het monster worden gedialyseerd in bufferoplossing zonder deze componenten. Affinity Capture-apparaten zijn gedurende een korte periode bestand tegen een bepaalde mate van reinigingsmiddelen, hoewel dit van geval tot geval moet worden bepaald. Raadpleeg de eerder beschreven lijst van compatibele reagentia22.
Om downstream beeldverwerkingsroutines mogelijk te maken, kan een lage concentratie contrastreagens aan de microfluïdische kamer worden toegevoegd. Dit reagens fixeert geen eiwitmonsters, zoals traditionele kleuringsprocedures17. Om ervoor te zorgen dat er tijdens de experimenten vloeistof in de beeldkamer aanwezig is, richt u de elektronenbundel totdat er bellenvorming optreedt (figuur 4). Dit is een eenvoudige maatregel om aan te geven dat de exemplaren gehydrateerd blijven. Vloeibare specimens ondervinden ernstige schade binnen 2 minuten (figuur 4A) na continue ontmaskering van de elektronenbundel bij 5 elektronen/Å2. Langdurige continue blootstelling aan elektronenstralen gedurende 5 minuten(figuur 4B)en daarna bij deze dosering zal resulteren in overmatige bellenvorming in het beeldvormingsgebied.
In situ moleculaire microscopie gebruikt in combinatie met Affinity Capture apparaten maakt het mogelijk om biologische complexen in oplossing te onderzoeken met behulp van transmissie elektronenmicroscopie. Deze technische vooruitgang wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van nieuw ontwikkelde microfluïdische monsterhouders. Dergelijke apparaten maken gebruik van dunne siliciumnitride membranen om een micro-geschaalde beeldvormingskamer te vormen. Voortbouwend op het pionierswerk van Parsons en collega's7-10 bieden we een nuttige strategie om individuele virale assemblages in een oplossing te weergeven. Het hier beschreven protocol legt methodologieën uit die compatibel zijn met beeldverwerkingsroutines met één deeltje en 3D-reconstructieberekeningen. Toekomstige toepassingen die zullen voortvloeien uit het beheersen van deze technieken kunnen live-EM-beeldvorming van macromoleculen omvatten. We verwachten dat beeldvorming in situ stappen kan onthullen voor virale assemblage, transcriptieregulatie of invasie van gastheercellen. Kortom, het gebruik van deze protocollen moet onderzoekers in staat stellen om dynamische processen in oplossing op een geheel nieuwe manier te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur, Madeline J. Dukes, is een werknemer van Protochips, Inc.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Dr. Michael J. Friedlander, directeur van het Virginia Tech Carilion Research Institute voor het aanmoedigen van onze onderzoeksinspanningen. Dit project werd ondersteund door ontwikkelingsfondsen aan S.M.M en D.F.K. en gedeeltelijk door het Nano-Bio initiatief van het Institute for Critical Technology and Applied Science van Virginia Tech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C.
- Dubochet, J., et al.
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R.
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
