Summary
Nous décrivons ici une procédure pour imager des complexes viraux dans un liquide à une résolution nanométrique à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
Abstract
Les chercheurs utilisent régulièrement des microscopes électroniques à transmission (TEMs) pour examiner des entités biologiques et évaluer de nouveaux matériaux. Ici, nous décrivons une application supplémentaire pour ces instruments: la visualisation d’assemblages viraux dans un environnement liquide. Cette méthode passionnante et nouvelle de visualisation des structures biologiques utilise un porte-spécimen à base de microfluidique récemment développé. Notre article vidéo montre comment assembler et utiliser un support microfluidique pour imager des spécimens liquides dans un TEM. En particulier, nous utilisons des particules à double couche (DLP) du rotavirus simien comme système modèle. Nous décrivons également les étapes pour recouvrir la surface de la chambre liquide de biofilms d’affinité qui attachent les DLP à la fenêtre de visualisation. Cela nous permet d’imager les assemblages d’une manière adaptée à la détermination de la structure 3D. Ainsi, nous présentons un premier aperçu des particules subvirales dans un environnement liquide natif.
Introduction
Un objectif commun des biologistes et des ingénieurs est de comprendre le fonctionnement interne des machines moléculaires. Les microscopes électroniques à transmission (TEMs) sont des instruments idéaux pour visualiser ces détails complexes à une résolution quasi atomique1-2. Afin de soutenir le système à vide poussé d’un TEM, les échantillons biologiques sont typiquement encastrés dans des films minces de glace vitreuse3,de sucres4,de sels de métaux lourds5,ou d’une combinaison de ceux-ci6. Par conséquent, les images d’échantillons incorporés peuvent ne révéler que des instantanés limités de processus dynamiques.
Des tentatives précoces pour maintenir les spécimens biologiques hydratés dans des chambres liquides environnementales ont été entreprises par Parsons et collègues utilisant des étapes de pompage différentielles. Des modèles de diffraction d’électrons de cristaux de catalase non souillés ont été enregistrés avec succès à une résolution de 3 Å dans un état hydraté7-8. En outre, des domaines lipidiques séparés en phase ont pu être examinés dans des membranes hydratées d’érythrocytes humains9-10. Cependant, le mouvement causé par la diffusion du liquide et son interférence avec le faisceau d’électrons, a entraîné une perte de résolution grave et d’autres expériences utilisant des échantillons biologiques n’ont pas été tentées jusqu’à récemment.
De nouveaux supports d’échantillons microfluidiques ont été introduits qui utilisent des micropuces semi-conductrices pour former une chambre environnementale micro-échelle. Ces dispositifs peuvent maintenir les échantillons dans un liquide pendant qu’ils sont positionnés dans une colonne TEM11-12. Cette percée technique dans l’imagerie TEM a permis aux chercheurs de visualiser, pour la première fois, des événements progressifs au niveau moléculaire13. Nous appelons cette nouvelle modalité « microscopie moléculairein situ » car les expériences peuvent maintenant être effectuées « à l’intérieur » de la colonne EM14-15. L’objectif global de cette méthode est d’imager les assemblages biologiques dans un liquide afin d’observer leurs comportements dynamiques à une résolution nanométrique. La raison d’être de la technique mise au point est d’enregistrer les observations en temps réel et d’examiner les nouvelles propriétés des machines biologiques en solution. Cette méthodologie élargit l’utilisation des TEMs à des fins plus larges en biologie cellulaire et moléculaire12-16.
Dans l’article vidéo actuel, nous présentons un protocole complet pour assembler et utiliser un support d’échantillon microfluidique disponible dans le commerce. Ces supports spécialisés utilisent des micropuces de nitrure de silicium produites avec des entretoises intégrées pour former une chambre liquide qui renferme des volumes infimes de solution. Des fenêtres minces et transparentes sont gravées dans les micropuces à des fins d’imagerie12. Nous démontrons l’utilisation appropriée d’un support microfluidique pour examiner les particules à double couche (DLPs) du rotavirus simien dans un liquide à l’aide d’une TEM. Pour s’assurer que les assemblages biologiques, tels que les DLP, ne diffusent pas rapidement sur de grandes distances lors de l’imagerie, nous utilisons l’approche Affinity Capture pour les attacher à la surface de la chambre microfluidique16. Cette étape de capture moléculaire présente un avantage majeur par rapport aux techniques alternatives d’imagerie des échantillons biologiques dans un liquide, car elle permet l’acquisition d’images qui seront utilisées pour les routines de traitement en aval. Cette étape de capture utilisée en conjonction avec l’imagerie microfluidique est unique à nos procédures17. Les lecteurs qui utilisent des applications de biologie structurale à l’aide de la TEM ou de chambres d’imagerie microfluidiques peuvent envisager l’utilisation de techniques de capture d’affinité lorsque les observations dynamiques au niveau moléculaire sont l’objectif final.
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Protocol
1. Préparer les périphériques de capture d’affinité16
- Nettoyer les E-puces de nitrure de silicium en les incubant dans 15 ml d’acétone pendant 2 min suivi de 15 ml de méthanol pendant 2 min(figure 1A). Laissez les copeaux sécher sous un flux d’air laminaire.
- Incuber les copeaux séchés sur une plaque d’agitation chauffée (sans agitation) pendant 1,5 heure à 150 °C, puis les laisser refroidir à température ambiante avant utilisation.
- Utilisez des seringues Hamilton pour composer des mélanges de lipides dans de petits tubes de verre afin de contenir 25 % de chloroforme, 55 % de DLPC (1,2-dilauroyl-phosphocholine) dans le chloroforme (1 mg/ml) et 20 % de lipides Ni-NTA (sel d’acide 1,2-dioleoyl-iminodiacétique-succinyl-nickel) dans le chloroforme (1 mg/ml) pour un volume total de 40 μl.
- Appliquer une partie aliquote de 1 μl du mélange sur chaque goutte de Milli-Q de 15 μl sur un morceau de Parafilm dans une boîte de Petri humide(figure 1B). Incuber des échantillons sur de la glace pendant au moins 60 min.
2. Capturer des macromolécules17
- Placer une puce électronique avec une entretoise intégrée de 150 nm sur un échantillon monocouche et incuber pendant 1 min(Figure 1C).
- Soulevez délicatement la puce de l’échantillon et ajoutez une aliquote de 3 μl de la protéine A marquée par His. Incuber pendant 1 min à température ambiante(figure 1D).
- Épongez l’excès de goutte à l’aide de Whatman #1 papier filtre et ajoutez immédiatement une aliquote de 3 μl de solution d’anticorps. Incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Retirer l’excès de solution à l’aide d’une seringue Hamilton et ajouter immédiatement une partie aliquote de 1 μl de DLPs rotavirus (0,1 mg/ml) dans une solution tampon contenant 50 mM hepes (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 et 10 mM CaCl2. Incuber pendant au moins 2 min à température ambiante. La préparation des DLP a été décrite précédemment18.
3. Assemblez la chambre microfluidique et chargez le porte-échantillon in situ
- Chargez la puce électronique humide contenant l’échantillon viral dans la pointe du porte-échantillon microfluidique. Décharger une seconde puce E plate pendant 1 min puis chargée sur le dessus de la puce d’entretoise(Figure 2, panneaux 1-5).
- Alternativement, pour augmenter le contraste des macromolécules biologiques, une tache de métaux lourds(par exemple 0,2% d’uranyl formate) peut être ajoutée aux échantillons humides avant de placer la deuxième puce électronique sur l’échantillon humide. Cependant, la puce électronique contenant l’échantillon devra être lavée avec de l’eau Milli-Q avant d’ajouter le réactif de contraste.
- Sandwich l’ensemble de l’ensemble ensemble pour former une enceinte scellée, maintenue en place mécaniquement à l’intérieur du support par 3 vis en laiton(Figure 2,panneaux 6-8).
- Après assemblage, la pointe du support est pompée à 10-6 Torr à l’aide d’une station de pompage à sec turbo-pompée avant de placer le support à l’intérieur du TEM.
4. Imagerie dans un liquide à l’aide d’un microscope électronique à transmission
- Chargez le porte-échantillon in situ dans un microscope électronique à transmission (FEI Company) équipé d’un filament LaB6 et fonctionnant à 120 kV.
- Allumez le filament TEM et ajustez la hauteur eucentrique de l’étage du microscope par rapport à l’échantillon en utilisant la fonction wobbler pour incliner l’échantillon de -15° à +15° d’avant en arrière dans la colonne. Cette procédure ajuste l’étage dans la direction z pour aider à tenir compte de l’épaisseur appropriée de la chambre à liquide. Cette étape garantit également qu’un grossissement précis est utilisé lors de l’enregistrement d’images.
- Enregistrez d’abord les images le long des bords et dans les régions d’angle de la chambre microfluidique. Ces zones contiennent généralement la solution la plus fine. Enregistrer des images d’échantillons dans des conditions de faible dose (1-3 électrons/Å2)à l’aide d’une caméra CCD. Utilisez des grossissements nominaux de 6 000X à 30 000X.
- Déterminez la valeur de défocalisation appropriée en vous concentrant sur le bord de la chambre fluidique. Utilisez une valeur de -1,5 μm pour enregistrer des images à un grossissement de 30 000X. Si une solution épaisse est rencontrée ou si l’agent de contraste n’est pas utilisé dans la préparation de l’échantillon, utilisez des valeurs de défocalisation plus élevées dans la plage de -2 à -4 μm.
- Pour s’assurer que la solution est contenue dans la chambre microfluidique tout au long des expériences, concentrez le faisceau d’électrons jusqu’à ce que les bulles se forment dans le liquide à l’intérieur de l’appareil.
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Representative Results
Des images représentatives de DLP dans un liquide à l’aide de puces électroniques qui ont été déchargées par lueur(figure 3A)montrent moins de DLP dans une zone de visualisation donnée, probablement en raison de la diffusion, par rapport aux DLP qui sont enrichis sur des dispositifs de capture d’affinité(Figure 3B). L’ajout de formate d’uranyle dans la chambre d’imagerie améliore le contraste de l’échantillon et donc la visibilité des DLP individuels en solution(figure 3C,panneau supérieur). Un meilleur contraste permet un traitement d’image en aval tel que la moyenne des particules(Figure 3C,panneau inférieur) et des routines de reconstruction 3D(Figure 3C,encart) comme décrit précédemment17. En bref, pour la reconstruction 3D, nous avons sélectionné 600 particules de DLP à l’aide du progiciel SPIDER19. Les particules sélectionnées ont été affinées par rapport à un modèle initial du rotavirus DLP20 qui a été filtré à une résolution de 80 Å. Nous avons utilisé le progiciel RELION21 pour calculer une reconstruction 3D à une résolution d’environ 25 Å. Notre carte 3D en bon accord avec le modèle initial et avec une reconstruction cryo-EM indépendante qui a été calculée en utilisant les mêmes paramètres et l’échantillon DLP17.
Figure 1. Préparation de micropuces de nitrure de silicium pour l’imagerie liquide. A)Les micropuces de nitrure de silicium sont nettoyées par immersion pendant 2 min dans de l’acétone suivie de 2 min dans du méthanol pour éliminer la photorésine résiduelle utilisée dans le processus de fabrication. B)Les échantillons de monocouche lipidique sont préparés sur des gouttes d’eau Milli-Q ajoutées au Parafilm dans une boîte de Petri humide17. C) Les micropuces nettoyées sont placées sur le dessus des monocouches et retirées après une étape d’incubation de 1 min. D) Les adaptateurs moléculaires(c’est-à-dire la protéine A et les anticorps en solution) sont ajoutés directement aux puces revêtues de monocouches et l’excès de solution est éliminé avant l’ajout de DLP. La puce d’échantillon humide est ensuite chargée dans le support microfluidique.
Figure 2. Assemblage de la chambre liquide d’un porte-échantillon microfluidique. La pointe de la chambre d’éprouvette est assemblée en ajoutant des raccords toriques à la pointe vide (étapes 1 à 2). La puce d’échantillon humide contenant des entretoises intégrées est délicatement placée dans les raccords usinés à l’intérieur de la pointe du support (étapes 3-4). Une puce plate à décharge luminescente est placée au-dessus de la puce de l’échantillon (étape 5). L’ensemble est ensuite recouvert d’une plaque frontale métallique(étape 6)qui est maintenue en place par 3 vis en laiton (étapes 7-8).
Figure 3. Résultats représentatifs pour les DLP dans un liquide. A)Les micropuces à décharge luminescente lient très peu de DLP en solution par rapport aux micropuces décorées par affinité(B). Barres d’échelle, 2 μm. C)Image représentative (panneau supérieur) et reconstruction 3D (encart) de DLP dans un liquide contenant un réactif de contraste. Barre d’échelle, 150 nm. Le diamètre de la reconstruction est de 80 nm. Les moyennes de classe des DLP dans le liquide (panneau inférieur) révèlent des caractéristiques bien définies le long de leur surface extérieure. Les panneaux individuels sont de 110 nm.
Figure 4. Résultats représentatifs pour la formation de bulles dans les échantillons liquides du TEM. Images de bulles formées dans des échantillons liquides lors de l’exposition continue du faisceau d’électrons à 5électrons/Å 2 pendant environ 2 min(A)et 5 min(B). La barre d’échelle est de 100 nm.
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Discussion
Dans notre travail présenté, nous avons employé l’approche de capture d’affinité pour attacher le rotavirus DLPs à une plate-forme microfluidique. Cela a permis l’imagerie in situ de complexes macromoléculaires dans un microenvironnement liquide. L’approche de capture est importante en ce qui concerne d’autres techniques d’imagerie microfluidique, car elle localise les échantillons biologiques dans la fenêtre d’imagerie pour annuler les grands problèmes diffusifs qui surviennent lors de l’enregistrement d’images dans un liquide. Cependant, l’une des étapes les plus critiques de notre protocole implique le transfert du biofilm lipidique à la surface de la micropuce. Si la monocouche lipidique ne parvient pas à se répartir uniformément sur la grille, il en résultera une expérience imparfaite. Une indication d’une mauvaise étape de transfert est que peu ou pas d’assemblages viraux seront liés à la puce fluidique. Une limitation de l’étape de transfert est la stabilité thermique en ce qui concerne la fluidité de la couche lipidique. Si l’étape de transfert est inadéquate, telle qu’évaluée par une répartition inégale de la goutte, les couches lipidiques devraient incuber sur la glace plus longtemps ou dans une chambre froide sans vibrations. En outre, la boîte de Pétri doit être scellée adéquatement avec Parafilm pour maintenir l’humidité appropriée.
Un excès de complexes viraux ou de protéines adaptatrices dans les échantillons de micropuces peut entraîner un regroupement excessif des particules. Il s’agit d’une limitation du protocole qui peut facilement être gérée. Pour minimiser l’effet de regroupement, les facteurs protéiques peuvent être incubés pendant une période plus courte ou l’échantillon de virus doit être dilué davantage. Si un excès de protéines non spécifiques est détecté, l’inclusion d’imidazole fraîchement préparé (environ 50 mM) dans la solution tampon peut diminuer le fond. L’utilisation d’imidazole frais est une étape cruciale dans le protocole. De même, ne surchargez pas les puces avec des protéines purifiées car cela n’assurera pas de liaison spécifique et entraînera une expérience défectueuse. Les images contiendront un excès de protéines de fond et ne conveniront pas aux routines de traitement en aval. Une plage de concentration optimale pour les protéines purifiées est d’environ 0,01-0,1 mg/ml. Toutefois, si cette plage ne fournit pas le niveau prévu de particules, la concentration de l’échantillon doit être augmentée jusqu’à ce qu’un niveau optimal ait été atteint. Un enrichissement des particules virales devrait se produire en ce qui concerne les échantillons témoins négatifs qui n’ont pas d’adaptateurs moléculaires, tels que les anticorps. De petites quantités de liaison non spécifique dans votre contrôle négatif peuvent rarement se produire, cependant, les micropuces décorées d’affinité devraient toujours servir à enrichir les particules virales. Dans le cas du rotavirus, il n’existe actuellement aucun système génétique inverse pour introduire ses étiquettes dans les protéines de la capside comme moyen de capturer directement les complexes viraux sur les surfaces décorées de Ni-NTA. Ses ribosomes marqués, cependant, ont été recrutés avec succès à partir de lysats bactériens sur des puces électroniques décorées ni-NTA pour des expériences d’imagerie liquide16. Fournissant ainsi des preuves, bien que limitées à ce stade, que des interactions biologiques natives se produisent dans les cellules liquides alors qu’elles se trouvent dans une colonne TEM.
L’utilisation de détergents, de glycérol et de niveaux élevés de saccharose doit être évitée pour l’imagerie in situ. L’utilisation de ces réactifs créera des artefacts dans les images EM qui incluent des caractéristiques de propagation excessives et en sourdine dans les particules, ce qui entraîne des images de mauvaise qualité. Si ces réactifs sont utilisés dans des préparations virales, l’échantillon peut être dialysé en solution tampon dépourvue de ces composants. Les dispositifs affinity capture peuvent résister à un certain degré de détergents pendant une courte période de temps, bien que cela doive être déterminé au cas par cas. Veuillez vous référer à la liste des réactifs compatibles précédemment décrite22.
Pour permettre des routines de traitement d’image en aval, une faible concentration de réactif de contraste peut être ajoutée à la chambre microfluidique. Ce réactif ne fixe pas les échantillons de protéines, comme les procédures de coloration traditionnelles17. Pour s’assurer que le liquide est présent dans la chambre d’imagerie tout au long du temps des expériences, concentrez le faisceau d’électrons jusqu’à ce que la formation de bulles se produise (Figure 4). Il s’agit d’une mesure simple pour indiquer que les spécimens restent hydratés. Les échantillons liquides rencontrent de graves dommages dans les 2 minutes(figure 4A)de l’exposition continue du faisceau d’électrons à 5 électrons/Å2. Une exposition prolongée par faisceau d’électrons continu pendant 5 min(figure 4B)et au-delà à cette dose entraînera une formation excessive de bulles dans la zone d’imagerie.
La microscopie moléculaire in situ utilisée en combinaison avec des dispositifs affinity capture permet l’examen de complexes biologiques en solution à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Ces progrès techniques sont rendus possibles par l’utilisation de nouveaux détenteurs d’échantillons microfluidiques. De tels dispositifs utilisent de fines membranes de nitrure de silicium pour former une chambre d’imagerie à micro-échelle. En nous appuyant sur le travail pionnier de Parsons et de ses collègues7-10, nous fournissons une stratégie utile pour imager les assemblages viraux individuels en solution. Le protocole décrit ici explique les méthodologies compatibles avec les routines de traitement d’image à particule unique et les calculs de reconstruction 3D. Les applications futures qui résulteront de la maîtrise de ces techniques pourraient inclure l’imagerie em en direct des macromolécules. Nous prévoyons que l’imagerie in situ peut révéler des étapes pour l’assemblage viral, la régulation de la transcription ou l’invasion de la cellule hôte. En résumé, l’utilisation de ces protocoles devrait permettre aux chercheurs d’étudier les processus dynamiques en solution d’une manière complètement nouvelle.
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Disclosures
L’auteur, Madeline J. Dukes, est une employée de Protochips, Inc.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Michael J. Friedlander, directeur du Virginia Tech Carilion Research Institute, d’avoir encouragé nos efforts de recherche. Ce projet a été soutenu par des fonds de développement de S.M.M et D.F.K. et en partie par l’initiative Nano-Bio de l’Institute for Critical Technology and Applied Science de Virginia Tech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
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