Summary
ここでは、透過型電子顕微鏡を用いて、ナノメートル分解能でウイルス複合体を画像化する手順について説明する。
Abstract
研究者は定期的に透過電子顕微鏡(TEM)を使用して生物学的実体を調べ、新しい材料を評価します。ここでは、液体環境でのウイルスアセンブリの表示- これらの機器のための追加のアプリケーションを説明します。この新しい生物学的構造の可視化手法は、最近開発されたマイクロ流体ベースの検体ホルダーを利用しています。ビデオ記事では、TEM内の液体標本を画像化するためにマイクロ流体ホルダーを組み立てて使用する方法を示しています。特に、モデルシステムとしては、シミアンロタウイルスの二重層粒子(DMP)を用います。また、DDLPsを視受窓につなげたアフィニティバイオフィルムで液体チャンバーの表面をコーティングする手順についても説明する。これにより、3D構造の決定に適した方法でアセンブリをイメージすることができます。このように、我々は、天然の液体環境における亜ウイルス粒子の最初の一見を提示する。
Introduction
生物学者や技術者の共通の目標は、分子機械の内部の仕組みを理解することです。透過型電子顕微鏡(TEM)は、原子に近い分解能1~2でこれらの複雑な細部を可視化するのに理想的な装置です。TEMの高真空システムを維持するために、生体試料は、典型的には、ビトレウス氷3の薄膜に埋め込まれ、糖4、重金属塩5、またはそれらの組み合わせ6が挙げられる。その結果、埋め込み標本の画像は、動的プロセスの限られたスナップショットのみを明らかにすることができる。
環境液体室で水和した生物学的標本を維持する初期の試みは、パーソンズと同僚が差動ポンプステージを使用して行った。未染色カタラーゼ結晶の電子回折パターンは、水和状態で3Åの分解能に記録された7-8.さらに、相分離脂質ドメインは、ヒト赤血球9〜10の水和膜で調べることができた。しかし、液体の拡散や電子線との干渉による運動は、重度の分解能損失をもたらし、生物学的標本を用いたさらなる実験は最近まで試みられなかった。
半導体マイクロチップを利用してマイクロスケール環境室を形成する新開発のマイクロ流体試料ホルダーが導入されました。これらのデバイスは、TEM 列11 から 12に配置されている間、サンプルを液体に保持できます。TEMイメージングにおけるこの技術的ブレークスルーにより、研究者は分子レベル13で初めて進行性のイベントを見ることを可能にしました。この新しいモダリティを「その時点での 分子顕微鏡」と呼び、EMカラム14-15の「内部」で実験を行うことができるようになりました。この方法の全体的な目的は、ナノメートル解像度でのそれらの動的挙動を観察するために液体中の生物学的アセンブリを画像化することです。開発された技術の背後にある根拠は、リアルタイムの観測を記録し、溶液中の生物学的機械の新しい特性を調べることです。この方法論は、細胞生物学および分子生物学におけるより広範な目的のためのTEMの使用を拡大する 12-16.
現在のビデオ記事では、市販のマイクロ流体標本ホルダーを組み立て、使用するための包括的なプロトコルを紹介しています。これらの専門のホルダーは、溶液の微細なボリュームを囲む液体チャンバーを形成するために、統合されたスペーサーで製造されたシリコン窒化マイクロチップを利用します。薄く透明な窓は、撮像目的のためにマイクロチップにエッチングされる12。TEMを用いて、マイクロ流体ホルダーを用いて、液体中のシミアンロタウイルス二重層粒子(DRP)を調べるのが適切な方法を示す。DMPなどの生物学的アセンブリがイメージング中に遠距離で急速に拡散しないようにするために、我々は、それらをマイクロ流体室16の表面にテザーするためにアフィニティキャプチャアプローチを採用する。この分子捕獲ステップは下流の処理ルーチンに使用されるイメージの獲得を可能にするので液体の生物学的標本をイメージするための 代替技術より大きな利点 がある。マイクロ流体イメージングと組み合わせて使用されるこのキャプチャステップは、当社の手順17に固有です。TEMまたはマイクロ流体イメージングチャンバを使用して構造生物学アプリケーションを採用している読者は、分子レベルでの動的観測が最終目標である場合、アフィニティーキャプチャ技術の使用を検討することができます。
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Protocol
1. アフィニティ キャプチャ デバイスの準備16
- 窒化ケイ素Eチップを15mlのアセトンで2分間インキュベートし、2分間15mlのメタノールを2分間洗浄します(図1A)。薄層の空気流の下でチップを乾燥させます。
- 乾燥したチップを加熱した攪拌板に150°Cで1.5時間インキュベートし、使用前に室温まで冷却します。
- ハミルトン注射器を使用して、小さなガラス管の脂質混合物を構成して25%クロロホルムを含み、 55%DLPC(1,2-ジロイル・ホスホコリン)クロロホルム(1mg/ml)および20%Ni-NTA脂質(1,2-ジオレオロイルイミノ酢酸-サクシニルニッケル塩)をクロロホルム(1mg/ml)で合計体積40μlとした。
- 湿度の高いペトリ皿のパラフィルムに、15μlのミリ-Q水の各15μl滴の混合物のアリコートを適用する(図1B)。氷上でサンプルを少なくとも60分間インキュベートします。
2. 高分子の捕獲17
- 150 nm の統合スペーサを備えた E チップを単層サンプルの上に置き、1 分間インキュベートします (図 1C)。
- サンプルからチップをそっと持ち上げ、His タグ付きプロテインA.インキュベートの3 μl アリコートを室温で 1 分間インキュベートします (図 1D)。
- Whatman#1ろ紙を使用して余分な滴を消し去り、すぐに抗体溶液の3μlアリコートを加えます。室温で1分間インキュベートします。
- ハミルトンシリンジを使用して余分な溶液を除去し、50 mM HEPES(pH 7.5)、150 mM NaCl、10 mM MgCl2および10 mM CaCl2を含む緩衝溶液に1μlのロタウイルスDLP(0.1mg/ml)のアリコートをすぐに加える。室温で少なくとも2分間インキュベートする。DMP の準備については、前に18を説明しました。
3. マイクロ流体室を組み立て、イン ・ザ・イン ・シーク・フィエサー
- ウイルスサンプルを含むウェットEチップをマイクロ流体試料ホルダーの先端にロードします。2番目のフラットEチップを1分間グロー放電し、スペーサーチップの上に積み込みます(図2、 パネル1-5)。
- あるいは、生体高分子のコントラストを高めるために、重金属染色(例えば0.2%ウラニルシフィジ)を、湿った試料に第2のEチップを置く前に湿った標本に加えることができる。しかし、試料を含むEチップは、造影試薬を添加する前にミリQ水で洗浄する必要があります。
- アセンブリ全体を挟み合わせて密閉されたエンクロージャを形成し、3本の真鍮ネジでホルダー内に機械的に保持します(図2、パネル6-8)。
- アセンブリに続いて、ホルダーの先端は、TEMの内側にホルダーを配置する前に、ターボポンプドライポンプ場を使用して10-6 Torrにポンプで送られます。
4. 透過型電子顕微鏡を用いた液体中のイメージング
- LaB6フィラメントを搭載し、120kVで動作する透過型電子顕微鏡(FEI社)にインザッチの標本ホルダーをロードします。
- TEMフィラメントをオンにし、ウォブラー機能を使用して、カラム内のサンプルを前後に-15°から+15°まで傾けることで、標本に対して顕微鏡ステージのユーセントリックな高さを調整します。この手順は、液体チャンバの適切な厚さを考慮するために、Z方向のステージを調整します。このステップはまた、正確な倍率が画像を記録するときに使用されることを保証します。
- 最初に、エッジに沿って、マイクロ流体室の隅の領域に画像を記録します。通常、これらの領域には最も薄いソリューションが含まれます。CCDカメラを用いて低線量条件(1-3電子/Å2)の下での検体の画像を記録します。6,000X ~ 30,000X の公称倍率を使用します。
- 流体チャンバの端に焦点を合わせ、適切な焦点脱焦点値を決定します。30,000X倍率で画像を記録するには、-1.5 μmの値を使用します。厚い溶液が発生した場合、または造影剤が試料調製に使用されていない場合は、-2〜-4 μmの範囲でより高い脱焦点値を使用してください。
- 実験中にマイクロ流体室に溶液が含まれていることを確認するには、デバイス内の液体に気泡が形成されるまで電子線を焦点を合わせます。
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Representative Results
グロー放電されたEチップを用いた液体中のDMPの代表的な画像(図3A)は、アフィニティキャプチャデバイスで富化されたDMPと比較して、拡散によるものと考えられる特定の視聴領域におけるDMPの数が少なくなっています(図3B)。イメージングチャンバにウラニルのフォーマットを加えて、試料のコントラストが高まり、溶液中の個々のDMPの視認性が高まります(図3C、トップパネル)。より良いコントラストは、粒子平均化(図3C、ボトムパネル)や3D再構成ルーチン(図3C、インセット)などのダウンストリーム画像処理を、前述の17のように可能にする。簡単に言えば、3D再構成のために、SPIDERソフトウェアパッケージ19を用いて600個のDMP粒子を選択しました。選択粒子を、80Å分解能に濾過したロタウイルスDLP20の初期モデルに対して精製した。RELIONソフトウェアパッケージ21を用い、約25Åの分解能で3D再構成を計算した。私たちの3Dマップは、最初のモデルと、同じパラメータとDLPサンプル17を使用して計算された独立したクライオEM再構築とよく一致しています。
図 1.液体イメージング用の窒化シリコンマイクロチップを準備する。A)窒化ケイ素マイクロチップは、アセトンに2分間、メタノールで2分間の液を浸して洗浄し、製造工程で使用される残留フォトレジストを除去します。B)脂質単層試料は、湿気の多いペトリ皿17にパラフィルムに添加されたミリ-Q水の滴に調製される。C)洗浄されたマイクロチップは、単層の上に置かれ、1分のインキュベーションステップの後に除去される。D)分子アダプター(すなわち、タンパク質Aおよび溶液中の抗体)は、単層被覆チップに直接添加され、過剰溶液は、DMPを添加する前に除去される。湿った標本の破片はマイクロ液体のホールダーに荷を積まれる。
図 2.マイクロ流体試料ホルダーの液体チャンバーを組み立てる。試料チャンバの先端は、空の先端にOリング継ぎ手を加えることによって組み立てられる(ステップ1-2)。統合されたスペーサーを含む湿式の標本のチップは、ホルダの先端の機械加工継ぎ手に穏やかに置かれる(ステップ3-4)。グロー放電平らなチップは、試料チップの上に配置されます(ステップ5)。アセンブリは、3本の真鍮ねじ(ステップ7-8)によって所定の位置に保持されている金属のフェースプレート(ステップ6)で覆われます。
図 3.液体中のDDLPsの代表的な結果。A)グロー放電マイクロチップは、アフィニティ装飾マイクロチップ(B)と比較して溶液中のDDLを非常に少数結合する。スケールバー、2 μm。C)対照試薬を含む液体中のDMPの代表的な画像(上パネル)および3D再構成(インセット)。スケールバー、150 nm。再構成の直径は80nmである。液体(下部パネル)内のDMPのクラス平均は、外面に沿ってうまく定義された特徴を明らかにします。個々のパネルは110 nmです。
図 4.TEMにおける液体標本における気泡形成の代表的な結果。5電子/Å2での電子ビームの連続ばく露時に液体検体に形成された気泡の像は、約2分(A)および5分(B)である。縮尺バーは 100 nm です。
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Discussion
今回の研究では、テザーロタウイルスDMPに対するアフィニティキャプチャアプローチをマイクロ流体プラットフォームに採用しました。これは、液体微小環境における高分子複合体の画像化をその 場 で可能にした。キャプチャアプローチは、生物学的標本をイメージングウィンドウに局地化して、液体中の画像を記録している間に発生する大きな拡散性の問題を否定するため、 他のマイクロ流体イメージング技術に関して重要です 。しかし、 我々のプロトコルにおける最も重要なステップ の1つは、マイクロチップ表面への脂質バイオフィルムの移動を含む。脂質単層がグリッド上に均等に広がることができない場合、これは欠陥のある実験をもたらすでしょう。不十分な転送ステップの兆候は、ウイルスアセンブリがほとんどまたはまったく流体チップに結合されることです。転写工程における制限は、脂質層の流動性に関する熱安定性である。転写工程が不十分な場合、落下の不均一な広がりによって評価されるように、脂質層は氷上または振動のない冷たい部屋でインキュベートする必要があります。また、ペトリ皿は適切な湿度を維持するためにパラフィルムで適切に密封されなければなりません。
マイクロチップサンプル中のウイルス複合体またはアダプタタンパク質の過剰は、粒子の過度のクラスタリングにつながる可能性があります。これは、簡単に管理できるプロトコルの制限です。クラスタリング効果を最小限に抑えるために、タンパク質因子をより短い期間インキュベートするか、ウイルスサンプルをさらに希釈する必要があります。過剰な非特異的タンパク質が検出された場合、調製したイミダゾール(約50mM)を緩衝溶液に含めることで、バックグラウンドを低下させることができます。新鮮なイミダゾールの使用は、 プロトコルの重要なステップです.同様に、これは特定の結合を保証せず、欠陥のある実験をもたらすので、精製されたタンパク質でチップを過負荷にしないでください。画像には過剰なバックグラウンドタンパク質が含まれ、下流処理ルーチンには適していません。精製タンパク質の最適濃度範囲は、およそ0.01〜0.1mg/mlです。しかし、この範囲が粒子の予想レベルを提供しない場合、最適レベルが達成されるまでサンプルの濃度を高めるべきである。ウイルス粒子の濃縮は、抗体などの分子アダプタを欠いている陰性対照サンプルに対して発生する必要があります。否定的なコントロールでの非特異的結合の少量はまれに発生する可能性があります, しかし、アフィニティー装飾マイクロチップは、常にウイルス粒子を豊かにする役割を果たす必要があります.ロタウイルスの場合、現在、ウイルス複合体をNi-NTAの装飾された表面に直接捕捉する手段として、カプシドタンパク質に彼のタグを導入する逆遺伝的システムはありません。しかし、彼のタグ付きリボソームは、液体イメージング実験16のためにNi-NTAで装飾されたEチップに細菌のライセートから正常に募集されています。このように、この時点では限定的ではあるが、TEMカラム中に液体細胞で生じる天然の生物学的相互作用に関する証拠を提供する。
洗剤、グリセロールおよび高レベルのスクロースの使用は、 その場合 のイメージングでは避けなければならない。これらの試薬を使用すると、粒子中の過剰なバブリングやミュートされた特徴を含むEM画像にアーティファクトが生成され、品質の悪い画像が生成されます。これらの試薬がウイルス調製物に使用される場合、サンプルは、これらの成分を欠いた緩衝液中に透析することができる。アフィニティキャプチャデバイスは、ある程度の洗剤に短時間耐えることができますが、これはケースバイケースで決定する必要があります。前に説明した22の対応試薬のリストを参照してください。
下流の画像処理ルーチンを可能にするために、低濃度の造影試薬をマイクロ流体室に加えることができる。この試薬は、従来の染色手順17のようなタンパク質サンプルを固定しない。実験の時間経過を通して、液体が撮像チャンバーに存在することを保証するために、泡形成が起こるまで電子ビームを焦点を合わせる(図4)。これは、検体が水和されたままであることを示す簡単な尺度です。液体試料は、5電子/Å2で電子ビームの連続的な露出の2分(図4A)以内に深刻な損傷に遭遇する。この投与量で5分間(図4B)およびそれ以降の長期連続電子線露光は、イメージング領域において過剰な泡形成をもたらす。
アフィニティーキャプチャデバイスと組み合わせて使用されるその場での分子顕微鏡は、透過電子顕微鏡を用いた溶液中の生物学的複合体の検査を可能にする。これらの技術の進歩は、新開発のマイクロ流体試料ホルダーの使用によって可能になります。このようなデバイスは、薄い窒化シリコン膜を採用して、マイクロスケールのイメージングチャンバーを形成します。パーソンズと同僚7-10の先駆的な仕事に基づいて、我々はソリューション内の個々のウイルスアセンブリをイメージするための有用な戦略を提供します。ここで説明するプロトコルは、単一粒子画像処理ルーチンと3D再構成計算に対応する方法論を説明しています。これらの技術を習得することから生じる将来のアプリケーションには、高分子のライブEMイメージングが含まれる可能性があります。我々は、その場合、その画像化がウイルスアセンブリ、転写調節または宿主細胞の侵入のためのステップを明らかにするかもしれないと予想する。要約すると、これらのプロトコルを使用すると、研究者は完全に新しい方法でソリューションの動的プロセスを調査することができます。
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Disclosures
著者のマデリーン・J・デュークスは、株式会社プロトチップスの従業員です。
Acknowledgments
著者らは、バージニア工科大学カリリオン研究所所長のマイケル・J・フリードランダー博士が研究努力を奨励することを認めている。このプロジェクトは、S.M.MとD.F.K.への開発資金と、バージニア工科大学の重要技術応用科学研究所のナノバイオイニシアチブによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
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