Introduction
At være i stand til at identificere og kvantificere proteinekspressionsniveauer er en standard teknik til dyre- og cellebaserede forsøg. Men på trods af en mangeårig interesse i den tidlige embryonale hjerteklap udvikling, evaluering protein ekspression i denne specifikke væv under udvikling i øjeblikket er begrænset til immunhistokemi i både kylling og mus 1,2. En del af det er vanskeligt at kvantificere protein-ekspression i udviklingslandene ventiler fleste modelorganismer (f.eks chick og mus) er den lille størrelse af de ventiler, der begrænser mængden af protein, der kan opnås. Således til kvantitative analyser, forskere typisk afhængige RNA-ekstraktion og forstærkning for efterfølgende kvantitativ PCR eller microarray analyse 2-5. Men RNA og protein ekspressionsniveauer ikke er fuldstændigt korreleret 6, så fokus på RNA-ekspression kan ikke give en streng hensyn til de talrige ændringer, der opstår i en given signaleringvej på forskellige tidspunkter under udviklingen. På baggrund af denne grænse i den aktuelt tilgængelige metode, målet med denne fremgangsmåde var at udvikle en protokol til pålideligt at få tilstrækkelige mængder af protein fra udviklingslandene embryonale muse hjerteklap regioner til kvantitativ analyse af forandringer, der sker i forskellige signalveje, der er vigtige i modning af dette væv.
Embryonale ventiler er allerede almindeligt dissekeret fra mus til RNA-isolering og efterfølgende genekspressionsanalyse 2-5. Imidlertid har disse undersøgelserne været begrænset til at bruge genekspression som en udlæsning af signalvejen aktivering, som ikke tillader påvisning af opdage posttranslationelle protein ændringer, der kan påvirke downstream-signalering. Brug af RNA-isolationsteknikker som udgangspunkt, vi begyndte med at dissekere de områder af interesse. Fordi vores interesse var påvisning phosphorylerede proteiner, der var betegnende for signalering patHway aktivitet i en bestemt periode aortaklappen udvikling (E13.5-14.5), udførte vi alle dissektioner i fosfat-fri Tris-buffer og indsamlet ventilerne i en Tris-baserede lyseringspuffer med phosphatase og proteasehæmmere. I vores konkrete tilfælde, kun aortaklappen regioner blev indsamlet, men det pulmonale ventil regionen kunne let opnås på samme tid. Ventilens regioner blev derefter homogeniseret og kombineret med en prøve buffer, der i øjeblikket anvendes til at studere protein-ekspression i voksne hjerteklapper 7. Ved at bruge små prøvevolumener (f.eks 2 ul) og samle ventil regioner fra embryoner med samme genotype, var vi i stand til at opdage phosphorylerede og nonphosphoryleret proteiner ved embryonal dag 13,5 8. Fordi ventil regioner kan fryses og opbevares i lysisbuffer kan embryoner genotypebestemme hvis det er nødvendigt før pooling.
Denne teknik udvider sæt værktøjer, der er tilgængelige for at vurdere celle signaling veje under udviklingen, og giver en kvantitativ kompliment til immunhistokemi, specielt til udviklingslandene hjerteklapper. Denne teknik bør være til gavn ikke blot for udviklingsmæssige kardiologer, men også for alle udviklingsmæssige biologer, der arbejder med embryoer tidlige er interesseret i regioner, der indeholder begrænsede væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Excise aortaklappen
- Ved hjælp af en godkendt eutanasi teknik til fosterstadiet af interesse, aflive en gravid mus med unger på det ønskede embryonale dag (e) i udvikling.
- Brug 70% ethanol for at sterilisere maven af gravide kvinder. Løft hud og muskel i underlivet op og væk fra de indre organer, og dissekere åbne kvindelige nedre bughulen at give adgang til den uterine horn.
- For at hente livmoderhorn holde livmoderhalsen med pincet og forsigtigt skære caudale til tangen. Løft livmoderhorn, skære alle bindevæv, der holder hornet på plads, og fuldføre fjernelsen ved at skære krydset af uterushornet med æggelederen.
- Placer dissekerede livmoderhorn i en petriskål indeholdende cold 0,1 M Tris-puffer (pH 7,6) og skylles efter behov. Derefter skæres uterushornet åben længde-wise at eksponere embryonale sække.
- At udsætte fosteret, skar en embryonale sæk ved krydset af placenta og fosteret og klippe navlestrenge fartøjer at befri embryoet. Placer dissekeret foster i en anden petriskål med koldt 0,1 M Tris-buffer. Retur første petriskål med de resterende undissected embryoner til is indtil klar til næste foster.
- For at forbedre brystvæggen adgang inden embryonet, halshugge embryoet. Hvis genotypebestemmelse er nødvendigt, fjerne og gemme en ekstra væv brik i et Eppendorf rør, der anbringes på is.
- Placer embryonet på ryggen, og skære brystvæggen lodret langs den side af brystkassen, nær et forben og vandret over membranen til at visualisere hjertet. Åbn derefter brystvæggen at blotlægge hjertet.
- Brug en pincet til at holde høj langs de store kar, løft hjerte med pincet og skær skibene nedenfor. Denn, skæres over pincet til at frigøre hjertet. Hvis pulmonale kar forbliver uklippet, kan lungerne fjernes med hjertet og bør fjernes, før du fortsætter.
- Skær og fjerne lungepulsåren over niveauet af ventilen; på fosterstadiet heri beskrevne lungepulsåren er svagt uigennemsigtig, som hjælper i sin diskrimination fra ventilen regionen. Skær lige under pulmonal ventil, undgå trabeculated ventrikulære myocardium og indsamle som beskrevet i trin 1.10, hvis denne region er også af interesse. Her og i det næste trin, skal du bruge kapillarvirkning til at trække overskydende Trisbuffer væk fra området af interesse forud for indsamlingen i lysisbuffer.
- Fjern forsigtigt aorta distalt til aortaklappen, lige over niveauet af ventilen; ligesom lungepulsåren, aorta fortsat svagt uigennemsigtig på disse embryonale stadier, medvirken i dens fjernelse. Skær lige under aortaklappen, igen undgå trabeculated ventrikulære myocardium, og overføreventil med en pincet til et Eppendorf-rør med 2 pi lysisbuffer (beskrevet i Materialer tabellen) indeholdende protease og phosphataseinhibitorer på is.
- Gentag trin 1,6-1,10 indtil ventilerne er blevet udskåret fra alle embryoner, indsamling hver ventil i et separat Eppendorf-rør. Hvis alle embryoner har samme genotype, kan alle ventiler blive samlet i en enkelt Eppendorf-rør.
- Hvis genotypebestemmelse skal udføres for at afgøre, hvilke ventiler til at samle sammen, straks placere prøver i lyseringspuffer ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Prøverne kan derefter samles efter genotype (trin 2.1.1).
2. Protein Extraction
- Optø indsamlede væv på is og centrifugeres ved 13.100 xg i 1 min for at indsamle de væv i lysepuffer ved bunden af røret.
- Hvis embryoner genotype, skal du bruge en pipette til forsigtigt at indsamle og pool lysispuffer indeholder ventil regioner fra fostre med lignende genotyper. For at sikre en stærk Bog samle 3-4 ventil regioner fra E13,5 embryoner pr anbefales prøve.
- Hvis alle embryoner var af den samme genotype, og alle ventil regioner blev opsamlet sammen i trin 1.10, lysere hele prøven, som beskrevet i trin 2.2.
- Kontroller lydstyrken af den resulterende samleprøve og tilføje lysispuffer til et samlet volumen på 40 ul; derefter afbryde og homogenisere prøver under anvendelse af 5 mm rustfri perler i Eppendorf-rør. Betjen lyser i 2-4 minutter ved 50 Hz, som pr fabrikantens anvisninger. Spin rør kortvarigt, (~ 13.100 xg i 1 min), og overføre prøver til nye rør, der forlader bag den uopløselige rester.
- Forberede og separate prøver til SDS-PAGE og overførsel til efterfølgende western blot analyse efter en protokol som Eslami m.fl. 9. Blotting til lastning kontrol protein er afgørende for protein kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af dette præparat teknik, var vi i stand til at detektere phosphoryleret Smad 1,5,8 (pSmad) i enkelte aortaklappen regioner fra E13,5 embryoner. Som vist i figur 1A, proteinet isoleres fra selv en enkelt ventil region er tilstrækkeligt til at påvise en svagt pSmad bånd. Signal intensitet stiger proportionalt med antallet af ventil regioner, der er medtaget. Vigtigere er det, pSmad / β-actin procentdel fortsat næsten konstant på tværs af de forskellige stikprøvestørrelser (figur 1c). På grund af de lave niveauer af protein til rådighed, kan den samme blot ikke strippet og testet igen for total Smad. En separat blot, der viser den samlede Smad 1 og β-actin-viser imidlertid samme ekspressionsmønster (figur 1B).
Disse ventil regioner er næsten helt blottet for kontaminerende ventrikel myokardiet. Ved hjælp af dette præparat teknik i kombination med prøver af højre hjertekammer, vi var ude af stand til at opdage ventricular myokardiet markør ANP i aortaklappen regioner, mens denne markør let blev påvist i ventrikel (figur 2). Endvidere er den ventrikulære myokardie markør myosin let kæde 2V også let påvises i den ventrikulære stikprøven, men er næppe påviselig i aortaklappen regioner. Disse resultater understøtter den præcision af dissektion.
Figur 1. Smad phosphorylering i embryoniske aortaklappen regioner. Prøver blev fremstillet med et stigende antal pooled embryonale mus aortaklappen regioner, der spænder fra 1 til 4 ventil regioner pr prøve. Hver prøve indeholder alle proteiner isoleret fra hele ventilen område (r) i et samlet volumen på 25-28 pl. Udarbejdet væv blev derefter underkastet western blot analyse for phosphoryleret Smad1,5,8 (pSmad) (A), Samlet Smad1 (C), og β-actin-(A, C). Protein blev detekteret under anvendelse af Lumigen ECL Ultra og afbildes med UVM Visionworks software. Bandet intensitet pSmad og β-actin er proportional med mængden af udgangsmateriale, som er kvantificeret i (B) ved hjælp ImageJ software. De viste data er gennemsnittet og standardafvigelsen for to separate blots. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. aortaklappen regioner ikke udtrykker ventrikulære myocardium markører. Prøver blev fremstillet med et stigende antal puljede embryonale muse aortaklappen regioner, der spænder fra 1 til 4 ventil regioner pr prøve, eller med enprøve af den højre ventrikel. Prøver blev behandlet som beskrevet i figur 1 og blottet for ventrikulære myocardium markører ANP (A) og myosin let kæde (MLC) -2V (B). ANP er fuldstændig begrænset til ventrikulær prøve, og MLC-2v udtrykkes ved ekstremt lave niveauer sammenlignet med den ventrikulære prøve. β-actin er vist som en belastning kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at kvantificere protein niveauer i den tidlige embryonale mus og chick hjerteklapperne regioner giver en ekstra redskab til at forstå de kritiske cellulære signalering begivenheder for ventil udvikling. Vores protokol beskrevet heri adskiller sig ikke væsentligt fra standard proteinisolerings- procedurer. Men ved at ændre nogle af de vigtigste skridt, vi har med succes fået phosphorylerede proteiner fra ekstremt små stikprøvestørrelser. For at opnå dette resultat, kan følgende trin er af særlig betydning. For at sikre at kvalitet protein er opnået, er det afgørende at holde prøver kølet, enten på is eller ved hjælp af iskolde buffere, i nærvær af protease og om nødvendigt phosphataseinhibitorer. Endvidere homogenisering med en anordning, der er designet til at behandle små prøvevolumener er afgørende for tilstrækkeligt at afbryde cellemembraner. Selv med disse forholdsregler, kan det opnåede udbytte af protein være for lav til at detektere via Bradford assayet med et spektrofotometereller et protein kvantificering kit og stadig have prøve til rådighed for efterfølgende analyser. Vi var i stand til at bestemme, at hver aortaklappen region indeholder cirka 1 ug protein ved at samle 7 aortaklappen regioner og bruge hele prøven til kvantificering. På trods af denne begrænsning er tilstrækkelig protein opnået at detektere phosphorylerede og ikke-phosphorylerede proteiner, selvom den manglende forudgående kvantificering gør en belastning kontrol afgørende. Vi specifikt anvendes β-actin, fordi det er en høj overflod protein, som tillod os at opdage det selv efter fjernelse membranen adskillige gange; dens molekylvægt afveg fra vores proteiner af interesse; og det udtrykkes ubikvitært. Der anbefales en retssag western blot med forskellige antal af puljede prøver for at afgøre, hvor mange væv, skal samles til enten embryonale hjerteklapperne regioner på andre stadier af udvikling eller til andre små væv af interesse. Derudover anbefaler vi at samle mindst tre tonsudstede prøver for hver proteinprøve at tage højde for variation i størrelsen af de dissekerede væv samt i det tidsrum, embryonets sad på is før dissektion. Hvis proteinet af interesse ikke kan registreres via Western blot, selv efter at samle prøver, anbefaler vi at reducere prøvevolumen og øge homogenisering tid til at sikre, at alle potentielle protein er tilgængelig for detektion. Derudover kan proteaseinhibitorer også tilsættes til iskold Tris-buffer under dissektioner for ustabile eller let nedbrydes proteiner. Hvis proteinet af interesse udtrykkes ved lave niveauer, yderligere fejlfinding i western blot del af eksperimentet, såsom justering af det primære antistof inkubation eller substratet påvisningsmetode kan hjælpe med visualisering.
Hvis det materiale (f.eks immunhistokemi eller in situ hybridisering), at et protein af interesse er udtrykt både i hjerteklapper og omgivende myocardium kan aorta eller pulmonal arterie myokardiet blive drillet hinanden forsigtigt med wolfram nåle, selv fra ventiler fra E12.5 embryoer 5. Fordi denne ekstra skridt vil forlænge den tid af dissektion og tilføje væsentlig tekniske vanskeligheder, foreslår vi beskæftiger det da kun nødvendigt. I vores oprindelige undersøgelse, vi begyndte med en immunhistokemisk analyse, som viste, at Smad phosphorylering kun blev ændret i ventilen mesenchym; derfor var vi overbeviste om, at eventuelle forskelle observeret via Western blot skyldtes ændringer i ekspression i ventilen mesenchym 8. Endvidere fordi udviklingslandene udstrømning tarmkanalen ventiler sidder ved krydset af de store arterier og hjertekamrene, der udfører en kontrol skamplet for ventrikulær forurening ved hjælp af en ventrikulær myokardiet-specifikt antistof, såsom ANP eller MLC-2v anbefales.
Fordi ventilerne undergår dramatiske reorganisering i løbet af deres udvikling, kan vi tilbyde følgende trinspecifik RNBEFALINGER for puder / ventiler og deres omgivende væv. For de tidlige hynder (E9.5-11.5), er både udstrømning tarmkanalen og atrioventrikulær puder nemt visualiseres og dissekeret på grund af gennemskinnelighed af myocardium 10; men disse embryoner er små, og dissekere nåle anbefales i stedet for pincet og microscissors. Til mid-stage differentiering (E12.5-14.5) 10, de halvmåneklappen ventiler (dvs. aorta og lungepulsåren ventiler) vil være mere let tilgængelige end de atrieventrikelklapperne (dvs. mitral og trikuspidalklapperne). Dog skal halvmåneklappen ventiler dissekeres forsigtigt fordi aorta og lungepulsåren er septating og dreje løbet af denne tidsramme 11,12. Bør være meget opmærksom på rotation af bunden af aorta og lungepulsåren, og midtpunktet mellem disse arterier bør konsekvent identificeres. På senere stadier af ventil modning og kondens (E15.5 og senere) 10, kan mitral og trikuspidalklapperne blive drillet væk fra inde i hjertekamrene; dog skal de halvmåneklappen ventilerne være mere let tilgængelige.
Western blot-analyse er en mangeårig teknik til kvantificering af protein ekspressionsniveauer i voksne hjerteklapper 13, hvor biopsi størrelse er stort. I modsætning hertil har de gratis tidlige embryonale analyser fokuseret på enten ikke-kvantitativ immunhistokemi til at påvise protein-ekspression eller revers transkription-PCR, hvor den lille grundbeløb på isolerede mRNA kan forstærkes inden analysen. Disse øjeblikket er beskæftiget teknikker giver nogle relevante oplysninger om ændringer i signalering og genekspression, men mangler evnen til kvantitativt at vurdere protein niveauer. Med denne protokol, kan vi nu tilføje kvantitative protein ekspressionsdata at korrelere med den kvantitative mRNA-ekspression af data og immunhistokemiske analyser.
Denne protokol komplimenter etablerede teknikker til at isolere mRNA fra de embryonale hjerteklapper og billedbehandling proteinekspression. Som sådan vil kombinere disse teknikker gør det muligt for mere fuldstændige analyser af op-og nedregulering af signalveje, fra mRNA til post-translationel protein modifikation. Endvidere tillader denne teknik til kvantificering af protein-ekspression, hvilket vil styrke øjeblikket udnyttet immunhistokemiske teknikker. Mener vi, sammen, at denne teknik vil være af interesse for enhver forsker interesseret i hjerteklapper eller forbereder andre særligt små vævseksplantater til kvantitativ western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
