Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Zusammenfassung

Die Analyse der Proteinexpression in jungen embryonalen Mausklappen wurde durch das begrenzte verfügbare Gewebe erschwert. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Präparation von Proteinen aus sich entwickelnden embryonalen Mausklappenregionen für die Western-Blot-Analyse.

Zusammenfassung

Die Western-Blot-Analyse ist eine häufig verwendete Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinkonzentrationen. Bei kleinen Gewebeproben ist diese Analysemethode jedoch möglicherweise nicht empfindlich genug, um ein Protein von Interesse nachzuweisen. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, untersuchten wir Protokolle zur Gewinnung von Protein aus adulten menschlichen Herzklappen und modifizierten diese Protokolle für die sich entwickelnden frühen embryonalen Maus-Gegenstücke. Kurz gesagt, werden die embryonalen Aortenklappenregionen der Maus, einschließlich der Aortenklappe und der umgebenden Aortenwand, in einem möglichst geringen Volumen eines Tris-basierten Lysepuffers mit Proteaseinhibitoren gesammelt. Falls dies aufgrund der Zuchtstrategie erforderlich ist, werden die Embryonen genotypisiert, bevor vier embryonale Aortenklappenregionen für die Homogenisierung gepoolt werden. Nach der Homogenisierung wird ein SDS-basierter Probenpuffer verwendet, um die Probe für die Verarbeitung auf einem SDS-PAGE-Gel und die anschließende Western-Blot-Analyse zu denaturieren. Obwohl die Proteinkonzentration für eine Quantifizierung mit spektrophotometrischen Proteinquantifizierungsassays zu niedrig bleibt und Proben für nachfolgende Analysen übrig bleiben, kann diese Technik verwendet werden, um phosphorylierte Proteine erfolgreich über Western Blot aus gepoolten Proben von vier embryonalen Tag-13,5-Maus-Aortenklappenregionen zu detektieren und semi-quantifizieren, von denen jede etwa 1 μg Protein ergibt. Diese Technik wird für die Untersuchung der Aktivierung des zellulären Signalwegs und der Proteinexpression während der frühen embryonalen Entwicklung von Mausklappen von Vorteil sein.

Einleitung

Die Möglichkeit zur Identifizierung und Quantifizierung Proteinexpressionsniveaus ist eine Standardtechnik für tier- und zellbasierten Experimenten. Doch trotz langjähriger Interesse an der frühen embryonalen Herzklappen Entwicklung, Bewertung Proteinexpression in diesem speziellen Gewebe während der Entwicklung ist derzeit sowohl in der Immunhistochemie Küken und Maus ^1,2 begrenzt. Ein Teil der Schwierigkeit der Quantifizierung der Proteinexpression in den Entwicklungs Ventile aller Modellorganismen (beispielsweise Küken und Maus) ist die geringe Größe der Ventile, die die Menge an Protein, die erhalten werden können, begrenzt. So für quantitativ....

Protokoll

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Universität von North Carolina in Chapel Hill genehmigt.

1. Verbrauch der Aortenklappe

1. Mit einem zugelassenen Euthanasie Technik für die embryonalen Stadium von Interesse, einschläfern eine schwangere Maus mit Welpen an der gewünschten embryonalen Tag (E) der Entwicklung.
2. Verwenden 70% Ethanol, um den Bauch der Schwangeren zu sterilisieren. Heben Sie die Haut und Muskeln des Unterleibs oben und weg von den inneren Organen und sezieren unteren Bauchhöhle des Weibchens offen für den Zugang zum Uterushorn zu ermöglichen.
3. ....

Ergebnisse

Mit dieser Präparationstechnik, waren wir in der Lage, im Einzel Aortenklappe Regionen aus E13.5 Embryonen erkennen phosphoryliert Smad ^1,5,8 (pSmad). Wie in 1A gezeigt, ist das Protein von sogar einer einzigen Ventilbereich isoliert ausreicht, um eine schwache pSmad Band zu erfassen. Signalintensität nimmt proportional zur Anzahl der Ventilbereiche, die gebündelt sind. Wichtig ist, bleibt die pSmad / β-Actin-Verhältnis in den verschiedenen Stichprobengrößen (Abbildung 1c) na.......

Diskussion

Die Fähigkeit, Proteinspiegel in der frühen embryonalen Maus quantifizieren und Küken Herzklappen Regionen bietet ein zusätzliches Werkzeug für das Verständnis der kritischen zellulären Signalereignisse für Ventil Entwicklung. Unsere hier beschriebenen Protokoll nicht wesentlich von Standardproteinisolierungsverfahren abweichen. Jedoch durch Änderung einiger Schlüsselschritte, haben wir erfolgreich erhalten phosphoryliert Proteine ​​aus extrem kleinen Probengrößen. Um dieses Ergebnis zu erreichen, sind die folgenden Sch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zeitgesteuerte schwangere Maus			Zur Präparierung im embryonalen Stadium von Interesse
Stereoskopisches Mikroskop	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Mikroschere	Fine Science Tools	15003-08
Feine Pinzette, #5	Fine Science Tools	11251-30
Präpariernadel Inhaber	Ted Pella Inc.	13560
Präpariernadeln	Ted Pella Inc.	13561-10
Mikropipette, 20 μ l, mit Spitzen
Lysepuffer			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%
Triton PhosSTOP	Roche	4906845001	1 Tablette auf 10 ml Lysepuffer geben
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Edelstahlkügelchen	Qiagen	69989
Mikrozentrifuge