Introduction
In staat zijn om eiwit expressie niveaus te identificeren en te kwantificeren is een standaard techniek voor dier-en cel-gebaseerde experimenten. Ondanks een langdurige interesse in vroege embryonale ontwikkeling hartklep, evalueren eiwitexpressie in dit specifieke weefsel tijdens ontwikkeling momenteel beperkt tot immunohistochemie in zowel het kuiken en muis 1,2. Een deel van de moeilijkheid kwantificeren eiwitexpressie in de ontwikkeling kleppen meeste modelorganismen (bijvoorbeeld kuiken en muis) is de kleine omvang van de kleppen die de hoeveelheid eiwit die kan worden verkregen beperkt. Zo kwantitatieve analyses, onderzoekers normaliter afhankelijk RNA-extractie en amplificatie voor daaropvolgende kwantitatieve PCR of microarray-analyse 2-5. Echter, RNA en eiwit expressie niveaus niet geheel correlatieve 6, dus gericht op RNA expressie kan geen strenge wegens de vele veranderingen die optreden in een bepaalde signaleringroute op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling. Op basis van deze grens in de momenteel beschikbare methoden het doel van deze procedure is een protocol voor het betrouwbaar om voldoende hoeveelheden eiwitten van de muis embryonale ontwikkeling hartklep gebieden voor kwantitatieve analyse van veranderingen die optreden in verschillende signalisatiewegen belang te ontwikkelen de rijping van dit weefsel.
Embryonale kleppen zijn reeds algemeen ontleed uit muizen voor RNA isolatie en vervolgens genexpressieanalyse 2-5. Echter, deze studies beperkt tot het gebruik genexpressie als uitlezen van signaleringsroute activatie, waarbij de detectie van sporen posttranslationele eiwit modificaties die stroomafwaartse signalering beïnvloeden niet toestaat. De RNA-isolatietechnieken als uitgangspunt, begonnen we met het ontleden van de gebieden van belang. Omdat onze interesse was het opsporen van gefosforyleerd eiwitten die indicatief zijn voor het signaleren pat warenHWAY activiteit gedurende een bepaalde periode aortaklep ontwikkeling (E13.5-14.5), voerden we alle dissecties in fosfaatvrije Tris buffer en de kleppen in een Tris-gebaseerde lysis buffer met fosfatase en proteaseremmers verzameld. In het specifieke geval enkel de aortaklep gebieden werden opgevangen, maar de pulmonaalklep regio kan gemakkelijk worden verkregen op hetzelfde moment. De klep gebieden werden vervolgens gehomogeniseerd en gecombineerd met een monsterbuffer die momenteel wordt gebruikt voor eiwitexpressie bij volwassen hartkleppen 7 bestuderen. Via kleine monstervolumes (bijvoorbeeld 2 ui) en samenbrengen klepgebieden van embryo's met hetzelfde genotype, waren we in staat om gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde eiwitten detecteren embryonale dag 13.5 8. Omdat de klep gebieden worden ingevroren en opgeslagen in lysis buffer, kan embryo genotyperen indien nodig voordat bundelen.
Deze techniek verbreedt de set van tools die beschikbaar zijn voor het evalueren van cel signaling wegen tijdens de ontwikkeling en biedt een kwantitatieve compliment voor immunohistochemie, in het bijzonder voor de ontwikkeling van hartkleppen. Deze techniek moet niet alleen nuttig om ontwikkelingsstoornissen cardiologen, maar ook voor alle ontwikkelings-biologen die werken met een vroeg stadium embryo's geïnteresseerd zijn in regio's die beperkte weefsel bevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.
1 Accijnzen de aortaklep
- Met een goedgekeurde euthanasie techniek voor het embryonale stadium plaats, euthanize een zwangere muis met pups op de gewenste embryonale dag (E) van ontwikkeling.
- Gebruik van 70% ethanol aan de buik van de zwangere vrouw te steriliseren. Til de huid en spieren van de onderbuik omhoog en van de inwendige organen en ontleden onderste buikholte van het wijfje open toegang tot de baarmoeder hoorn mogelijk.
- Om de baarmoeder hoorn op te halen, houdt u de baarmoederhals met een pincet en knip voorzichtig caudaal van de tang. Til de baarmoeder hoorn, snijden elke bindweefsel dat de hoorn op zijn plaats houdt, en voltooi de verwijdering door het snijden van de kruising van de baarmoeder hoorn met de eileider.
- Plaats de uitgesneden uterushoorn in een petrischaal met cold 0,1 M Tris buffer (pH 7,6) en spoelen indien nodig. Snij vervolgens de baarmoedertak geopend lengte-wijs om de embryonale zakken bloot.
- Om het embryo bloot opengesneden een embryonale sac op de kruising van de placenta en de embryo en de navelstreng schepen de embryo lossnijden. Plaats de ontleed embryo in een tweede petrischaal met koude 0,1 M Tris buffer. Zet de eerste petrischaal met de resterende undissected embryo ijs tot klaar voor de volgende embryo.
- Om borstwand toegang binnen het embryo te verbeteren, onthoofden het embryo. Als genotypering is nodig, te verwijderen en op te slaan een extra stuk weefsel in een Eppendorf buis geplaatst op ijs.
- Plaats het embryo op zijn rug, en snijd de borstwand verticaal langs de kant van de ribbenkast, bij een voorpoot en horizontaal boven het membraan naar het hart te visualiseren. Open vervolgens de borstwand naar het hart bloot te leggen.
- Met behulp van een tang te houden hoog langs de grote vaten, til het hart met behulp van een tang, en de vaten onder te snijden. Hetn, bezuiniging de tang naar het hart bevrijden. Als de longvaten ongesneden blijven, kunnen de longen worden verwijderd met het hart en dienen alvorens verder worden verwijderd.
- Snij en verwijder de longslagader boven het niveau van de afsluiter; in de embryonale stadia hierin beschreven, de longslagader enigszins ondoorzichtig, hetgeen helpt bij het onderscheid van het klepgebied. Snij net onder de pulmonaalklep, het vermijden van de trabeculated ventriculaire myocard en verzamelen zoals beschreven in stap 1.10 als dit gebied is ook van belang. Hier en in de volgende stap gebruikt capillaire werking overtollige Tris buffer verwijderd van het interessegebied trekken vóór verzamelen in lysis buffer.
- Verwijder voorzichtig de aorta distaal van de aortaklep, juist boven het niveau van de afsluiter; zoals de longslagader, de aorta blijft enigszins ondoorzichtig op deze embryonale stadia, hulp bij de verwijdering ervan. Snij net onder de aortaklep, opnieuw de trabeculated ventriculaire myocard vermijden, en de overdracht van delos met een tang om een Eppendorf buis met 2 ui lysis buffer (in de tabel Materials beschreven) die protease en fosfataseremmers op ijs.
- Herhaal stappen 1,6-1,10 totdat de kleppen zijn uitgesneden uit alle embryo, verzamelen elke klep in een aparte Eppendorf buis. Als alle embryo hetzelfde genotype kunnen alle kleppen worden opgevangen in een Eppendorf buis.
- Als genotypering wordt uitgevoerd om te bepalen welke kleppen poolen moeten onmiddellijk monsters in lysis buffer bij -80 ° C tot verder gebruik. Monsters kunnen vervolgens worden samengevoegd na genotypering (stap 2.1.1).
2 Protein Extraction
- Ontdooi verzamelde weefsels op ijs en centrifugeer bij 13.100 xg gedurende 1 min naar de weefsels in lysis buffer verzamelen op de bodem van de buis.
- Als embryo's werden het genotype, gebruik maken van een pipet om voorzichtig te verzamelen en het zwembad lysis buffer met de klep regio's van embryo's met gelijkaardige genotypes. Om een sterke b zorgenen, het bundelen van 3-4 klepgebieden van E13.5 embryo's per monster wordt aanbevolen.
- Als alle embryo's waren van hetzelfde genotype en al klepgebieden werden gebundeld in stap 1.10, lyseren het gehele monster, zoals beschreven in stap 2.2.
- Controleer het volume van het resulterende samengevoegde monster en voeg lysis buffer tot een totaal volume van 40 ui; Vervolgens, verstoren en homogeniseren monsters met behulp van 5 mm rvs kralen in Eppendorf buizen. Bedien de lyser 2-4 minuten bij 50 Hz, volgens instructies van de fabrikant. Spin buizen kort (~ 13.100 xg gedurende 1 min), en doorvoermonsters nieuwe buizen, met achterlating van de onoplosbare brokstukken.
- Voorbereiden en afzonderlijke monsters voor SDS-PAGE en daaropvolgende transfer voor western blot analyse volgens een protocol zoals Eslami e.a. 9. Vloeipapier voor een laad-controle-eiwit is essentieel voor eiwit kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze voorbereiding techniek, waren we in staat om gefosforyleerd Smad- 1,5,8 (pSmad) op te sporen in enkele aortaklep regio van E13.5 embryo's. Zoals getoond in figuur 1A, het eiwit geïsoleerd uit zelfs een enkele klepgebied volstaat een zwakke band pSmad detecteren. Intensiteit van het signaal toeneemt evenredig met het aantal klepgebieden die worden samengevoegd. Belangrijk is dat de pSmad / β-actine-ratio blijft vrijwel constant over de verschillende steekproefomvang (figuur 1C). Vanwege de lage gehaltes aan eiwit beschikbaar is, kan dezelfde blot niet wordt verwijderd en reprobed voor de totale Smad. Echter, een afzonderlijke blot die totaal Smad 1 en β-actine toont hetzelfde expressiepatroon (Figuur 1B).
Deze klepgebieden zijn bijna volledig verstoken van verontreinigende ventriculaire myocardium. Met behulp van deze voorbereiding techniek in combinatie met monsters van de rechter ventrikel, we waren niet in staat om te detecteren ventricular myocard marker ANP in aortaklep regio's, dat deze marker gemakkelijk werd gedetecteerd in het ventrikel (figuur 2). Verder wordt de ventriculaire myocardiale marker myosine lichte keten 2V ook gemakkelijk gedetecteerd in de ventriculaire monster maar nauwelijks detecteerbaar in de aortaklep regio. Deze resultaten ondersteunen de nauwkeurigheid van de dissectie.
Figuur 1 Smad fosforylatie in embryonale aortaklep regio. Monsters werden bereid met toenemende aantallen samengevoegde embryonale muis aortaklep gebieden, variërend van 1 tot 4 klepgebieden per monster. Elk monster omvat alle eiwitten geïsoleerd uit de hele klepgebied (s) in een totaal volume van 25-28 pl. Bereide weefsels werden vervolgens onderworpen aan western blot analyse voor gefosforyleerd Smad1,5,8 (pSmad) (A) Totale Smad1 (C) en β-actine (A, C). Eiwit werd gedetecteerd met behulp van Lumigen ECL Ultra en afgebeeld met UVM VisionWorks software. De band intensiteit van pSmad en β-actine is evenredig met de hoeveelheid uitgangsmateriaal, zoals gekwantificeerd in (B) met ImageJ software. De gepresenteerde gegevens zijn de gemiddelde en de standaarddeviatie van de twee afzonderlijke vlekken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Aortaklep gebieden geen ventriculaire myocardium markers tot expressie. Monsters werden bereid met toenemende aantallen samengevoegde embryonale muis aortaklep gebieden, variërend van 1 tot 4 klepgebieden per monster, of met eenmonster van het rechterventrikel. De monsters werden verwerkt zoals beschreven in figuur 1 en geblot voor het ventriculaire myocardium merkers ANP (A) en myosine lichte keten (MLC) 2V (B). ANP volledig beperkt tot de ventriculaire monster en MLC-2v expressie wordt gebracht op zeer lage niveaus in vergelijking met de ventriculaire monster. β-actine weergegeven als beladingscontrole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid om eiwit niveaus hartklep regio's te kwantificeren in de vroege embryonale muis en kuiken biedt een extra instrument voor het begrijpen van de kritische cellulaire signalering evenementen voor klep ontwikkeling. Ons protocol hierin beschreven verschilt niet veel van de standaard eiwitisolatie procedures. Echter, door het wijzigen van een aantal belangrijke stappen, hebben we met succes gefosforyleerd eiwitten verkregen uit zeer kleine steekproeven. Om dit resultaat te bereiken, zijn de volgende stappen van bijzonder belang. Om kwaliteit eiwitten wordt verkregen, is het cruciaal om monsters gekoeld blijven, of op ijs of met ijskoude buffers, in aanwezigheid van protease en, eventueel, fosfataseremmers. Verder homogenisatie met een apparaat dat is ontworpen om kleine monstervolumes te verwerken is essentieel voor het adequaat verstoren celmembranen. Zelfs met deze voorzorgsmaatregelen kan de verkregen opbrengst aan eiwit te laag om te detecteren via de Bradford assay met een spectrofotometerof een eiwit kwantificering kit en nog sample beschikbaar voor latere analyses. We waren in staat om te bepalen dat elke aortaklep gebied bevat ongeveer 1 ug eiwit door het poolen van 7 aortaklep regio's en het gebruik van het gehele monster te kwantificeren. Ondanks deze beperking wordt voldoende eiwit verkregen gefosforyleerd en niet-gefosforyleerde eiwitten te detecteren, maar het ontbreken van voorafgaande kwantificering maakt een laad controle noodzakelijk. Wij specifiek gebruikt β-actine omdat het een hoge overvloed proteïne, die ons toeliet om het te ontdekken, zelfs na het strippen van de membraan vele malen; het molecuulgewicht verschilde Aanbevolen eiwitten van belang; en het is alomtegenwoordig uitgedrukt. Een proef western blot met verschillende aantallen samengevoegde monsters wordt aanbevolen om te bepalen hoeveel weefsels worden samengevoegd voor zowel embryonale hartklep gebieden in andere stadia van ontwikkeling of andere kleine weefsels plaats. Daarnaast adviseren wij het bundelen ten minste drie tkwestie monsters voor elk eiwit monster rekening van variabiliteit in de grootte van het ontlede weefsels en in de tijd elk embryo zat op ijs voorafgaand aan dissectie. Wanneer het eiwit van belang kan worden gedetecteerd via western blot zelfs na pooling monsters, is het verstandig monstervolume en verhogen de homogenisering tijd zodat alle potentiële eiwit beschikbaar is voor detectie. Bovendien proteaseremmers kunnen ook ijskoude Tris buffer toegevoegd tijdens dissecties voor instabiele of gemakkelijk afgebroken eiwitten. Wanneer het eiwit van interesse tot expressie wordt gebracht op lage niveaus aanvullende oplossen tijdens de western blot gedeelte van het experiment, zoals het aanpassen van het primaire antilichaam incubatie of het substraat detectiemethode, kan helpen bij visualisatie.
Als het bewijs (bijvoorbeeld immunohistochemie en in situ hybridisatie) suggereert dat een eiwit van interesse, zowel in de hartkleppen en surrou uitgedruktnding myocard, kan de aorta of de longslagader hartspier elkaar voorzichtig worden geplaagd met wolfraam naalden, zelfs van de kleppen van E12.5 embryo's 5. Omdat deze extra stap wordt als de dissectie verlengen en belangrijke technische problemen, raden we die stof wordt gebruikt als alleen nodig. In onze oorspronkelijke studie, begonnen we met een immunohistochemische analyse waaruit bleek dat Smad- fosforylering alleen werd veranderd in het ventiel mesenchym; dus we waren overtuigd dat alle waargenomen via Western blot verschillen waren door veranderingen in expressie in de klep mesenchym 8. Verder, omdat de ontwikkeling uitstroom kleppen zitten op de kruising van de grote slagaders en de ventrikels, het uitvoeren van een controle blot ventriculaire verontreinigingen door een ventriculaire myocardium-specifiek antilichaam zoals ANP of MLC-2v aanbevolen.
Omdat de kleppen ondergaan drastische reorganisatie tijdens hun ontwikkeling, bieden wij de volgende stage-specifieke rANBEVELINGEN voor de kussens / kleppen en hun omliggende weefsel. Voor de vroege kussens (E9.5-11.5) zijn zowel de uitstroombaan en atrioventriculaire kussens gemakkelijk gevisualiseerd en ontleed door de doorschijnendheid van het myocardium 10; echter, deze embryo klein en ontleden naalden aanbevolen plaats pincetten en microscissors. Voor mid-stage differentiatie (E12.5-14.5) 10, de halvemaanvormige kleppen (dwz, de aorta en de longslagader kleppen) zullen beter toegankelijk dan de atrioventriculaire kleppen zijn (dat wil zeggen, de mitralisklep en tricuspidalisklep). Wel moet de halvemaanvormige kleppen zorgvuldig ontleed omdat de aorta en longslagader worden septating en draaien tijdens deze periode 11,12. Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan de rotatie van de basis van de aorta en longslagader en het midden tussen deze slagaders consequent worden geïdentificeerd. In latere stadia van rijping klep en condensatie (E15.5 en later) 10, kan de mitralisklep en de tricuspidalisklep weg worden gepest vanuit de ventrikels; moet echter de halvemaanvormige kleppen beter bereikbaar zijn.
Western blot analyse is een lang bestaande techniek voor het kwantificeren eiwitexpressie niveaus in volwassen hartkleppen 13, waarbij de biopsie groot is. Daar staat tegenover dat de gratis vroege embryonale analyses gericht op zowel niet-kwantitatieve immunohistochemie om eiwitexpressie te detecteren of reverse transcriptie PCR, waar de kleine basisbedrag van geïsoleerde mRNA vóór de analyse kan worden versterkt. Deze momenteel werkzaam technieken bieden enige relevante informatie over wijzigingen in de signalering en gen-expressie, maar missen het vermogen om eiwit niveaus kwantitatief evalueren. Met dit protocol kunnen we nu kwantitatieve eiwit expressie data te correleren met de kwantitatieve mRNA expressie data en immunohistochemische analyses toe te voegen.
Dit protocol complimenten gevestigde technieken voor het isoleren van mRNA uit de embryonale hartkleppen en beeldvorming eiwitexpressie. Als zodanig, het combineren van deze technieken zal zorgen voor meer volledige analyse van de up-en down-regulatie van de signaalwegen, van mRNA naar eiwit modificatie-translationele plaatsen. Verder laat deze techniek voor kwantificering van eiwitexpressie die zal verbeteren nog gebruikt immunohistochemie technieken. Samen geloven wij dat deze techniek plaats voor onderzoeker vindt het de hartkleppen of aan andere bijzonder kleine weefsel explantaten voor kwantitatieve Western blot analyse zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
