Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering og karakterisering af neutrofiler med antitumoregenskaber

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Abstract

Neutrofiler, den mest rigelige af alle hvide blodlegemer i den humane cirkulation, spiller en vigtig rolle i værtens forsvar mod invaderende mikroorganismer. Desuden neutrofiler spiller en central rolle i immunovervågning af tumorceller. De har evnen til at genkende tumorceller og inducere tumor celledød enten gennem en celle kontakt-afhængig mekanisme, der involverer hydrogenperoxid eller via antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC). Neutrofiler med antitumoraktivitet kan isoleres fra perifert blod fra cancerpatienter og tumorbærende mus. Benævnes disse neutrofiler tumor-indblandet neutrofiler (TEN) for at skelne dem fra neutrofiler af raske personer eller naive mus, der viser ingen signifikant tumor cytotoksisk aktivitet. Sammenlignet med andre hvide blodlegemer, neutrofiler vise forskellige opdrift, hvilket gør det muligt at opnå en> 98% rent neutrofil befolkning, når de underkastes en densitetsgradient. Men ud overtil den normale høj massefylde neutrofil population (HDN), hos cancerpatienter, i tumorbærende mus, samt under kroniske inflammatoriske tilstande, distinkte lav densitet neutrofile populationer (LDN) fremgår kredsløbet. LDN co-oprenses med fraktionen mononukleare og kan adskilles fra mononukleære celler ved anvendelse af enten positiv eller negativ udvælgelse strategier. Når renheden af de isolerede neutrofiler bestemmes ved flowcytometri, kan de anvendes til in vitro og in vivo funktionelle assays. Vi beskriver teknikker til overvågning af anti-tumor aktiviteten af neutrofiler, deres evne til at migrere og til at producere reaktive oxygenarter, såvel som overvågning af deres fagocytiske kapacitet ex vivo. Vi beskriver yderligere teknikker til at mærke de neutrofile til in vivo sporing, og til at bestemme deres anti-metastatiske kapacitet in vivo. Alle disse teknikker er afgørende for at forstå, hvordan du anskaffer og karakterisere neutrofiler med anti-tumorfunktion.

Introduction

Neutrofiler blev indledningsvist karakteriseret som medfødte immunceller, der tjener som første linje forsvar mod invaderende mikroorganismer. I dag er det kendt, at neutrofiler har mere vidtrækkende funktioner, være involveret i montering adaptive immunrespons mod fremmede antigener 1,2, regulering hematopoiese 3, angiogenese 4 og sårheling 5. Derudover kan neutrofiler påvirke tumorvækst og metastatisk progression i kraft af deres pro- og anti-tumor aktiviteter 6,7. Neutrofiler er karakteriseret ved en polymorf segmenteret kerne (betegnet dermed polymorfonukleære (PMN) leukocytter) og indeholder mindst tre forskellige underklasser af granulater samt sekretoriske vesikler 8 (figur 1A-C).

Neutrofiler besidder høj fagocytisk kapacitet og høj NADPH-oxidase-aktivitet kritisk for mikrobiel elimination, og udskiller en bred vifte af chemokiner vigtige itrækkraft yderligere neutrofiler og andre immunceller til stedet for inflammation 8,9. Neutrofiler er karakteriseret ved ekspression af en stor mængde af overfladereceptorer herunder Toll-lignende receptorer (TLRs), C-type lectin Receptorer (CLR'er), komplement receptor 3 (CD11b / CD18) og andre adhæsionsmolekyler (fx L-selectin, LFA-1, VLA-4 og carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokinreceptorer (f.eks CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemotiltrækkende receptorer (f.eks PAFR, LTB4 R og C5aR) , cytokin-receptorer (f.eks G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptid-receptorer (f.eks FPR1-3), og Fc-receptorer (f.eks CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) og CD64 (FcyRI) 10. Hos mus er neutrofiler normalt identificeret som CD11b + Ly6G +, mens humane neutrofiler identificeres ved hjælp af CD11b, CD15, CD16 og CD66b leukocyt markører. Det er også generelt accepteret at farvning for granulatet proteiner myeloperoxidase (MPO) og neutrofil elastase (NE) til påvisning af neutrofiler i væv.

Det er stadig uklart, om de forskellige funktioner af neutrofiler medieres af den samme celle eller ved distinkte celle subpopulationer. Akkumulerende data tyder for tilstedeværelsen af en heterogen neutrofil population, som udviser en høj grad af plasticitet påvirket af proinflammatoriske stimuli og mikromiljøet 11,12. Fridlender et al. 13 har groft opdelt neutrofiler i kræft i to store delpopulationer betegnes N1 med anti-tumor egenskaber og N2 med pro-tumor egenskaber. I kræft, såvel som i kronisk inflammation, der er en ekstra sub-population bestående af granulocytiske myeloide-afledte suppressorceller (G-MDSCs), der undertrykker T-cellereaktioner 14. G-MDSCs anses for at være umodne myeloide celler er karakteriseret ved en CD11 + Ly6Clav Ly6G hi fænotype i mus 15, og samtidig have en CD15 + / CD16 lav fænotype i humane 16. G-MDSCs ekspres højere niveauer af arginase og myeloperoxidase, medens lavere niveauer af cytokiner og chemokiner end normale cirkulerende neutrofiler. De er mindre fagocyterende og vandrende, men producerer højere niveauer af ROS 15,17,18. I det foreliggende dokument vil vi beskrive nogle grundlæggende metoder til isolering og karakterisering af neutrofiler med anti-tumor egenskaber.

Mens neutrofiler udgør den største bestand af alle hvide blodlegemer i menneskets omløb (45-70%, 1.800 - 6.000 / ul), i mus, under normale forhold, de er temmelig sparsomme (10 - 15%; 300-500 / ul ). Neutrofiltallet stiger støt upon inflammation og lejlighedsvis i kræft, hvilket er en tilstand af kronisk inflammation 7. Neutrofiler udvikle sig fra multipotente fælles myeloid forløber (CMP) ceLLS i knoglemarven, gennem en differentiering proces passerer faser af Myeloblaster (MB), promyelocytter (PM), myelocytter (MC), metamyelocytes (MM) og band-celler (BC) 8. De modne, post-mitotiske neutrofiler kan forblive inden knoglemarven til 4 - 7 dage før de frigives til kredsløbet 8. Neutrofil omsætning i blodet er normalt hurtig med en gennemsnitlig halveringstid på 6-12 timer, hvilket kan forlænges under inflammatoriske tilstande. Stimulerede neutrofiler har begrænset anti-tumorigen aktivitet, en funktion, der kan erhverves ved at udsætte naive neutrofiler til chemokinerne IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 og CXCL5 6,19 eller kunstigt, ved at udsætte dem for phorbolesteren phorbol-12 -myristate 13-acetat (PMA) 6.

Den korte halveringstid af blodneutrofiler sammen med det lave antal neutrofiler (~ 3-5 x 10 5) opnået fra 1 ml blod fra en naiv 6 - 8 uger gamle mus, har gjort detvanskeligt at udforske funktionen af cirkulerende muse neutrofil in vitro. At overvinde denne vanskelighed, er blevet anvendt andre kilder. For eksempel kan et stort antal neutrofiler opnås fra knoglemarven 20 eller peritoneum efter induktionen af steril inflammation (fx efter intraperitoneal injektion af thioglycollat ​​bouillon eller Zymosan A). Det skal bemærkes, at neutrofiler opnået fra bughulen ikke udøve nogen anti-tumorigen aktivitet (upubliceret observation).

. Granot et al 6 observeret, at BALB / c-mus inokuleret orthotopisk med musen 4T1 brystcarcinoma-cellelinie udvikle neutrofili hvilket forværrer med tumorprogression 6 (figur 2A), således at 20 til 40.000.000 blodneutrofiler let kan isoleres fra 1 ml blod 3 - 4 uger efter tumorpodning. Disse neutrofiler har erhvervet anti-tumor aktiviteter og har derfor været COIdefinerede tumor-indblandet neutrofiler (TEN), for at skelne dem fra naive neutrofiler 6 (figur 2B). Mens høj tæthed neutrofiler (HDN, figur 1A) er yderst anti-tumorigen, low-density neutrofiler (LDN, figur 1B), der genereres i forbindelse med cancer, er ikke 21. Også, high-density neutrofiler fra knoglemarven og milten af ​​tumorbærende mus har anti-tumor aktivitet (upublicerede data). Det skal bemærkes, at med tumorudvikling milten bliver gradvist forstørret (splenomegali), med stigende mængder af neutrofiler.

Det skal bemærkes, at TEN også genereres i andre modeller af cancer, herunder både spontane (MMTV-PyMT og MMTV-Wnt1 brysttumorer og K-Ras drevne lungetumorer) og injiceret (AT-3 (MMTV-PyMT) og E0771 brystcarcinom celler, LLC Lewis lungecarcinomceller og B16-F10 melanomceller). Imidlertid er omfanget af neutrofil tilvejebringelse i disse tumeller modeller er langt mindre end af 4T1-inokulerede mus og nåede 5 - 10 x 10 6 neutrofiler i 1 ml blod efter 3 uger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr: 5-7 uger gamle BALB / c-mus købes fra Harlan (Israel). Alle forsøg med dyr blev godkendt af hebraiske Universitets Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Humane prøver: Indsamling af blod fra kræftpatienter og raske frivillige blev godkendt af Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Induktion af neutrofiler med Anti-tumor egenskaber in vivo Brug af en Breast Cancer Mouse Model.

BEMÆRK: Alle trin skal udføres ved hjælp af sterile opløsninger i en laminar luftstrøm (LAF) Bio-sikkerhed kabinet.

  1. Seed 5 x 10 5 4T1 celler i 100 mm vævskulturplade i 10 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 4,5 g / l D-glucose suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 2 mM D- glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin G og 100 pg / ml streptomycin-sulfat. Inkuber the-celler ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2 i 3 til 4 dage. Sikre, at cellerne henholdsvis 50 - 100% konfluente på dagen for forsøget.
  2. Aftagning tumorcellerne fra vævskulturplade, aspireres dyrkningsmediet, vaske cellerne med 5 ml PBS, opsug PBS, og der tilsættes 3 ml af en 2,5 g / l trypsin-opløsning. Inkubere cellerne 2 - 3 i min med trypsin ved 37 ºC.
  3. Der tilsættes 10 ml serumholdigt medium for at neutralisere trypsin og pipetten op og ned, indtil alle cellerne er fritliggende. Overfør celler suspensionen til et 15 ml konisk centrifugerør.
  4. Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer mediet forlader 200 pi medium over cellepelleten. Cellerne resuspenderes i det resterende volumen og tilsættes 10 ml PBS. Vend røret 2 - 3 gange for at få en homogen cellesuspension og tag 10 pi at tælle cellerne i et hæmocytometer. Brug trypanblåt at skelne mellem levende og døde celler. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 200 xg ved stuetemperatur. Aspireres PBS og cellerne resuspenderes i PBS ved en slutkoncentration på 2 x 10 6 celler / ml. Sørg for, at enkelt celle suspension har ingen sammenklumpning.
  5. Injicer 1 x 10 6 4T1 celler eller luciferase-udtrykkende 4T1-celler i 50 pi PBS orthotopisk ind i venstre lyske brystfedtpuden af BALB / c-mus ved anvendelse af en 0,3 ml sprøjte med en 30G x 8 mm nål.
    1. Før injektion, bedøver de mus i en induktion kammer modtager en langsom strømningshastighed på isofluran (3 - 5%) i 100% oxygen.
    2. Læg musen på en steril kirurgisk pad og sørg for, at hovedet er korrekt placeret inde i isofluran næse kegle. Bekræft ordentlig anæstesi ved at klemme poten. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Barbere håret omkring injektionsstedet og desinficere med 70% EtOH.
    3. Brug en steril sæt kirurgiske værktøjer til at gøre en lille vandret snit (5 mm) ca.imately halvvejs mellem lyskelymfeknuder og abdominale brystvorter, udsætte fedt pad og injicere 1 x 10 6 4T1 celler i 50 pi. Luk indsnit med 9 mm klip, der bør fjernes en uge senere. Injektion af luciferase-udtrykkende celler tillader overvågning af tumorstørrelse og metastase ved bioluminescens billeddannelse.
      BEMÆRK: Denne minimalt invasiv procedure kræver ikke nogen post-kirurgisk behandling og de injicerede mus raske inden 2-3 min.
    4. Overvåg musene, indtil de kommer til bevidsthed, og sørg for at de genvinder fuld bevidsthed før han sluttede selskab med andre mus.
  6. Efter 3 - 4 uger, når den primære tumor har nået et volumen på 2 cm3, ofre musene ved en langsom CO 2 strøm, og umiddelbart efter den sidste åndedrag, udtage blod ved hjertepunktur ved anvendelse af en 25G x 5/8 "nål forbundet til en 1 ml tuberculinsprøjte forbehandlet med heparin. Hold munden af ​​nålen opad ved indføring afsprøjten i vandret position gennem membranen mod hjertet, og langsomt og gradvist trækker blodet undgå overtryk (figur 3).

2. Neutrofil Isolation

  1. Isolering af cytotoksiske neutrofiler fra blod af tumorbærende mus.
    1. Fortynd 1 ml blod udtaget fra en tumor-bærende mus (se protokol 1.11) i PBS indeholdende 0,5% (vægt / volumen) bovint serumalbumin (BSA) til en endelig volumen på 6 ml.
    2. Fraktionering af fortyndet blod på en frisk fremstillet diskontinuerlig sucrose-gradient:
      1. Tilsæt 3 ml sterilfiltreret saccharose 1,119 g / ml til bunden af ​​et 15 ml konisk polypropylen centrifugerør.
      2. Langsomt og forsigtigt, layer 3 ml sterilfiltreret saccharose 1,077 g / ml oven på 1.119 g / ml lag. Derefter tilsættes langsomt og forsigtigt de 6 ml fortyndet blod (Protokol 2.1.1) oven på 1,077 g / ml lag (figur 4A). Det anbefales at holde røret vippes og endding de forskellige komponenter af en langsom, men kontinuerlig strøm, holde mundingen af ​​pipetten mod den nedre væg af røret, således at ingen turbulens dannes.
    3. Centrifugeres røret med det fortyndede blod på saccharosegradienten ved 700 xg i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse.
    4. Fjern forsigtigt røret fra centrifugen uden at forårsage nogen turbulens. De fleste af de erytrocytter vil være i bunden af ​​røret. High-density neutrofiler (HDN) findes som et hvidt-til-rød ring ved grænsefladen mellem 1.119 g / ml og 1,077 g / ml lag (omkring 3 ml mærket), mens lav-densitets leukocytter findes i en hvid ring ved grænsefladen mellem 1.077g / ml lag og det BSA-holdige PBS (omkring 6 ml-mærket, se figur 4B).
    5. Aspireres PBS + 0,5% BSA, indtil den når 5 mm med lav massefylde cellelag. Pipette de lav massefylde celler ved langsom sugning i en 1 ml spids gennem langsomt hvirvlende omkring cellerne.Overfør cellerne i 30 ml PBS med 0,5% BSA.
    6. Aspirere det øvre lag i den samme gradient røret, indtil den når 5 mm høj massefylde celle band. Pipette de high-density-celler, som for det meste high-density neutrofiler, og overføre cellerne i 30 ml PBS indeholdende 0,5% BSA.
    7. Centrifuger cellerne ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    8. Aspirere supernatanten og lyserer erythrocytter ved resuspendering af cellerne i 36 ml sterilt HPLC-kvalitet vand i 30 sek. Isotonicitet bør genoprettes ved tilsætning af 9 ml 5x koncentreret PBS suppleret med 2,5% (w / v) BSA.
    9. Centrifuger cellerne ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    10. Aspireres supernatanten, og cellerne resuspenderes i PBS-BSA. Tæl antallet af neutrofiler i et hæmocytometer og bruge trypanblåt til at skelne mellem levende og døde celler.
    11. Centrifuger cellerne ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og resuspender neutrofiler i ønsket inkubationsmedium til endelig celletæthed. Brugneutrofilerne straks.
    12. Derefter, efter den anden centrifugering, resuspenderes neutrofiler i inkubationsmedium til endelig celletæthed. Brug neutrofiler straks.
  2. Isolering af cirkulerende neutrofiler fra kræftpatienter.
    1. Bland 10 ml hepariniseret (20 U / ml) humant blod med et lige volumen af ​​3% Dextran T500 i saltvand og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Under denne inkubering erythrocytterne vil sedimentere.
    2. Der fremstilles en 50 ml konisk polypropylenrør med 10 ml saccharose 1,077 g / ml og langsomt lag leukocyt-rige supernatant oven på 1,077 g / ml saccharose lag (figur 4C).
    3. Centrifuger ved 400 xg i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse. Den høje densitet neutrofiler (HDN) vises i pillen. Low-density neutrofiler (LDN) co-oprenses med monocytter og lymfocytter ved grænsefladen mellem 1,077 g / ml saccharose lag og plasma (figur 4D).
    4. Resuspendere neutrofiler i 10 ml 0.2% NaCl i 30 sek for at lysere kontaminerende erythrocytter, og genoprette isotonicitet ved tilsætning af 10 ml 1,6% NaCl og invertsukker gang.
    5. Centrifuger i 5 minutter ved 160 xg ved stuetemperatur og vaskes tre gange i 20 ml Hanks balancerede saltopløsning. Centrifugeres efter hver vask og aspirere supernatanten.
    6. Tæl neutrofiler og cellerne resuspenderes i RPMI-1640 suppleret med 2% FBS ved 2 x 10 6 neutrofiler / ml eller som ønsket.

3. Berigelse af blodneutrofiler Brug magnetiske perler

  1. Positiv selektion
    1. Der tages 1 ml blod fra en mus som beskrevet i protokol 1,8, med en hepariniseret sprøjte.
    2. Centrifugeres blodet i en 15 ml konisk rør ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Aspirer supernatanten eller beholde blodplasmaet til yderligere undersøgelser.
    4. Lyse erythrocytterne ved at resuspendere celler i 8 ml HPLC-kvalitet vand. Efter 30 sek genoprette isotonicitet ved tilsætning af 2 ml 5x koncentrated PBS indeholdende 2,5% BSA. Tæl cellerne.
    5. Centrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    6. Resuspender cellepelleten i 200 pi PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA per 10 8 celler.
    7. Der tilsættes 50 pi biotinyleret anti-Ly6G antistof. Bland godt og inkuberes i 10 minutter i køleskab (ikke på is).
    8. Tilføj 150 pi kold PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    9. Vortex anti-biotin coated magnetisk mikroperle stamopløsning. Overfør 100 ul til cellesuspensionen. Bland godt og inkuberes i 15 minutter i køleskab (ikke på is).
    10. Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA, og der centrifugeres ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    11. Aspirer supernatanten fuldstændigt, og resuspender i 500 pi kold PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    12. Indsæt en magnetisk separation kolonne i et magnet holder, der er knyttet til en magnetisk stativ, og skyl den med 500 pi kold PBS indeholdende 0.5% BSA og 2 mM EDTA.
    13. Påfør cellesuspensionen på søjlen. Gennemløbet indeholder umærkede LyG6-negative celler.
    14. Kolonnen udvaskes med 500 pi PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Yderligere umærkede celler vil være i gennemstrømningen.
    15. Gentag vasketrinet med en anden 500 pi PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    16. Fjern kolonnen fra magneten og placere den på en 15 ml opsamlingsrør. Der tilsættes 1 ml PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA og skylle de magnetisk mærkede celler ved kraftigt at skubbe stemplet ind i søjlen. Gennemstrømningen indeholder Ly6G + neutrofiler.
  2. Negativ selektion
    1. Forbered blodleukocytter efter trin 3.1.1 til 3.1.5.
    2. Resuspender 1 x 10 8 celler i 1 ml PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA i en 5 ml polystyren rundbundet rør.
    3. Tilføje 50 pi normal rotteserum.
    4. Der tilsættes 50 pi neutrofil berigelse cocktail (indeholdende biotinylerede antistoffer specifikke for ikke-neutrofile hvide blodlegemer), bland godt og inkuberes i 15 minutter i køleskab.
    5. Vask cellerne ved tilsætning af 4 ml PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA, og centrifuger 400 xg i 10 min.
    6. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    7. Der tilsættes 50 pi tetramere antistof-komplekser mod biotin og dextran. Bland godt og inkuberes i 10 minutter i køleskabet.
    8. Vortex godt røret med dextran-coatede magnetiske perler før tilsætning 150 pi til cellesuspensionen. Bland godt og inkuber 10 minutter i køleskab.
    9. Bringe cellesuspensionen til et samlet volumen på 2,5 ml ved tilsætning af PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Bland forsigtigt for at få en homogen cellesuspension.
    10. Sæt røret (uden hætten) ind magneten, og lad stå i 3 minutter.
    11. Invertsukker magneten med røret i en kontinuerligbevægelse, således at ubundne celler i væsken vil blive overført til et nyt rør. Lad magneten og rør inverteret til 2 - 3 sek, derefter vende tilbage til oprejst position. De magnetisk mærkede uønskede celler forbliver bundet til væggen af ​​det oprindelige rør, mens de ubundne neutrofiler vil være i den overførte væske.

4. Cytologisk Farvning af neutrofiler

  1. Resuspender 1x10 5 neutrofiler i 50 pi PBS og overføre cellesuspensionen til et tyndt lag cellepræparation adapter såsom en Cytospin. Centrifuger adapteren ved 150 xg i 5 min. Adskil præ-mærkede objektglas fra adapteren.
  2. Fix celler ved at dyppe objektglas i 70% ethanol i 2 min. Lad præparater fra adapteren (se trin 4.1) til at tørre ved stuetemperatur før farvning. Dyp gliderne 5 - 6 gange i destilleret vand.
  3. Farv 1 - 2 ud min i Mayers hematoxylin-opløsning. Skyl 1 min i ledningsvand. Farv 10 sek i Eosin Y opløsning . Vask i Tap vand. Dehydrere ved at skylle dias i stigende ethanolkoncentrationer (70%, 96% og 100%). Lad objektglas lufttørre kort tid og inspicere dias under et lysmikroskop.
    BEMÆRK: Hematoxylin har en dyb blå-lilla farve og pletter nukleinsyrer, mens eosin er lyserød og farver proteiner uspecifikt. De cytoplasmatiske granulat af neutrofiler forbliver ufarvede af sure eller basiske farvestoffer, som er oprindelsen til navnet "kærlig at være neutral '. Hvorimod basofile granulocytter pletten mørkeblå med hæmatoxylin og eosin og eosinophilc granulocytter lyse rødt, neutrofiler synes neutral pink (se figur 1A). Modne neutrofiler er kendetegnet ved en polymorfnukleær kerne, som generelt er stort med 2 - 5, kamre 'segmenterede neutrofiler' (figur 1A og 1C). Umodne neutrofiler er kendetegnet ved en et-lappede buet eller ringformet kerne (figur 1B).
ve_title "> 5. Bestemmelse af renheden af ​​neutrofiler ved flowcytometri.

  1. Resuspender 1x10 6 celler i 100 pi FACS buffer (PBS indeholdende 0,5% BSA, 2 mM EDTA og 0,02% NaN3). For fuldblodsprøver er hæmolyse, før farvning (trin 3.1.1 til 3.1.5). Tilsæt 10 pi FcR blokerende reagens i 5 min.
  2. Tilsæt 0,5 ug af fluorescensmærket antistof med en specificitet for Ly-6G for muse neutrofiler eller til CD11b og CD66b for humane neutrofiler, bland godt og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Justere volumen til 500 pi med PBS indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA og analysere farvning ved flowcytometri.

6. Følg Neutrofil Gate in vivo

  1. In vivo BrdU mærkning af neutrofiler
    1. Injicer 100 pi af en 10 mg / ml bromdeoxyuridin (BrdU) opløsning i sterilt PBS intraperitonealt til tumorbærende mus.
    2. Isoler blodneutrofiler 48 timer efter injektion enccording til protokol 2.1. Stain BrdU-mærkede neutrofiler ved anvendelse af et BrdU flow kit.
  2. CFSE mærkning af neutrofiler
    1. Resuspender 10 7 neutrofiler i 1 ml forvarmet PBS.
    2. Tilsæt 2 pi af en 5 mM CFSE stamopløsning til de suspenderede neutrofiler til en slutkoncentration på 10 uM. Bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. 5 mM CFSE fremstilles ved at opløse 2,8 mg CFSE (5- (og 6 -) - carboxyfluorescein diacetat, succinimidylester) i 1 ml DMSO. Opdel i 10 portioner pi i sterile 200 rør og gemme ul i mørke ved -20 ° C.
    3. Neutralisere overskydende CFSE ved tilsætning af et lige så stort volumen RPMI-1640 indeholdende 10% FBS. Der inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C. Centrifuger neutrofiler ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask neutrofiler to gange i 10 ml RPMI-1640 indeholdende 10% FBS.
    4. Centrifuger ved 400 x g i 10 minutter og resuspender i et passende volumen af ​​PBS. Neutrofilerne (f.eks, 1 x 10 7

7. In vitro Luciferase Assay til at overvåge anti-tumor aktivitet Isoleret neutrofiler.

  1. Dyrk luciferase-mærkede tumorceller som beskrevet for 4T1-celler i protokol 1,1-1,5, men resuspendere trypsinlignende dissocierede celler i optimeret reduceret serum medium suppleret med 2% FBS. Juster celledensiteten til 5 x 10 4 celler pr ml.
  2. Seed 5.000 luciferase-mærkede tumorceller i 100 pi optimeret reduceret serum-medium indeholdende 0,5% FBS i hver brønd i en hvid 96-fladbundet vævskultur-brønds plade.
  3. 4 timer efter podning af tumorcellerne, tilsættes 1 x 10 5 neutrofiler i 50 pi optimeret reduceret serum-medium indeholdende 0,5% FBS, og inkuberes O / N. Forbered en neutrofil celle suspension med en tæthed på 2 x 10 6 celler / ml. Kontrolbrønde bør få 50 pi medium uden neutrofiler. Gøremultiple gentagelser af hvert eksperimentelt indstilling.
  4. Den følgende morgen, forsigtigt aspireres supernatanten og vask hver brønd med 200 pi PBS. Aspireres PBS, og der tilsættes 50 pi passiv lysisbuffer. For let adskillelse celler (såsom AT-3-celler), ikke vaske i PBS og tilsæt cellekultur lysisbuffer umiddelbart efter opsugning vækstmediet.
  5. Dæk pladen med aluminiumsfolie og inkuberes det på en orbitalryster ved 150 rpm i 20 minutter ved stuetemperatur.
  6. Pladen anbringes i en luminescens pladelæser. Injicere well-wise 50 pi luciferase assay opløsning og læse kemiluminescens i 10 sek per brønd.
  7. Beregn% tumorlyse ved følgende formel:% tumorlyse = (1- [luminescens af prøver med neutrofiler] / [luminescens af prøver i medium]) x 100%.

BEMÆRK: For at vurdere bidraget af neutrofiler til metastatisk såning, kan neutrofiler være udtømt som beskrevet i protokol 8.1. Til effektiv udarmet uranetion administrere neutrofil-nedbrydende antistoffer startende på dag 7 efter tumor transplantation.

8. Anti-metastatisk aktivitet af neutrofiler i en Breast Cancer Mouse Model.

  1. In vivo nedbrydning af neutrofiler.
    1. Frisk forberede 12,5 ug af rotte-anti-Ly6G antistof (neutrofil depletterende antistof) eller af rotte-isotype kontrol antistof (IgG 2a, Κ) i saltvand ved et endeligt volumen på 100 pi per mus.
    2. Startende på dag 3 efter tumor engraftment injicere daglig en intraperitoneal dosis på 12,5 pg rotte anti-Ly6G antistof (100 pl). Injicere kontrolmus med eller 12,5 ug (100 pi) rotte isotype kontrol antistof (IgG 2a, Κ).
    3. Begyndende på dag 14, administrere antistofferne to gange dagligt, som den neutrofile produktionshastighed dramatisk øger når 4T1 tumor vokser.
    4. Hver anden dag, få en blodprøve (2 - 3 dråber) ved nicking den laterale halen-vene. Indsaml blodet ind en anti-coagulant indeholdende rør (Heparin, citrat eller EDTA).
    5. Kontrollere neutrofil depletering ved anvendelse af flowcytometri som beskrevet i protokol 5.
  2. Tumor neutraliserende (ændret Winn Assay)
    1. Isolere neutrofiler fra tumorbærende mus. Bland 1 x 10 6 tumorceller og 3 x 10 6 neutrofiler i 50 pi saltvand (per mus).
    2. Injicere cellerne subkutant til flanken af ​​6 - 8 uger naive BALB / c-mus. Barbere flanken før tumor indpodning at muliggøre nøjagtige målinger af tumorstørrelse. Mål tumorstørrelse daglige start på dag 5 post-transplantation.
  3. Neutrofil adoptiv overførsel
    1. Injicer 2 x 10 4 luciferase-udtrykkende tumorceller i 200 pi PBS til halevenen.
    2. Neutrofil overførsel bør udføres 4 timer efter tumorcelleinjektion. Derfor starter oprensningen af HDN fra tumorbærende mus (protokol 2.1), ca. 2 timer før deres planlagte ivivo overførsel. Resuspender neutrofiler i PBS ved en slutkoncentration på 2,5 x 10 7 celler / ml.
    3. 4 timer efter indføring af tumorceller placere musene under en varmelampe i 5 minutter. Placer musene i en fastholdelsesanlæg og injicere 5 x 10 6 HDN (200 pi) via halevenen. Kontrolmus injiceres med vehikel (PBS).
    4. Overvåge dannelsen af lungemetastaser på forskellige tidspunkter ved anvendelse af en in vivo bioluminescens imaging system eller ved immunhistokemi.
  4. Lunge metastatisk seeding assay
    1. Injicer 0,5-1 x 10 6 forældre 4T1-celler orthotopisk ind i venstre lyskelymfeknuder brystfedtpuden som beskrevet i protokol 1.
    2. På dag 10, resuspender GFP-udtrykkende 4T1-celler i PBS ved en slutkoncentration på 5 x 10 5 celler / ml. Placer musene under en varmelampe i 5 minutter.
    3. Placer musene i en fastholdelsesanlæg og injicere 1x10 5 GFP-udtrykkende 4T1-celler (200 pi) intravenøst ​​til 4T1 tumorbærende mus eller naive mus.
    4. Den følgende dag, aflive musene og perfundere lungerne med 20 ml PBS for at fjerne de resterende røde blodlegemer.
    5. Udskære lungerne til analyse af GFP-positive celler ved immunhistokemi.
      BEMÆRK: For at vurdere bidraget af neutrofiler til metastatisk såning, kan neutrofiler være udtømt som beskrevet i protokol 8.1. For effektiv udtømning administrere neutrofil-nedbrydende antistoffer startende på dag 7 efter tumor transplantation.

9. Suppression af T-celleproliferation ved Neutrofiler fra tumorbærende mus.

  1. Fjerne milten fra en aflivet naiv BALB / c-mus og sted i 10 ml PBS.
  2. Placer milten på et 40 um cellefilter, der er egnet på en petriskål fyldt med RPMI-1640. Brug af stemplet ende af sprøjten, mash milten gennem cellerne si i petriskålen. Skyl cellefilter med 5 ml RPMI. Kassér sien.
  3. Overfør de resuspenderede celler i en 50 ml konisk rør og centrifugeres 400 xg i 10 min.
  4. Supernatanten fjernes, og lysere erytrocytterne ved at suspendere cellerne i 36 ml rent vand i 20 sekunder, og juster til isotonicitet ved tilsætning af 4 ml PBS koncentreret x 10. Alternativt, lysere erythrocytter ved at suspendere cellerne i 5 ml erythrocyt lyseringsbuffer (ACK), og der inkuberes 5 minutter ved stuetemperatur. Neutralisere ACK ved tilsætning af 10 ml RPMI-1640 medium. Centrifuger ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellerne i 5 ml PBS og tælle cellerne.
  5. Resuspendere splenocytter i PBS til en endelig densitet på 4 x 10 7 celler / 2 ml i 15 ml rør. Tilsæt 2 ml af en 2,5 uM CFSE opløsning i PBS. Hurtigt vendes røret og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C med lejlighedsvis blanding (hver 2 minutter), beskyttet mod lys.
  6. Quench overskydende CFSE ved tilsætning af 4 ml forvarmet FBS (100%) og inkuberes i 1 min ved stuetemperatur. Tilsæt 3 ml PBS og centrifugeres ved 400 xg i 10min.
  7. Vask cellerne med 30 ml PBS og centrifugeres ved 400 xg i 10 min.
  8. Filtrere celler gennem en 40 um cellefilter og vask igen med PBS.
  9. Resuspender cellerne i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS til en endelig densitet på 2 x 10 7 celler / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / brønd (200 pi) i en 24-brønds vævs-dyrkningsplade.
  11. Stimulere cellerne ved tilsætning af 1 ug oprenset armensk hamster-anti-muse CD3e antistof i 500 pi RPMI-1640 med 10% FBS.
  12. Tilføje 2 x 10 6 HDN eller LDN i 300 pi RPMI-1640 med 10% FBS til de CFSE-mærkede splenocytter, og der inkuberes i 3 dage ved 37 ° C. Brønde uden neutrofiler bør få 300 pi medium. Samlede volumen i hver brønd bør være 1 ml.
  13. Saml cellerne og forberede dem til flowcytometri. Cellerne resuspenderes i 100 pi FACS buffer (Protokol 5), og der tilsættes 10 pi FcR blokerende reagens. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  14. Tilføj 1 &# 956; l APC-konjugeret anti-CD8a-antistof og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  15. Bestem CFSE fluorescensintensitet på CD8 + T-celler ved flowcytometri (figur 5). Den CFSE Intensiteten halveres ved hver celledeling. Således kan antallet af celledelinger bestemmes af intensiteten af ​​CFSE farvning.

10. Neutrophil Migration Assay

  1. Frø 5x10 5 4T1 celler i 7 ml optimerede reduceret serum-medium suppleret med 0,5% FBS i en 25 cm2 vævskultur-kolbe og inkuberes 24 timer ved 37 ° C.
  2. Overfør 800 ul af supernatanten til bunden kammer i et migration plade med en porestørrelse på 5 um.
  3. Resuspender 2 x 10 5 neutrofiler i 400 pi optimeret reduceret serum medium suppleret med 0,5% FBS. Påfør cellesuspensionen til den øverste kammer og inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
  4. Ved slutningen af ​​inkubationen fjerne det øverste kammer ogtælle antallet af neutrofiler, der er migreret til det nederste kammer.

11. Overvågning Neutrofil Produktion af Reactive Oxygen Species (ROS).

  1. Forbered 1,1 x 10 6 neutrofiler / ml i Hanks balancerede saltopløsning uden phenolrødt. Plade 180 pi indeholdende 2 x 10 5 neutrofiler i hver brønd i en hvid 96-fladbundede brønde.
  2. Pladen anbringes i en luminescens pladelæser. Tilsæt 20 gl af en 500 uM Luminol løsning i PBS til hver brønd for at få en slutkoncentration på 50 uM. Læse den basale kemiluminescens for 1sek i et tidsforløb på 5 min med 10 sek intervaller.
  3. Tilføj et stimulerende middel (f.eks PMA ved en koncentration på 10 nM eller 100 nM eller fMLP ved en koncentration på 10 uM). Der fremstilles en 10x koncentreret opløsning af hvert middel i Hanks balancerede saltopløsning uden phenolrødt og tilføje 22 pi til de respektive brønde. At kontrollere brønde tilføje 22 pi køretøj.
  4. Measure den kemiluminescens i pladelæser. Gøre begge en kort (hvert 10 sek til 5 min) og en lang (hvert minut i 1 time) tidsforløbet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en nylig undersøgelse identificeret vi en anti-metastatisk funktion for neutrofiler 6. Neutrofiler fra tumorbærende mus erhverver en cytotoksisk fænotype og har kapacitet til at dræbe tumorceller 6. Dette er i modsætning til neutrofiler fra naive mus, som ikke har nogen signifikant anti-tumor effekt 6. Adskillige af teknikkerne beskrevet i protokollen afsnit er blevet anvendt til at studere antitumor-neutrofil funktion in vitro og in vivo 6.

Tumor cytotoksiske neutrofiler kan fås fra tumor-bærende mus 6. For at nå dette mål, blev mus orthotopisk injiceret med 4T1-celler i venstre lyske brystfedtpude (Protokol 1). Ved dag 21 efter tumorinokulation, den primære tumor nåede en størrelse på 1 - 2 cm 3 (figur 3 - tumoren er tydeligt i nederste venstre underliv). På dette tidspunkt blev musene aflivet, og 1 ml blod blev trukket (per mus)ved hjertepunktur (figur 3). Parallelt blev blod fra en naiv, ikke-tumorbærende mus trækkes. HDN blev derefter oprenset på en densitetsgradient (protokol 2.1 og figur 4) til opnåelse af en meget ren (> 98%) population af neutrofiler. Neutrofil levedygtighed blev bestemt ved trypanblåt-farvning (Protokol 2.1). Neutrofilerne blev derefter resuspenderet i optimeret reduceret serum-medium indeholdende 0,5% FBS ved 2 x 10 6 neutrofiler / ml.

For at teste omfanget af neutrofil cytotoksicitet tilsatte vi 10 5 neutrofiler (50 pi fra en 2 x 10 6 neutrofiler / ml stamopløsning) til luciferase udtrykkende 4T1-målceller (5000 celler / brønd i 100 pi) i en fladbundet hvid 96 brønds plade (protokol 7). Efter en O / N inkubation blev cellerne vasket i PBS og lyseret i passiv celle lysis buffer, og luciferaseaktivitet i hver prøve blev testet for at vurdere omfanget af neutrofil cytotoksicitet ( (figur 2B, tumorfri), neutrofiler oprenset fra tumorbærende mus signifikant cytotoksicitet (figur 2B, tumorbærende).

At teste de immunsuppressive egenskaber i LDN og HDN anvendte vi den T-celle-proliferation assay (protokol 9). Vi evalueredeantal CD8 + celler i ubehandlede splenocytter og i splenocytter behandlet med en aCD3 antistof, som var dyrket alene og celler, der blev dyrket i nærvær af LDN eller i nærvær af HDN (figur 5A-D). Bemærk den dramatiske stigning i CD8 + CFSE + celler efter anti-CD3 stimulering (sammenlign øverste højre panel i A og B) den dramatiske inhiberende virkning af suppressiv LDN (sammenlign øverste højre panel i B og C) og manglen på inhiberende virkning af HDN (panel D). Vi evaluerede også omfanget af CFSE fastholdelse, som en indikation for spredning. I figur 5E, den orange kurve viser ubehandlede CD8 + -celler, den blå kurve CD8 + -celler, behandlet med aCD3 antistoffer, den røde kurve CD8 + celler stimuleret med aCD3 i nærværelse af LDN og den grønne kurve repræsenterer CD8 + celler stimuleret med α; CD3 i nærværelse af HDN. Bemærk den venstregående forskydning i aCD3 behandlede celler (blå kurve) og aCD3 behandlede celler dyrket med HDN (grøn kurve), som viser CD8 + celle-proliferation.

Figur 1
Figur 1. Neutrofil morfologi. Lysmikroskopi billede af høj massefylde (A) og lav massefylde neutrofiler (B) farvet med Hematoxylin og Eosin (H & E) efter tilberedningen tyndtlagskro- celle. (C) A transmissionselektronmikroskopi (TEM) image af et high-density neutrofil. Baren repræsenterer 1.000 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Blood neutrofiltallet stige med tumor progression og neutrofiler erhverve en cytotoksisk fænotype. (A) Det cirkulerende neutrofile antal pr 1 ml blev talt ved FACS på forskellige dage efter tumorcelleinokulering i BALB / c-mus. Antallet af cirkulerende CD11 + Ly6G + neutrofil stiger kontinuerligt med 4T1 tumor progression. (B) 4T1 brystcarcinomceller blev co-dyrket med høj densitet neutrofiler fra enten naive mus (Tumor fri) eller 4T1-tumorbærende mus (tumorbærende) mus, eller inkuberet i medium i fravær af neutrofiler (Cont.) ved 37 ° C i 20 timer. Neutrofiler til tumorbærende mus, men ikke fra tumorfri mus, signifikant cytotoksicitet i retning 4T1-tumorceller. Fejlsøjler repræsenterer ± SEM ** p <0,01 ved hjælp af en t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

"Figur Figur 3. Indsamling af murint blod via hjertepunktur. Musen blev aflivet i en induktion kammer under langsom CO2 flow. Umiddelbart efter musen har truffet sin terminal ånde, er det lagt på ryggen og en 1 ml hepariniseret sprøjte er indsat i bunden af ​​brystbenet indtil den når hjertet. Træk langsomt på stemplet for at aspirere blodet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. neutrofile oprensning fra fuldblod. (A) 3 ml 1,077 g / ml saccharose er omhyggeligt lag oven på 3 ml 1,119 g / ml saccharose til dannelse af en diskontinuerlig gradient. Hele murine blod, fortyndet i PBS-BSA (0,5%) til et slutvolumen på 6 ml, derpå lagdelt oven på 1,077 g / ml saccharose (B) Efter en 30 min centrifugering ved 700 xg uden pause, 3 forskellige fraktioner kan iagttages.; R - røde blodlegemer i pelleten, G - den granulocytiske fraktion indeholdende high-density neutrofiler, M -. Mononukleær fraktion indeholdende mononukleære celler og lav densitet neutrofiler (C) Friskt tappet humant blod blandes med et tilsvarende volumen af Dextran 500 ( 3%) og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Den øverste fraktion, der indeholder de hvide blodlegemer (buffy coat) derpå i lag oven på 10 ml 1,077 g / ml saccharose (D) Efter en 30 min centrifugering ved 400 xg med ingen pause, kan 2 forskellige fraktioner overholdes.; R + G - pellet indeholder røde blodlegemer og high-density neutrofiler, M -. Mononukleære fraktion indeholder mononukleære celler og lav densitet neutrofiler Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5
Figur 5. Suppression af T-celleproliferation. Flowcytometri analyser viser antal CFSE-mærkede CD8 + celler dyrket i fravær af stimulus (A), efter stimulering med aCD3 antistof i fravær (B) eller nærvær af LDN (C) eller HDN (D) (E) Histogram præsentation af CFSE intensitet i CD8 + celler fra panelerne A -.. D Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofiler er de mest talrige af alle hvide blodlegemer og er de første respondenter i tilfælde af infektion og inflammation. Som sådan er de yderst følsomme over for eksterne signaler og er let aktiveres. Desuden neutrofiler har en meget kort halveringstid og en hurtig omsætning. Tilsammen udgør disse karakteristika rejser flere problemer i at arbejde med neutrofiler, således at der kræves unikke eksperimentelle strategier. For eksempel er der flere neutrofile rensning strategier, hver med sine egne fordele og ulemper.

Et afgørende skridt i arbejdet med neutrofiler er deres oprensning fra fuldblod. Neutrofiler kan oprenses effektivt ved anvendelse af enten densitetsgradienter eller antistof-baserede strategier (positive eller negative udvælgelse). Vores foretrukne metode er anvendelsen af ​​densitetsgradienter, da det giver et stort antal højt oprensede neutrofiler med minimal ikke-specifik aktivering. Men som vi viser i en nylig undersøgelse 21, with tumorprogression neutrofiler akkumulerer i stort antal i fraktionen mononukleær lav massefylde. Under disse betingelser anvendelse af en densitetsgradient danner et særdeles ren high-density neutrofil fraktion, betyder det ikke repræsentere hele cirkulerende neutrofile repertoire og en lav vægtfylde neutrofil fraktion, der er stærkt forurenet med andre mononukleære celler (lymfocytter og monocytter). Under disse omstændigheder den foretrukne fremgangsmåde er et antistof-baseret oprensning, fortrinsvis negativ selektion. Anvendelsen af ​​antistoffer til oprensning neutrofiler giver yderst rene neutrofiler og bedre repræsenterer hele cirkulerende neutrofile repertoire. Vi bemærkede imidlertid, at jo længere neutrofilerne inkuberes med antistoffer, chancerne for ikke-specifik stigning aktivering. Vi foreslår derfor, at de bedste resultater, bør antistof-baserede neutrofil rensning udføres så hurtigt som muligt. Antistof-baserede neutrofil oprensning er også den foretrukne metode, når purifying neutrofil fra væv eller tumorer.

Uanset oprensningsproceduren vælges, renhed, levedygtighed og funktionel integritet skal nøje vurderes. Renheden af ​​neutrofiler kan bestemmes ved flowcytometri under anvendelse af antistoffer, der reagerer med neutrofil overflademarkører. I mus, Ly-6G er specifik for neutrofiler, der er kendetegnet ved en CD11b + Ly-6C lav Ly-6G + F4 / 80 - fænotype. Humane neutrofiler udtrykker ikke en markør analog med Ly-6G og er ofte kendetegnet ved ekspression af CD11, CD15, CD16, og CD66b. Da neutrofiler har Fc-receptorer, disse skal blokeres, før immunfarvning. Neutrofiler kan også skelnes fra de andre hvide blodlegemer ved at have en højere SSC. Levedygtighed bør bestemmes ved slutningen af ​​rensningsprocessen (trypanblå, protokol 2.1) og bør være konsekvent over 98%. Funktionel integritet bør bestemmes af purifikation af neutrofiler fra naive mus. Disse neutrofiler er ikke aktiveret og giver ikke-cytotoksisk kontrol for tumor-indblandet neutrofiler i en co-kultur omgivelser med tumorceller (protokol 7).

Den korte halveringstid af blodneutrofiler sammen med det lave antal neutrofiler (~ 3-5 x 10 5) opnået fra 1 ml blod fra en naiv 6 - 8 uger gamle mus, har gjort det vanskeligt at udforske museblod neutrofil funktion i vitro. Neutrofile tal stige støt i tilstande af inflammation og lejlighedsvis i kræft, hvilket er en tilstand af kronisk inflammation 7. Nogle forskere har forsøgt at finde alternative kilder til neutrofiler, såsom knoglemarven 20. Et stort antal mus neutrofiler kan opnås inden for 4-24 timer efter en intraperitoneal injektion af 1 ml af en 3% thioglycollat ​​bouillon opløsning eller 1 ml af en 1 mg / ml Zymosan En opløsning i saltvand. Men disse fremkaldte neutrofiler ikke udøve enny anti-tumorigen aktivitet (upubliceret observation).

. Granot et al 6 observeret, at BALB / c-mus inokuleret orthotopisk med brystcarcinoma muse 4T1 udvikle neutrofili hvilket forværrer upon tid (figur 2A), således at 20 til 40.000.000 blodneutrofiler let kan isoleres fra 1 ml blod 3 - 4 uger post-tumorinokulation. Disse neutrofiler har erhvervet anti-tumor aktiviteter og er derfor blevet betegnet tumor-indblandet neutrofiler (TEN), for at skelne dem fra naive neutrofiler (figur 2B). Mens høj tæthed neutrofiler (HDN) er meget anti-tumorigen, low-density neutrofiler (LDN), der genereres i forbindelse med cancer, er ikke 21. High-density neutrofiler fra knoglemarv og milt fra tumorbærende mus har også antitumor-aktivitet (upublicerede data). Det skal bemærkes, at med tumorudvikling milten bliver gradvist forstørret (splenomegali), med ikrøl mængder af neutrofiler.

For at spore skæbne neutrofiler efter deres adoptiv overførsel, disse skal mærkes. Neutrofiler kan mærkes in vivo ved at injicere bromdeoxyuridin (BrdU) i tumorbærende eller naive mus 2 dage før isolation. BrdU er en analog af DNA-precursor thymidin som er inkorporeret i nysyntetiseret DNA i prolifererende celler. I tilfælde af neutrofiler, vil BrdU inkorporeres i prolifererende precursorceller, der bevarer BrdU-farvning, når differentiere til modne post-mitotiske neutrofiler. Den inkorporeret BrdU kan farves ved hjælp af specifikke anti-BrdU fluorescerende antistoffer. BrdU + celler kan derefter analyseres ved flowcytometri. En anden fremgangsmåde er at mærke de isolerede neutrofiler med en celle tracker farvestof, såsom 5-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester (CFSE). CFSE er en esterforbindelse, der kan passere gennem levedygtige cellemembraner. Det har en amino-reaktiv succinimidylgruppe, som fører til den kovalente binding af fluorescein til proteiner og andre aminogrupper i cellen og celleoverfladen. De CFSE-mærkede celler kan analyseres ved flowcytometri under anvendelse af 488 nm argon-laser. De to mærkningsteknikker forskellige i det faktum, at BrdU mærkning afhænger prolifererende precursorceller, og ikke alle cirkulerende neutrofiler vil blive mærket, hvorimod CFSE farver alle neutrofiler. Påvisning af CFSE er mere ligetil end BrdU farvning, men BrdU mærkning er et godt middel til at følge den umodne til modne neutrofile konvertering.

Vi har også beskrevet flere metoder til at bestemme den anti-tumor og anti-metastatisk funktion af neutrofiler. Disse indbefatter neutrofil depletering, neutrofil adoptiv overførsel, tumor neutralisationstest og lunge metastase såning assay. Hver af disse assays udretter et særligt aspekt af anti-tumor neutrofil-funktioner. Eksempelvis Granot et al. 6 observeret, at ved depletion af neutrofiler, er antallet af lungemetastaser i 4T1-tumorbærende mus steg, hvilket antyder en anti-metastatisk rolle neutrofiler. Ved neutrofil adoptiv overførsel, er tumorcellerne injiceret intravenøst ​​4 timer før injektion af oprenset HDN. Evnen af tumorcellerne at danne lunge- og levermetastaser følges i en tidsforløbet undersøgelse under anvendelse af en optisk in vivo imaging system. Mus, der fik HDN viste færre metastatiske foci end gjorde kontrol mus 6. I tumoren neutralisering testen, bliver tumorcellerne injiceret subkutant med eller uden HDN, tilstedeværelsen af HDN reducerer tumorvækst 21. I den metastatiske seeding assay GFP-mærkede tumorceller injiceret intravenøst ​​i kontrol- eller neutrofil-depleterede præ-metastatiske tumor-bærende mus, og evnen af ​​GFP-mærkede celler til frø i lungen bestemmes. Lungerne hos præ-metastatiske tumorbærende mus er kendetegnet ved høj neutrofil infiltration, der forhindrer tumorcellepodning i det specifikke organ 6. Dette svarer til mere metastatiske foci i neutrofil-depleterede mus sammenlignet med kontrolpersoner tumorbærende mus.

Protokollerne beskrevet fokus på at studere neutrofil funktion i forbindelse med cancer og give strategier til at evaluere kræftrelaterede neutrofile egenskaber både in vitro og in vivo. Imidlertid neutrofil oprensningsstrategier samt nogle af de eksperimentelle fremgangsmåder beskrevet kan anvendes til at studere neutrofil funktion i en lang række eksperimentelle miljøer, hvor neutrofil spiller en kritisk rolle (dvs. inflammation og infektion).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ZG er støttet af tilskud fra I-CORE program Israel Science Foundation (Grant nr 41/11), den Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forskning Karriereudvikling Award) og CONCERN fundament. ZGF er støttet af tilskud fra Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forskning Career Development Award), Chief Scientist i Israel Ministeriet for Sundhed og Israel Lung Association.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Tags

Immunologi neutrofile isolation tumor-medrevet neutrofiler high-density neutrofiler lav massefylde neutrofiler anti-tumor cytotoksicitet BrdU mærkning CFSE mærkning luciferase assay neutrofil depletion anti-metastatisk aktivitet lunge metastatisk såning assay neutrofil adoptiv overførsel.
Isolering og karakterisering af neutrofiler med antitumoregenskaber
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sionov, R. V., Assi, S.,… More

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter