Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Abstract

Nötrofiller insan dolaşımda bulunan tüm beyaz kan hücreleri en çok bulunan, mikroorganizmalara karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, nötrofiller, tümör hücrelerinin immün gözetim merkezi bir rol oynar. Bunlar ya hidrojen peroksit ya da antikor-bağımlı hücre-aracılı sitotoksisite (ADCC) yoluyla kapsayan bir hücre teması-bağımlı mekanizma yoluyla tümör hücre ölümünü tümör hücrelerini tanıyan ve indükleme yeteneğine sahiptir. Anti-tümör aktivitesi olan nötrofiller, kanser hastalarının ve tümör taşıyan farelerin periferal kanından izole edilebilir. Bu nötrofiller önemli bir tümör sitotoksik aktivite gösteren sağlıklı bireylerden veya naif farelerin nötrofillerden ayırmak için, tümör tutulan nötrofilleri (TEN) olarak adlandırılır. Diğer beyaz kan hücreleri ile karşılaştırıldığında, nötrofiller, bir yoğunluk gradyanına tabi tutulduğunda bu mümkün a>% 98 saf nötrofil popülasyonu elde etmek için olan farklı kaldırma kuvveti göstermektedir. Bununla birlikte, ek olarakNormal yüksek yoğunluklu nötrofil nüfus (HDN) için, kanser hastalarında tümör-taşıyan farelerde, hem de kronik iltihaplı koşullar altında, belirgin bir düşük yoğunluklu nötrofil popülasyonları (LDN) dolaşım görünür. LDN mononükleer fraksiyonu ile birlikte arındırmak ve pozitif ya da negatif seçim stratejileri kullanılarak, tek çekirdekli hücrelerden ayrılabilir. Yalıtılmış nötrofiller saflığı akış sitometrisi ile belirlendikten sonra, bunlar, in vitro ve in vivo fonksiyonel deneylerde kullanılabilir. Biz, nötrofil, anti-tümör aktivitesini izlemek için yeteneklerini geçirmek için ve reaktif oksijen türlerini üretmek için, yanı sıra fagositik kapasitesi ex vivo olarak izleme teknikleri tarif eder. Biz ayrıca in vivo izlenmesi için nötrofilleri etiketlemek için teknikleri açıklar, ve in vivo olarak anti-metastatik kapasitesini belirlemek için. Bütün bu teknikler elde etmek ve anti-tümör ile karakterize nötrofilleri nasıl anlamak için gereklidirişlevi.

Introduction

Nötrofiller başlangıçta işgal mikroorganizmalara karşı ilk savunma hattı olarak hizmet doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak karakterize edildi. Bugün, nötrofiller daha fazla işlevleri geniş kapsamlı olduğu bilinmektedir, yabancı antijenlere karşı 1,2 adaptif immün yanıtları montaj hematopoezisi 3, anjiyogenez 4 düzenleyen ve 5 yara iyileşme müdahil olma. Buna ek olarak, nötrofiller bunların pro- ve anti-tümör faaliyetleri 6,7 sayesinde, tümör büyümesi ve metastaz ilerlemesini etkileyebilir. Nötrofiller, bir polimorfik segmentli çekirdeği ile karakterize edilir (bu nedenle polimorfonükleer (PMN) lökositlerin olarak da adlandırılır) ve en az üç granül ayrı alt sınıfları gibi salgı vezikülleri 8 (Şekil 1A-C) ihtiva ederler.

Nötrofiller, yüksek fagositik kapasitesi ve mikrobiyal ortadan kaldırılması için kritik yükseğe NADPH oksidaz aktiviteye sahip olan, ve en önemli kemokinlerin geniş salgılayanEk nötrofil ve inflamasyon 8,9 sitesine diğer bağışıklık hücrelerinin çekiş. Nötrofiller Toll benzeri reseptörler (TLR), dahil olmak üzere, yüzey reseptörleri büyük miktarda ekspresyonu ile karakterize edilir, C-tipi lektin Reseptörler (CLRs), reseptörü 3 (CD11b / CD18) ve diğer yapışma molekülleri (örneğin, L-selektin güzelleştirmek LFA-1, VLA-4 ve karsinoembriyonik antijen-ilişkili hücre adezyon molekülü 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokin reseptörleri (örneğin, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemo-çekici reseptörleri (örneğin, PAFR, LTB4 R ve C5aR) , sitokin reseptörleri (örneğin, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR) reseptörleri (örneğin, FPR1-3) peptit formil ve Fc reseptörleri (örneğin, CD16 (FcyRIII İnsan nötrofil CD11b, CD15, CD16 ve CD66b lökosit işaretlerini kullanarak tanımlanır ise), CD32 (FcyRII) ve CD64 (FcyRI) 10. farelerde, nötrofiller genellikle, CD11b + Ly6G + olarak tanımlanır. Ayrıca, genel olarak doku içinde nötrofillerin tespiti için granül proteinleri miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (KD) için leke kabul edilmektedir.

Bu nötrofillerin farklı fonksiyonları aynı hücre ya da farklı hücre alt popülasyonları aracılık olup olmadığını hala belirsiz. Toplanan veriler pro-enflamatuar uyarıcı ve mikro-11,12 etkilenen plastisite yüksek derecede gösteren heterojen bir nötrofil nüfusu varlığı açısından göstermektedir. Fridlender ve ark., 13 fena halde yanlısı tümör özelliklere sahip, anti-tümör özellikleri ve N2 N1 olarak adlandırılan iki ana alt popülasyonları içine kanserinde nötrofillerin ayırdık. Kanserde, hem de kronik inflamasyon, T hücresi tepkilerini 14 bastırmak granülositik miyeloid kökenli bastırıcı hücreler (G-MDSCs) arasında oluşan ek bir alt-nüfusu vardır. G-MDSCs bir CD11b + LY6C ile karakterize edilen olgunlaşmamış miyeloid hücreler olduğu düşünülmektedirFarelerde 15 düşük Ly6G merhaba fenotip, insan 16 bir CD15 + / CD16 düşük fenotip yerken. G-MDSCs normal dolaşım nötrofil daha sitokinler ve kemokinlerin ise daha düşük düzeylerde arginaz ve miyeloperoksidaz yüksek seviyeleri ifade etmedi. Onlar daha az fagositer ve göçmen ama ROS 15,17,18 yüksek seviyelerde üretir. Mevcut yazıda anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bazı temel metodolojileri anlatacağız.

Nötrofiller insan dolaşımda tüm beyaz kan hücrelerinin büyük nüfusa teşkil ederken (45-70%; 1,800 - 6,000 / ul) -; 300-500 / ul% 15, farelerde, normal şartlar altında, 10 (yerine seyrek ). inflamasyon üzerine ve bazen kronik inflamasyon 7 bir devleti temsil kanser, istikrarlı nötrofil sayısı artar. Nötrofiller multipotent ortak miyeloid öncüsü (CMP) ce gelişirmiyeloblast aşamalarını (MB) promiyelositlerin (PM), miyelositler (MC), metamyelocytes (MM) ve bant hücreleri (BC) geçen bir farklılaşma sürecinde kemik iliğinde LLS, 8. Onlar dolaşıma 8 yayınlanmadan önce 7 gün - olgun, post-mitotik nötrofil 4 kemik iliği içinde kalabilir. Inflamatuar koşullarda uzatılabilir 12 saat, - kanda nötrofil cirosu 6 ortalama yarılanma ömrü genellikle hızlıdır. Uyarılmamış nötrofil forbol ester forbol 12 onları teşhir ederek, anti-tümörijenik aktivite, kemokinler, IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 ve CXCL5 6,19 veya yapay naif nötrofillerin açığa elde edilebilir bir özellik, sınırlı -myristate 13-asetat (PMA) 6.

nötrofil sayısının düşük birlikte kan nötrofillerinin kısa yarı ömrü (~ 3-5 10 5 x) naif 6 1 ml kandan elde - 8 hafta eski fare, bunu yaptıkzordur, in vitro olarak farenin nötrofil dolaşım fonksiyonunu keşfetmek için. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, diğer kaynaklar kullanılmaktadır. Örneğin, nötrofillerin büyük çoğunluğunun (tiyoglikolat suyu veya zimosan bir intraperitoneal enjeksiyondan sonra gibi), kemik iliği 20 veya steril enflamasyonun indüksiyonu, aşağıdaki periton elde edilebilir. Bu periton boşluğuna elde edilen nötrofiller herhangi bir anti-tümörijenik aktiviteye (yayınlanmamış gözlem) uygulamayın olmadığını belirtmek gerekir.

. 40 milyon kan nötrofilleri de kolayca 1 mi kanından izole edilebilir - Granot ark 6 BALB / c fareleri, 20 olacak şekilde, tümör ilerlemesi 6 (Şekil 2A) ile birlikte ağırlaştırmaktadır nötrofili geliştirmek Fare 4T1 meme karsinomu hücre soyu ile aşılanır ortotopikal görülmektedir 3-4 hafta sonrası tümör aşılama. Bu nötrofiller anti-tümör aktiviteleri edindikleri ve buna göre coi olmuşturamacıyla tanımlanmış tümör tutulan nötrofiller (TEN), saf nötrofil 6 (Şekil 2B) ayırt etmek için. Yüksek yoğunluklu nötrofiller (HDN, Şekil 1A) yüksek bir anti-tümör oluşturucu birlikte, kanser bağlamında üretilen düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN, Şekil 1B) 21 değildir. Aynı zamanda, tümör taşıyan farelerin kemik iliği ve dalak yüksek yoğunluklu nötrofil, anti-tümör aktivitesi (yayınlanmamış veriler) sahiptir. Nötrofil artan miktarları ile, tümör progresyonu ile dalak, giderek büyüyen (splenomegali) haline unutulmamalıdır.

TEN spontan (MMTV PyMT ve MMTV Wnt1 meme tümörleri ve K-ras tahrik akciğer tümörlerinin) her iki dahil olmak üzere, diğer kanser modellerinde oluşturulur ve AT-3 (MMTV PyMT) ve E0771 meme karsinomu (enjekte edilir unutulmamalıdır Hücreler, LLC Lewis akciğer karsinoma hücreleri ve B16-F10 melanoma hücreleri) içerir. Bu tum nötrofil seferberlik Ancak, kapsamı3 hafta sonra 1 ml kanda 10 x 10 6 nötrofilleri - ya da modeller 5 ulaşan 4T1-aşılanmış farelerde çok daha azdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlar: 5-7 haftalık BALB / c fareleri, Harlan (İsrail) satın alınır. Hayvanlarla ilgili tüm deneyler İbrani Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. İnsan örnekler: kanser hastaları ve sağlıklı gönüllülerin kan toplama Hadassah Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından onaylanmıştır.

Bir göğüs kanseri fare modeli kullanılarak in vivo anti-tümör özellikleri olan nötrofillerin 1. indüksiyonu.

NOT: Tüm adımlar laminar hava akımı (LAF) Biyo-Güvenlik kabinesinde steril çözümleri kullanılarak yapılmalıdır.

  1. 10 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı ml (DMEM)% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile desteklenmiş 4.5 g / L D-glikoz ihtiva eden, 2 mM D- 100 mm doku kültürü plakası Tohum 5 x 10 5 4T1 hücreleri glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin sülfat. Th inkübe3-4 gün için% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C 'de E hücresi. Deney gününde,% 100 konfluent - hücreleri 50 olduğundan emin olun.
  2. Doku kültür plakalarında tümör hücreleri ayırmak için, 5 mi, PBS ile yıkama hücreleri, kültür ortamı aspire PBS aspire ve 2.5 g / L tripsin çözeltisi 3 ml. 37 ºC tripsin ile 3 dakika - Hücreler 2 inkübe edin.
  3. Tüm hücreler müstakil edilene kadar yukarı ve aşağı tripsin ve pipet nötralize etmek için 10 mi, serum-içeren ortam ekleyin. 15 ml konik santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Hücre peleti üzerinde 200 ul ortam terk orta aspire. Kalıntı hacme hücrelerin yeniden süspanse edin ve 10 ml PBS ilave edin. Homojen bir hücre süspansiyonu elde ve bir hemasitometre hücreleri saymak için 10 ul almak için 3 kez - tüpü 2 ters çevirin. Canlı ve ölü hücreleri arasında ayrım yapmak için tripan mavisi kullanarak. Oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. PBS aspire ve 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tek hücre süspansiyonu hiçbir topaklanma olduğundan emin olun.
  5. Enjekte 1 x 10 6 4T1 hücreleri veya lusiferaz sentezleyen ortotopikal 30G x 8 mm iğne ile 0.3 ml şırınga kullanılarak dişi BALB / c farelerinin sol inguinal ve memenin yağlı pedine 50 ul PBS içinde 4T1 hücreleri.
    1. % 100 oksijen - (% 5 3) enjeksiyonu öncesi, izofluran yavaş akış hızı alan bir indüksiyon odasında fareler uyutmak.
    2. Steril cerrahi pad üzerinde fare Lay ve kafa düzgün izofluran burun konisi içine yerleştirildiğinden emin olun. Pençe kısma doğru anestezi onaylayın. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. Enjeksiyon yeri çevresinde saç Tıraş ve% 70 EtOH ile dezenfekte edin.
    3. Küçük bir yatay kesi yapmak için cerrahi araçlar steril seti kullanın (5 mm) yaklkasık ve karın meme arasındaki imately yarım, yağ yastığı ortaya çıkarmak ve 50 ul 1 x 10 6 4T1 hücreleri enjekte edilir. Bir hafta sonra kaldırılması gerektiğini 9 mm klipleri ile kesiler kapatın. Lusiferaz sentezleyen hücrelerin enjeksiyonu biyoluminesans görüntüleme tümör boyutu ve metastaz izlenmesine olanak sağlar.
      Not: Bu minimal invaziv prosedür herhangi ameliyat sonrası tedavi gerektirmez ve enjekte edilen fareler 2 içinde iyileşir - 3 dk.
    4. Onlar bilinci yeniden kadar fareler Monitör ve diğer farelerin şirket katılmadan önce tam bilincini kazanmak emin olun.
  6. 3 Sonra - 4 hafta, primer tümör 2 cm 3 hacme ulaştığında, yavaş CO 2 akışı ile fareler kurban ve hemen son nefesini sonra, bir 25G x 5/8 'iğne kullanılarak kalp ponksiyonu ile kan almak Heparin ile önceden işleme tabi tutulmuş, 1 ml tüberkülin şırıngaya bağlanır. Takarken yukarı iğne ağzını tutunaşırı basınç (Şekil 3) kaçınarak kan çizmek yavaş ve kademeli kalbe doğru diyafram üzerinden yatay konumda şırınga ve.

2. Nötrofil İzolasyon

  1. Tümör taşıyan farelerin kanından sitotoksik nötrofillerin izolasyonu.
    1. Bir tümör taşıyan fareden hazırlanan 1 ml'lik kan seyreltin PBS 6 ml 'lik bir nihai hacme, büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) (ağ / hac)% 0.5 (protokol 1.11 bakınız).
    2. Taze hazırlanmış süreksiz sükroz gradyanı üzerinde seyreltilmiş kan fraksiyonlama:
      1. 15 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpünün tabanına steril filtrelenmiş sakroz 1.119 g / ml arasında 3 ml ekleyin.
      2. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, 1.119 g / ml tabakanın üzerine steril filtre edildi sakroz 1.077 g / ml tabakası 3 mi. Daha sonra, 1.077 g / ml tabakanın (Şekil 4A) üzerine yavaş ve dikkatli bir şekilde seyreltilmiş kan (Protokol 2.1.1) 6 ml ekleyin. Bu eğik tüp tutmak için tavsiye ve birborunun alt duvarına doğru pipet ağız tutmak, yavaş ama sürekli bir akışla farklı bileşenleri dding, herhangi bir türbülans oluşturacak şekilde.
    3. Fren RT'de 30 dakika boyunca 700 xg'de sükroz gradyanı üzerinde seyreltilmiş kan içeren tüp santrifüjleyin.
    4. Dikkatle herhangi bir türbülans neden olmadan santrifüj tüp kaldırmak. Eritrositlerin çoğu tüpün alt kısmında olacak. Düşük yoğunluklu lökositler bulunurlar iken yüksek yoğunluklu nötrofil (HDN), 1.119 g / ml (3 mi işareti civarında) 1.077 g / ml tabakalar arasındaki ara yüzeyde bir beyaz-kırmızı halka olarak bulunur 1.077g / ml tabaka ve BSA içeren PBS arasındaki arayüzde, beyaz bir halka (6 mi işareti etrafında, Şekil 4B).
    5. Düşük yoğunluklu hücre katmanının üstüne 5 mm ulaşıncaya kadar PBS +% 0.5 BSA aspire. Yavaş yavaş hücreleri etrafında dönen yoluyla 1 ml ucu içine yavaş emilerek düşük yoğunluklu hücreleri pipetle.% 0.5 BSA içeren PBS içinde 30 ml hücre transfer edin.
    6. Yüksek yoğunluklu hücre bandının üstünde 5 mm ulaşıncaya kadar aynı degrade tüp üst katman aspire. Çoğunlukla, yüksek yoğunluklu nötrofillerdir yüksek yoğunluklu hücreleri üzerinden Pipet, ve% 0.5 BSA ihtiva eden PBS içinde 30 ml hücre transfer edin.
    7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
    8. 30 saniye için 36 ml steril HPLC dereceli su içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla süpernatan ve lize eritrositleri aspire. İzotonisite 5x 9 ml ekleyerek restore edilmelidir PBS% 2.5 (ağırlık / hacim) BSA ile takviye edilmiş konsantre edildi.
    9. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
    10. Süpernatanı havalandırın, ve PBS-BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre içinde nötrofillerin sayısını ve canlı ve ölü hücreleri arasında ayrım yapmak için tripan mavisi kullanın.
    11. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de hücreleri santrifüj ve nihai hücre yoğunluğu istenen inkübasyon ortamı içinde nötrofillerin tekrar süspansiyon. KullanımHemen nötrofiller bulunmaktadır.
    12. Daha sonra, bir santrifüj işleminden sonra, nihai hücre yoğunluğu kuluçka ortamı içinde nötrofillerin tekrar süspansiyon. Hemen nötrofil kullanın.
  2. Kanser hastalarından nötrofillerin dolaşımdaki izolasyonu.
    1. Salin içinde% 3 Dekstran T500 bir eşit hacmi ile Heparinli (20 U / ml) insan kanı 10 ml karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Bu kuluçka sırasında eritrosit tortu olacaktır.
    2. 10 mi sukroz 1.077 g / ml ile 50 ml konik polipropilen tüpü hazırlayın yavaş yavaş 1,077 g / ml sükroz katman (Şekil 4C) üstüne lökosit bakımından zengin süpernatant tabakası.
    3. Fren RT'de 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. yüksek yoğunluklu nötrofil (HDN) pelet görünecektir. Düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) 1.077 g / ml sükroz tabaka ve plazma (Şekil 4D) arasındaki arayüzde monositler ve lenfositler ile birlikte saflaştırılması.
    4. 10 ml 0 nötrofilleri yeniden süspanse edin.30 saniye için% 2 NaCl kirletici, eritrositleri lizise uğratmak ve% 1.6 NaCl, 10 ml ilave edilerek izotonikliğe geri ve bir kez ters çevirin.
    5. Santrifüj 5, oda sıcaklığında 160 xg'de dakika, ve 20 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra Santrifüj ve süpernatant aspire.
    6. Nötrofilleri sayın ve ml veya arzu edildiği gibi, 2 x 10 6 nötrofil /% 2 FBS ile takviye edilmiş RPMI-1640 içinde tekrar süspansiyon hücreleri.

Manyetik Boncuk Kullanarak Kan Nötrofiller 3. zenginleştirilmesi

  1. Pozitif seçim
    1. Heparinize şırınga ile, Protokol 1.8 de tarif edildiği gibi bir fareden kan 1 ml alın.
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de 15 ml konik bir tüp içinde kan santrifüjleyin.
    3. Süpernatantı aspire veya ileri çalışmalar için kan plazması tutun.
    4. Lyse 8 mi, HPLC-dereceli su içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla eritrositler. 30 saniye sonra 5x conce 2 ml ekleyerek izotonikliğe gerintrated PBS% 2.5 BSA ihtiva eden. Hücreleri saymak.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
    6. % 0.5 BSA ve 10 8 hücre başına 2 mM EDTA ihtiva eden 200 ul PBS içinde hücre pelletini.
    7. Biyotinile anti-Ly6G antikorun 50 ul ekle. İyice karıştırın ve (değil buz üzerinde) buzdolabında 10 dakika inkübe edilir.
    8. Gibi soğuk PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden 150 ul ekle.
    9. Vortex anti-biyotin kaplı manyetik microbead stok solüsyonu. Hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. İyice karıştırın ve (değil buz üzerinde) buzdolabında 15 dakika inkübe edilir.
    10. 10 ml PBS, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA, ve santrifüj ihtiva eden ekleyerek hücreleri yıkanır.
    11. % 0.5 BSA, 2 mM EDTA ihtiva eden 500 ul soğuk PBS aspire tamamen süpernatan ve süspansiyon haline getirin.
    12. Manyetik bir stand bağlı bir mıknatıs tutucu içine bir manyetik ayırma sütun takın ve 500 ul soğuk PBS 0 içeren ile durulayın.% 5 BSA ve 2 mM EDTA.
    13. Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. akış etiketsiz LyG6-negatif hücreleri içerir.
    14. 500 ul PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden ile kolon yıkayın. Ek etiketlenmemiş hücreler boyunca akış olacaktır.
    15. Başka bir 500 ul PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden yıkama adımı tekrar edin.
    16. Mıknatıstan sütun çıkarın ve 15 ml toplama tüpü üzerine yerleştirin. PBS% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml ekleyin ve iyice sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın. akış yoluyla Ly6G + nötrofilleri içerir.
  2. Negatif seçim
    1. Adımlar 3.1.5 için 3.1.1 uyarınca kan lökositleri hazırlayın.
    2. Süspanse 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpü içinde% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml PBS içinde 1 x 10 8 hücreleri.
    3. 50 ul normal sıçan serumu ekleyin.
    4. Nötrofil zenginleştirme c 50 ul ekleyinocktail (non-nötrofil, beyaz kan hücreleri için spesifik olan biyotinlenmiş antikorlar ihtiva eden), iyice karıştırın ve buzdolabında 15 dakika inkübe edilir.
    5. 4 eklenerek ml PBS, 10 dakika boyunca% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ve santrifüj 400 xg içeren hücreleri yıkanır.
    6. Süpernatant atılır ve 1 ml PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden hücrelerin tekrar süspansiyon.
    7. Biotin ve dekstran karşı tetramerik antikor komplekslerinin 50 ul ekle. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika inkübe edilir.
    8. Hücre süspansiyonu 150 ul ilave edilmeden önce dekstran-kaplı manyetik boncuklar içeren vorteks de tüpü. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika kuluçkaya yatmaktadır.
    9. PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden eklenerek 2.5 ml'lik toplam hacme kadar hücre süspansiyonu getirin. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için yavaşça karıştırın.
    10. Mıknatıs içine (kapağın olmadan) tüp takın ve 3 dakika boyunca bekletin.
    11. Sürekli birinde tüp ile mıknatıs ters çevirinHareket sıvısında bağlanmamış hücreler yeni bir tüpe aktarılır şekilde. 2 ters mıknatıs ve tüp bırakın - 3 saniye sonra dik konuma getirin. Bağlanmamış nötrofil transfer sıvısı içinde olacak ise manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin, istenmeyen orijinal tüpün duvarına bağlanmış kalır.

Nötrofiller 4. Sitolojik Boyama

  1. 50 ul PBS içinde 1x10 5 nötrofilleri yeniden süspanse edin ve bir Cytospin gibi ince tabakalı hücre hazırlama adaptörüne hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 150 x g'de adaptörü santrifüj. Adaptörden önceden etiketlenmiş cam slayt ayırın.
  2. 2 dakika boyunca% 70 etanol içinde cam slaytlar daldırma hücreleri saptamak. Adaptörü (adım 4.1) den hazırlıklar boyamadan önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Distile su içinde 6 kez - slaytlar 5 batırın.
  3. Mayer'in Hematoksilin çözeltisi içinde 2 dk - 1 Leke. Musluk suyunda 1 dakika durulayın. Eosin Y çözeltisi içinde 10 sn Leke . Tap suda yıkayın. Etanol artan konsantrasyonlarda slaytlar (% 70,% 96 ve% 100) durulama ile kurutmak. Kısa bir süre cam slaytlar hava kurumasını bekleyin ve bir ışık mikroskobu altında slaytlar inceleyin.
    NOT: eozin pembe ve spesifik olmayan proteinler leke oysa Hematoxylin, derin mavi-mor renk ve leke nükleik asitler vardır. nötrofil sitoplazmik granüller 'nötr olmaya sevgi dolu' adı kökenli olan asidik veya bazik boyalarla tarafından lekesiz kalır. Hematoksilen ve eozin ve eosinophilc ile bazofilik granülositler leke koyu mavi parlak kırmızı granülositler Oysa, nötrofiller nötr pembe (Şekil 1A bakınız) görünür. 5 loblar 'segmentli nötrofil' (Şekil 1 A ve 1 C) - olgun nötrofiller 2 büyük genel olarak, bir polimorf çekirdeği ile karakterize edilir. Olgunlaşmamış nötrofiller bir loblu kavisli veya halka şeklinde bir çekirdeğe (Şekil 1B) ile karakterize edilir.
ve_title "> 5. Akış Sitometrisi ile Nötrofiller Saflık Tayini.

  1. FACS tampon maddesi içinde 100 ul (PBS,% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve% 0.02 NaN3 ihtiva eden) içinde 1x10 6 tekrar süspansiyon hücreleri. Boyama (3.1.5 için 3.1.1 adımları) önce tam kan örnekleri için, hemoliz gereklidir. 5 dakika boyunca FcR bloke edici ayıracı 10 ul ekle.
  2. İnsan nötrofil fare nötrofiller ya da CD11b ve CD66b için Ly-6G bir spesifikliği olan flüoresan etiketli antikorun 0.5 ug ekleyin karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
  3. PBS% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA içeren 500 ul ses seviyesini ayarlama ve flow sitometri boyama analiz.

In vivo 6. Takip Nötrofil Kapı

  1. Nötrofillerin in vivo BrdU etiketleme
    1. Tümör taşıyan farelere intraperitonal olarak, steril PBS içinde 10 mg / ml bromodeoksiüridin (BrdU) çözeltisi 100 ul enjekte edilir.
    2. Kan nötrofillerinin 48 saat enjeksiyon sonrası a yalıtmakProtokole 2.1 şeklinizi ona göre. Leke, bir BrdU akış kiti kullanılarak nötrofiller BrdU-etiketli.
  2. Nötrofil CFSE markalama
    1. Önceden ısıtılmış 1 ml PBS, 10 7 nötrofilleri yeniden süspanse edin.
    2. 10 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar süspanse nötrofiller için 5 mM CFSE stok çözeltisi 2 ul ekle. İyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 1 mi DMSO içinde 5 mM CFSE 2.8 CFSE mg (Carboxyfluorescein diasetat, süksinimidil ester, -) - 5- (ve 6) eritilmesi ile hazırlanır. -20 ° C'de karanlıkta, steril 200 ul tüpleri ve deposunda 10 ul alikotları bölünür.
    3. % 10 FBS ihtiva eden RPMI-1640 içinde eşit hacmi eklenerek aşırı CFSE nötralize. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin nötrofillerin. % 10 FBS ihtiva eden RPMI-1640, 10 ml iki kez nötrofilleri yıkayın.
    4. PBS, uygun bir hacim içinde, 10 dakika ve tekrar süspansiyon boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Nötrofiller (örneğin, 1 x 10 7

7. In vitro Lüsiferaz Tahlili İzole Nötrofiller Anti-tümör Aktivite Monitör.

  1. Protokol 1.1-1.5 bölgesindeki 4T1 hücreleri için tarif edildiği şekilde lusiferaz etiketli tümör hücrelerini yetiştirmek ancak% 2 FBS ile takviye edilmiş optimum düşük serum ortamı içinde tripsin ayrışmış hücreler tekrar süspansiyon. Ml başına 5 x 10 4 hücrelere hücre yoğunluğu ayarlayın.
  2. 100 ul Tohum 5000 lusiferaz etiketli tümör hücreleri, beyaz bir 96 düz-tabanlı doku kültürü çukurlu bir levhanın her çukuruna% 0.5 FBS ihtiva eden, düşük serum ortamı optimize edilmiştir.
  3. 4 saat tümör hücrelerini tohumlama sonra,% 0.5 FBS içeren azaltılmış serum orta optimize 50 ul 1 x 10 5 nötrofilleri ekleyin ve / N O kuluçkaya yatmaktadır. 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunluğa sahip bir nötrofil hücre süspansiyonu hazırlanır. Kontrol kuyuları nötrofiller olmadan 50 ul orta almalısınız. DoHer bir deneysel ortamda çok sayıda tekrarlanır.
  4. Ertesi sabah hafifçe süpernatant aspire ve 200 ul PBS ile her iyi yıkayın. PBS aspire ve pasif lizis tamponu 50 ul ekle. (Örneğin, AT-3 hücreleri gibi) kolayca ayırma hücreler için, PBS içinde yıkama yoktur ve büyüme ortamı aspire hemen sonra hücre kültürü lisis tamponu ilave edin.
  5. Alüminyum folyo ile plaka Kapak ve oda sıcaklığında 20 dakika süre ile 150 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
  6. Bir parlaklık plaka okuyucu plaka koyun. İyi bilge 50 ul lusiferaz tahlil çözümü enjekte ve oyuk başına 10 saniye boyunca kemilüminesansını okuyun.
  7. Aşağıdaki formül ile% tümör lizis hesaplayın:% tümör lizis = (1- [nötrofiller örneklerinin ışıldama] / [ortam içinde numune lüminesan]) x% 100.

NOT: protokolde 8.1 anlatıldığı gibi metastatik tohumlama nötrofillerin katkısını değerlendirmek için, nötrofiller tükenmiş olabilir. Etkili depl içinetion gün 7 sonrası tümör engraftment başlayan nötrofil tüketen antikorlar yönetmek.

Bir göğüs kanseri Fare Modeli Nötrofiller 8. Anti-Metastatik Etkinliği.

  1. Nötrofillerin tükenmesi in vivo olarak.
    1. Taze fare başına 100 ul nihai bir hacimde serum fizyolojik içinde sıçan anti-Ly6G antikoru 12.5 ug (nötrofil antikor) veya sıçan izotip kontrol antikoru (IgG 2a, Κ) hazırlanması.
    2. 3. gün sonrası tümör melezleme başlayarak günlük olarak 12.5 ug fare anti-Ly6G antikoru (100 ul) bir karın içi dozu enjekte edilir. Kontrol ile fareler veya 12.5 ug (100 ul) fare izotip kontrol antikoru (IgG 2a, Κ) enjekte edilir.
    3. 4T1 Tümör büyüdükçe nötrofil üretim hızı önemli ölçüde arttıkça 14. günde başlayarak, günde iki kez antikorlar yönetmek.
    4. Lateral kuyruk ven nicking ile - (3 damla 2) Her gün, bir kan örneği almak. Bir anti-içine kan toplayın-coagulant içeren tüp (heparin, sitrat ya da EDTA).
    5. Protokol 5'te tarif edildiği gibi akış sitometrisi kullanılarak, nötrofil tükenmesi kontrol edin.
  2. Tümör Nötralizasyon Testi (Winn Assay Modifiye)
    1. Tümör taşıyan farelerin nötrofillerin izole edin. 1 x 10 6 tümör hücreleri ve 3 x 10 6 nötrofilleri (fare başına) 50 ul tuzlu su içinde karıştırın.
    2. 8 haftalık yerli Balb / c fareleri, - deri altından 6 kanadını hücreleri enjekte edilir. Tümör büyüklüğü doğru ölçümler sağlamak için tümör engraftment öncesinde kanadını tıraş. Gün 5 post-engraftment tümör boyutu, günlük başlangıç ​​ölçün.
  3. Nötrofil Evlatlık Transferi
    1. Kuyruk damarından 200 ul PBS içinde 2 x 10 4 lusiferaz sentezleyen tümör hücreleri enjekte edilir.
    2. Nötrofil transferi tümör hücre enjeksiyonu takiben 4 saat yapılmalıdır. Bu nedenle, yaklaşık 2 saat planlanan onların önce tümör taşıyan farelere (protokol 2.1) den HDN arıtılmasını başlatmakin vivo aktarımı. 2.5 x 10 7 hücre / ml 'lik bir son konsantrasyonda PBS içinde nötrofillerin yeniden süspanse edin.
    3. Tümör hücrelerini tanıtan sonra 4 saat, 5 dakika için bir ısı lambası altında fareler yerleştirin. Bir süzgeç fareler yerleştirin ve kuyruk damarından 5 x 10 6 HDN (200 ul) enjekte edilir. Kontrol fareleri araç (PBS) enjekte edilmiştir.
    4. In vivo görüntüleme sisteminde veya imünohistokimya ile bir biyoışıldama kullanarak çeşitli zaman noktalarında akciğer metastazı oluşumunu izlemek.
  4. Akciğer metastatik tohumlama deneyi
    1. Protokolde 1'de açıklandığı gibi orthotopically sol inguinal meme yağ yastığı içine 1 x 10 6 ebeveyn 4T1 hücreleri - 0.5 enjekte edilir.
    2. 10. günde, 5 x 10 5 hücre / ml'lik bir son konsantrasyonda PBS GFP-ifade eden 4T1 hücreleri tekrar süspansiyon. 5 dakika için bir ısı lambası altında fareler yerleştirin.
    3. Bir süzgeç fareler yerleştirin ve 4T damar 1x10 5 GFP eksprese eden 4T1 hücreleri (200 ul) enjekte1, tümör taşıyan farelere ya da saf fareler.
    4. Ertesi gün, fareler euthanize ve kalan eritrositlerde çıkarmak için 20 mi, PBS ile akciğerlere serpmek.
    5. Immünohistokimyasal olarak GFP pozitif hücrelerin analizi için akciğerleri tüketim.
      NOT: protokolde 8.1 anlatıldığı gibi metastatik tohumlama nötrofillerin katkısını değerlendirmek için, nötrofiller tükenmiş olabilir. Etkili tükenmesi için gün 7 sonrası tümör engraftment başlayan nötrofil tüketen antikorlar yönetmek.

Tümör taşıyan fareler ile Nötrofiller, T hücresi çoğalması 9. bastırılması.

  1. 10 ml PBS içinde ötenazi saf, BALB / c fare ve yerden dalak çıkarın.
  2. RPMI-1640 ile dolu bir petri üzerinde uygun bir 40 mikron hücre süzgecinden üzerine dalak yerleştirin. Hücreler petri içine süzgeç yoluyla şırınga pistonu ucunu kullanarak, dalak ezin. 5 ml RPMI hücre süzgeç durulayın. Süzgeç atın.
  3. 10 dakika boyunca 50 ml'lik konik bir tüp ve santrifüj 400 x g'de içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın.
  4. Süpernatant atılır ve 20 sn için, saf su 36 ml süspansiyona, eritrositleri lizise uğratmak ve ekleyerek izotoniklik ayarlama 4 ml PBS x 10. Alternatif olarak, eritrosit 5 ml süspansiyona, eritrositleri lizise uğratmak konsantre edildi tampon (ACK) parçalama ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. RPMI-1640 ortamında 10 ml ilave edilerek nötralize ACK. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. 5 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve hücreleri saymak.
  5. 15 ml bir tüp içinde 4 x 10 7 hücre / 2 ml bir nihai yoğunluğa kadar PBS içinde yeniden süspanse splenositlerin. PBS içinde 2.5 uM CFSE çözeltisi 2 ml ilave edilir. Hızlı bir şekilde tüp ters ve ışıktan korunan ara sıra karıştırma ile 37 ° C (her 2 dakika) 10 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Önceden ısıtılmış FBS (% 100) 4 ml ekleyerek aşırı CFSE söndürün ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. 10 boyunca 400 x g'de PBS ve santrifüj 3 ml ilave edilirMin.
  7. 10 dakika boyunca 400 x g'de 30 mi, PBS ile hücrelerden ve santrifüj yıkayın.
  8. 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri Filtre ve PBS ile tekrar yıkayın.
  9. 2 x 10 7 hücre / ml bir nihai yoğunluk için% 10 FBS ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  10. Tohum, 2 x 10 6 / çukur (200 ul), 24 oyuklu doku kültürü plakası.
  11. % 10 FBS ile 500 | il RPMI-1640 içinde saflaştırılmış, Ermeni hamster anti-fare CD3ε antikoru 1 ug ekleyerek hücreleri uyarır.
  12. CFSE, etiketli splenositlere 10% FBS ile 300 ul RPMI-1640 içinde 2 x 10 6 HDN ya LDN ekleyin ve 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe edilir. Nötrofiller olmadan Wells 300 ul ortam almalısınız. Her oyuktaki toplam hacim 1 mi olmalıdır.
  13. Hücreleri toplamak ve flow sitometri için onları hazırlamak. 100 ul FACS tamponu (Protokol 5) hücrelerin tekrar ve FcR Engelleme Reaktif 10 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  14. Ekle 1-956. APC-konjuge anti-CD8α antikorunun L ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
  15. Akış sitometrisi (Şekil 5) tarafından CD8 + T hücreleri üzerinde CFSE floresans yoğunluğunu belirler. KAKE yoğunluğu her hücre bölünmesi üzerine yarıya düşer. Böylece, hücre bölünmesini CFSE boyama yoğunluğu ile tespit edilebilir.

10. Nötrofil Göç Deneyi

  1. Düşük serum ortamı 25 cm 2 doku kültürü şişesi içinde% 0.5 FBS ile takviye edilmiş ve 37 ° C'de 24 saat inkübe optimize 7 ml tohum 5x10 5 4T1 hücreleri.
  2. 5 um'lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir geçiş levhasının alt bölmeye süpernatan 800 ul aktarın.
  3. Süspanse% 0.5 FBS ile takviye edilmiş optimum düşük serum ortamında 400 ul 2 x 10 5 nötrofiller bulunmaktadır. Üst bölmeye hücre süspansiyonunu 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
  4. İnkübasyonun sonunda, üst bölmenin kaldırıpAlt bölmeye giden nötrofillerin sayısı.

Reaktif oksijen türlerinin 11. İzleme Nötrofil Üretimi (ROS).

  1. Fenol kırmızısı olmaksızın Hank dengeli tuz çözeltisi içinde 1.1 x 10 6 nötrofil / ml hazırlayın. Plaka, beyaz bir 96 düz-tabanlı bir kuyu tabakasına her çukuruna 2 x 10 5 nötrofilleri ihtiva eden 180 ul.
  2. Bir parlaklık plaka okuyucu plaka koyun. 50 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğa, PBS içinde 500 uM luminol çözeltisinin 20 ul ekle. 10 saniyelik aralıklarla, 5 dakikalık bir zaman akışı içinde 1 sn içinde taban kemilüminesans okuyun.
  3. (10 uM arasında bir konsantrasyonda 10 nM veya 100 nM ya da fMLP bir konsantrasyonda, örneğin, PMA) bir uyarıcı ekleme. Fenol kırmızısı olmaksızın Hank dengeli tuz çözeltisi içinde, her maddenin bir 10x konsantre çözelti hazırlamak ve ilgili kuyucuklara 22 ul ekle. Kontrol etmek için kuyu 22 ul aracı ekleyin.
  4. Measuplaka okuyucu kemilüminesans yeniden. Kısa (5 dakika boyunca her 10 sn) ve uzun bir süre ders (1 saat için her dakika) hem de yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yeni bir çalışmada nötrofiller 6 için bir anti-metastatik fonksiyonu belirledi. Tümör taşıyan farelerin nötrofiller bir sitotoksik fenotipi edinebilir ve tümör hücrelerini 6 öldürme kapasitesine sahiptir. Bu, önemli bir anti-tümör etkisi 6 sahip naif farelerin nötrofillerin aksine bulunmaktadır. Protokol bölümünde tarif edilen tekniklerin çeşitli in vitro ve in vivo 6, anti-tümör nötrofil işlevini incelemek için kullanılmıştır.

Tümör sitotoksik nötrofiller, tümör taşıyan farelere 6 elde edilebilir. Bu amaca ulaşmak için, fareler orthotopically sol inguinal meme yağ yastığı içine 4T1 hücreleri (Protokol 1) enjekte edildi. 2 cm 3 (Şekil 3 - - Tümör sol alt karın belirgindir) gün 21 sonrası tümör aşılamadan tarafından, primer tümör 1 bir büyüklüğe ulaştı. Şu anda, farelere ötenazi uygulandı ve 1 ml kan (fare başına) alınmıştırkardiyak delme (Şekil 3) ile. Buna paralel olarak, bir naif olmayan tümör taşıyan fare kan çekildi. HDN daha sonra nötrofil yüksek ölçüde saf bir (>% 98) popülasyonu elde etmek için, bir yoğunluk gradyanı ile (Protokolü 2.1 ve Şekil 4) ile saflaştırılmıştır. Nötrofil canlılığı, tripan mavi boyama (Protokol 2.1) ile saptanmıştır. nötrofiller, daha sonra 2 x 10 6 nötrofil / ml'de% 0.5 FBS ihtiva eden optimum düşük serum ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi.

Nötrofil sitotoksisite ölçüde test etmek için, 96 düz taban beyaz 4T1 hedef hücreleri (5000 hücre / oyuk 100 ul) ifade lusiferaz için (2 x 10 6 nötrofil / ml stok çözeltisinden 50 ul), 10 5 nötrofilleri eklendi eh plakası (Protokol 7). O / N inkübasyondan sonra hücreler PBS içinde yıkandı ve pasif hücre lisis tamponu içinde lize edildi ve her bir örnek lusiferaz aktivitesi nötrofil sitotoksisite ölçüde (değerlendirmek için test edilmiştir (Şekil 2B tümör hücrelerine karşı hiçbir sitotoksisite gösterdiği bulunmuştur, bu deneysel prosedürler kullanılarak bir öldürme% = 0'a sahip farklı koşullar altında öldürülen hücrelerin% olarak sunulmaktadır tümörsüz), nötrofiller, tümör taşıyan farelerin saflaştırılmış belirgin bir sitotoksisite (Şekil 2B, tümör taşıyan) göstermektedir.

LDN HDN immün baskılayıcı özelliklerini test etmek için (Protokol 9) T-hücresi çoğalma tahlili kullanılmıştır. Biz değerlendirdiLDN mevcudiyetinde ya HDN mevcudiyetinde (Şekil 5A-D) kültürlendi CD8 + kültür yalnız muamele edilmemiş splenositlerde ve αCD3 antikoru ile tedavi edilen splenositler hücrelerin ve hücre sayısı. Anti-CD3 uyarımı şu CD8 + CFSE + hücrelerinde dramatik bir artış not baskılayıcı dramatik bir inhibitör etkisi (sağ üst A paneli ve B.) LDN (B ve C sağ üst paneli ile karşılaştırın) ve HDN engelleyici etkisinin olmaması (panel D). Ayrıca çoğalması için bir gösterge olarak, CFSE tutma ölçüde değerlendirildi. Şekil 5E'de, portakal eğrisi α ile uyarılan CD8 + hücreleri muamele edilmemiş, αCD3 antikorları ile muamele edilmiş, mavi eğri CD8 + hücreleri, CD8 + hücreleri, LDN ve yeşil eğri mevcudiyetinde αCD3 ile uyarılan kırmızı eğrisini temsil eden CD8 + hücreleri sunulur; HDN mevcudiyetinde CD3. ΑCD3 tedavi edilen hücrelerde sola kayma (mavi eğri) ve αCD3 CD8 + hücre çoğalmasını göstermek HDN (yeşil eğri) ile kültür hücreleri, tedavi unutmayın.

Şekil 1
Şekil 1. Nötrofil morfolojisi. Ince tabaka hücre preparasyonu, aşağıdaki Hematoksilin ve Eosin (H & E) ile boyandı, yüksek yoğunluklu (A) ve düşük yoğunluklu nötrofil (B) ışık mikroskobu görüntüsü. (C), bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüsü yüksek yoğunluklu nötrofil. Bar 1.000 nm temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Kan nötrofil sayımları tümör p artışrogression ve nötrofiller bir sitotoksik fenotipi edinebilir. (A), 1 ml için dolaşan nötrofıl sayısı, BALB / c farelerine tümör hücresi aşılamasından sonra çeşitli gün FACS ile sayılmıştır. sayısı dolaşımdaki CD11 + Ly6G + nötrofil sürekli 4T1 tümörün ilerlemesi ile birlikte artar. (B) 4T1 meme karsinom hücreleri, ya yerli farelerden yüksek yoğunluklu nötrofillerin (tümörsüz) ya da 4T1 Tümör taşıyan farelere (tümörlü) fareler veya inkübe ile birlikte kültürlenmiştir nötrofil yokluğunda (Dev.), 37 ° C'de 20 saat boyunca ortam içinde. Tümör taşıyan farelerde nötrofiller, ancak tümörsüz farelerden, 4T1, tümör hücrelerine karşı belirgin bir sitotoksisite göstermektedir. Hata çubukları öğrencinin t-testi kullanılarak ± SEM ** p <0.01 temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"Şekil Kalp ponksiyonu yoluyla murin kan 3. Toplama Şekil. Fare yavaş CO 2 akışı altında bir indüksiyon odasında ötenazi edildi. Fare terminal nefes aldı hemen sonra, onun sırtında serilir ve 1 ml heparinize şırınga kalbi ulaşana kadar sternum tabanına eklenir. Yavaş yavaş kan aspire pistonu çekin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Tam kandan 4. Nötrofil saflaştırma Şekil. (A), 1,077 3 ml g / ml sükroz dikkatli bir süreksiz gradyanı oluşturmak üzere 3 ml 1,119 g / ml sükroz üstünde katmanlı. 6 ml 'lik bir son hacim PBS-BSA (% 0.5) içinde seyreltilmiş Tüm kemirgen kan, 1.07 üstüne daha sonra katmanlı bir7 ug / ml sükroz (B) herhangi bir ara ile 700 x g'de 30 dakika dönüş sonra, 3 ayrı fraksiyonlar gözlenebilir.; R - pelet, G, kırmızı kan hücreleri, - yüksek yoğunluklu nötrofiller, K ihtiva eden granülositik fraksiyon -. Mononükleer hücreleri ve düşük yoğunluklu nötrofiller içeren mononükleer kısmını (C), yeni alınmış insan kan Dextran 500 (eşit hacmi ile karıştırılır ve % 3) ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. ., beyaz kan hücreleri (buffy coat) içeren üst bölüm daha sonra / ml sükroz bir ara ile 400 x g'de 30 dakika dönüş aşağıdakı (D) 2 ayrı fraksiyonlar gözlemlenebilir g, 10 mi 1,077 üstünde katmanlı; R + G - kırmızı kan hücreleri ve yüksek yoğunluklu nötrofiller, M içeren pelet -. Mononükleer hücreleri ve düşük yoğunluklu nötrofil içeren mononükleer fraksiyon bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5,
T hücresi çoğalmasının Şekil 5. Bastırma. Akış Sitometrisi yokluğunda (B) ya da LDN mevcudiyetinde αCD3 antikor ile uyarılmasının ardından, uyarıcı (A) 'nın yokluğunda kültürlenmiş CFSE etiketli CD8 + hücrelerinin sayısını gösteren analiz (C) veya HDN (D) paneller A CD8 + hücrelerin KAKE yoğunluğunun (E) Histogram sunum -.. D bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nötrofiller tüm beyaz kan hücrelerinin en bol ve enfeksiyon ve inflamasyon durumlarında ilk müdahale vardır. Gibi, onlar dış uyaranlara karşı oldukça duyarlıdır ve kolayca aktive edilir. Buna ek olarak, nötrofiller, çok kısa bir yarı-ömre ve hızlı bir dönüşüm vardır. Birlikte, bu özellikler benzersiz deneysel stratejiler gerekli şekilde nötrofil, çalışan birkaç zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birkaç nötrofil arıtma stratejileri kendi artıları ve eksileri ile her vardır.

Nötrofiller ile çalışan kritik bir adım tam kandan kendi arıtma olduğunu. Nötrofiller etkin yoğunluk gradyanları ya da antikor-bazlı stratejiler (pozitif ya da negatif seçim) kullanılarak saflaştırılabilir. Bu en az spesifik olmayan aktivasyon ile yüksek oranda saflaştırılmış nötrofillerin yüksek miktarda elde edilir çünkü tercih Bizim yöntemi yoğunluğu gradyanları kullanımıdır. Ancak, biz son çalışmada 21 gösterdiği gibi, zekâh tümör ilerlemesi nötrofiller tek çekirdekli düşük yoğunluklu fraksiyonu yüksek sayılarda birikir. Bir yoğunluk gradyanı kullanılması yüksek ölçüde saf bir yüksek yoğunluklu nötrofil fraksiyonu içerir, bu koşullar altında, yani tüm dolaşan nötrofıl repertuarı, ve ağır mononükleer hücreler (lenfositler ve monositler) ile kirlenmiş olan bir düşük yoğunluklu nötrofil fraksiyonu temsil etmez. Bu koşullar altında, tercih edilen yöntem, bir antikor-bazlı saflaştırma, tercihen de negatif seçim. nötrofilleri arındırmak için antikorların kullanımı oldukça saf nötrofilleri verir ve daha iyi tüm dolaşan nötrofil repertuarı temsil eder. Ancak, nötrofiller antikorlar, spesifik olmayan aktivasyon artış şansı ile inkübe edilir artık fark ettik. Bu nedenle en iyi sonuçları elde etmek için, antikor bazlı nötrofil arıtma mümkün olduğunca çabuk yapılması gerektiğini düşündürmektedir. Antikor bazlı nötrofil saflaştırma da pu tercih edilen yöntemdirdokular ya da tümörlerden nötrofil rifying.

Bağımsız olarak seçilen bir arıtma prosedürü, saflık, canlılığı ve fonksiyonel bütünlüğü titizlikle değerlendirilmelidir. nötrofillerin saflığı nötrofil yüzey belirteçleri ile reaksiyona giren antikorlar kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Fenotip - farede, Ly-6G, bir CD11b + Ly-6C düşük Ly-6G + F4 / 80 ile karakterize edilir nötrofiller için özeldir. İnsan nötrofilleri, Ly-6G, analog olan bir işaretleyici ifade etmez ve bu nedenle sıklıkla CD11b, CD15, CD16 ve CD66b ekspresyonu ile karakterize edilir. Nötrofiller Fc reseptörleri olduğundan, bu immün önce bloke edilmesi gerekir. Nötrofiller, aynı zamanda daha yüksek bir SSC olan diğer beyaz kan hücrelerinden ayırt edilebilir. Canlılık saflaştırma işlemi sonunda tespit edilmelidir (mavi protokol 2.1 tripan) ve% 98 daha tutarlı bir şekilde daha büyük olmalıdır. Işlevsel bütünlüğünü Puri belirlenmelidirNaif farelerin nötrofillerin Sınıflamasına. Bu nötrofil aktive edilir ve tümör hücreleri (protokol 7) ile birlikte bir kültür ortamında, tümör tutulan nötrofiller için sitotoksik olmayan kontrol sağlar değildir.

nötrofil sayısının düşük birlikte kan nötrofillerinin kısa yarı ömrü (~ 3-5 10 5 x) naif 6 1 ml kandan elde - 8 haftalık fare, fare kan nötrofil fonksiyonunu keşfetmek için zor yaptık vitro. Nötrofil numaraları kronik inflamasyon 7 bir devleti temsil kanser, istikrarlı inflamasyon devletlerinde ve bazen artar. Bazı araştırmacılar, kemik iliği 20 olarak nötrofiller için alternatif kaynaklar bulmak için çalıştık. Tuzlu su içinde bir 1 mg / ml zimosan bir çözeltinin 1% 3 tiyoglikolat suyu bir ml solüsyon ya da 1 ml intraperitoneal enjeksiyondan sonra 24 saat - Fare nötrofil sayısının yüksek 4 içinde elde edilebilir. Fakat bu ortaya çıkardı nötrofiller bir uygulamayın yokny anti-tümörijenik aktivitesi (yayınlanmamış gözlem).

. 4 hafta - 40 milyon kan nötrofilleri de kolayca 1 ml kan 3 izole edilebilir - Granot ark 6 BALB / c fareleri, öyle ki 20 zamanı (Şekil 2A) üzerine ağırlaştırmaktadır nötrofili geliştirmek Fare 4T1 meme karsinomu ortotopikal aşılanmış görülmektedir Post-tümör aşılama. Bu nötrofiller anti-tümör faaliyetleri elde etmiş, ve buna bağlı olarak naif nötrofil (Şekil 2B) ayırmak amacıyla, tümör tutulan nötrofilleri (TEN) olarak adlandırılmıştır. Yüksek yoğunluklu nötrofil (HDN) yüksek bir anti-tümör oluşturucu birlikte, kanser bağlamında üretilen düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) 21 değildir. Kemik iliği ve tümör taşıyan farelerin dalak Yüksek yoğunluklu nötrofiller, aynı zamanda, anti-tümör aktivitesi (yayınlanmamış veriler) sahiptir. Bu içinde olan, tümör progresyonu ile dalak, giderek büyüyen (splenomegali) haline unutulmamalıdırnötrofillerin miktarda katlama.

Onların evlat edinen transferi aşağıdaki nötrofillerin kaderini izlemek amacıyla, bu etiketlenmiş gerekir. Nötrofiller 2 gün, izolasyondan önce, tümör taşıyan veya naif farelere bromodeoxyuridine (BrdU) enjekte edilerek in vivo olarak etiketlenebilir. BrdU çoğalan hücrelerin yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilen DNA, ön-madde timidin bir analogudur. Nötrofil durumunda, BrdU olgun post-mitotik nötrofil içine ayırt zaman BrdU boyama korumak habercisi çoğalan hücrelerin içine dahil edilecektir. dahil BrdU özel anti-BrdU floresan antikorlar kullanılarak boyandı. BrdU + hücreler daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Başka bir yaklaşım, örneğin, 5-karboksiflüoresein N-sukinimidil ester (CFSE) gibi bir hücre izleyici boya ile Yalıtılmış nötrofiller nitelemektedir. KAKE canlı hücre zarlarının geçebilir bir ester bileşiktir. Bir amino-reaktif succinimid sahiphücre ve hücre yüzey proteinleri ve başka amino gruplarına fluoresein kovalent neden il grubu yer alır. CFSE, etiketli hücreler 488 nm argon lazeri kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilebilir. İki etiketleme teknikleri BrdU etiketleme KAKE tüm nötrofilleri leke oysa, etiketli tüm dolaşımdaki nötrofil öncül hücreleri prolifere değil bağlıdır aslında farklıdır. KAKE tespiti ancak BrdU etiketleme nötrofil dönüşüm olgun çocukça takip etmek iyi bir araçtır, BrdU boyama daha basittir.

Ayrıca nötrofil, anti-tümör ve anti-metastatik işlevini belirlemek için birkaç yöntem tarif edilmiştir. Bunlar nötrofil tükenmesi, nötrofil evlatlık transferi, tümör nötralizasyon testi ve tahlil ekim akciğer metastazı içerir. Bu tahlillerin her biri, anti-tümör, nötrofil fonksiyonlarının özel bir yanını gerçekleştirir. Örneğin, Granot ve ark., 6 DEP bağlı olduğu görülmektedirnötrofil letion, 4T1 tümör taşıyan farelerdeki akciğer metastaslarının sayısı, nötrofillerin, bir anti-metastatik rolü düşündürmektedir artar. Nötrofil evlatlık transferi üzerine, tümör hücrelerinin saflaştırılmış HDN enjeksiyonundan önce intravenöz 4 saat enjekte edilir. akciğer ve karaciğer metastazı meydana getirmek üzere, tümör hücrelerinin yeteneği optik in vivo görüntüleme sistemi kullanarak bir zaman programı çalışmaya takip edilmektedir. HDN alan farelerin, kontrol fareleri 6 göre daha az sayıda metastatik foci göstermiştir. Tümör nötralizasyon deneyinde, tümör hücreleri HDN varlığı, tümör büyümesini 21 azaltır ya da HDN olmayan deri altından enjekte edilir. Metastatik tohumlama deneyinde, GFP-etiketli tümör hücreleri intravenöz kontrol veya nötrofil tükenmiş önceden metastatik tümör taşıyan farelere enjekte edilir, ve akciğer tohum GFP-etiketli hücrelerin yeteneği belirlenir. Ön-metastatik tümör taşıyan farelerin akciğerleri tümör önleyen yüksek miktarda nötrofil enflasyonu ile karakterize edilirözel bir organ 6 hücre ekim. Bu kontrol, tümör taşıyan farelere kıyasla nötrofil tükenmiş farelerde daha metastaz odakları çevirir.

protokoller kanser bağlamında nötrofil işlevini okuyan ve in vitro ve in vivo olarak kanser ile ilişkili nötrofil özelliklerini değerlendirmek için stratejiler sağlar odak tarif. Bununla birlikte, nötrofil saflaştırma stratejileri olarak tarif edilen deney prosedürü, bazı nötrofil kritik bir rol (örneğin, enflamasyon ve enfeksiyon) oynatmak deneysel ayarları geniş bir nötrofil işlevini çalışmak için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ZG İsrail Bilim Vakfı (Hibe No 41/11) I-CORE Programından hibe tarafından desteklenmektedir, Abisch-Frenkel Vakfı, Rosetrees Güven, İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF - Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü) ve FİRMASI vakıf. ZGF İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF - Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü) hibe tarafından desteklenen, Sağlık Bakanlığı ve İsrail İsrail Akciğer Derneği Baş Bilim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Tags

Immunology Sayı 100 nötrofil izolasyonu tümör tutulan nötrofiller yüksek yoğunluklu nötrofiller düşük yoğunluklu nötrofiller anti-tümör sitotoksisite BrdU etiketleme CFSE etiketleme lusiferaz deneyi nötrofil tükenmesi anti-metastatik aktivite akciğerdeki metastatik tohumlama deneyi nötrofil evlatlık transferi.
Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sionov, R. V., Assi, S.,… More

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter