Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Abstract

Neutrofielen, de meest voorkomende van witte bloedcellen in de menselijke circulatie, spelen een belangrijke rol bij de afweer tegen binnendringende micro-organismen. Bovendien neutrofielen spelen een centrale rol in de immuunbewaking van tumorcellen. Ze hebben het vermogen om tumorcellen te herkennen en te induceren tumorceldood hetzij door een cel contact-afhankelijke mechanisme met waterstofperoxide of door middel van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Neutrofielen met anti-tumor activiteit kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed van kankerpatiënten en tumordragende muizen. De neutrofielen worden genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN) het onderscheiden van neutrofielen van gezonde proefpersonen of naïeve muizen die geen significante tumor cytotoxische activiteit vertonen. Vergeleken met andere witte bloedcellen, neutrofielen tonen verschillende drijfvermogen waardoor het mogelijk is om een> 98% zuivere populatie neutrofielen te verkrijgen wanneer onderworpen aan een dichtheidsgradiënt. Maar naastde normale hoge dichtheid neutrofielen populatie (HDN) bij kankerpatiënten, in tumordragende muizen, evenals onder chronische ontstekingsaandoeningen, verschillende low-density neutrofielen populaties (LDN) zijn opgenomen in de circulatie. LDN co-zuivert met de mononucleaire fractie en kan worden gescheiden van mononucléaire cellen met behulp van positieve of negatieve selectie strategieën. Wanneer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen wordt bepaald door flow-cytometrie, kunnen ze worden toegepast voor in vitro en in vivo functionele assays. We beschrijven technieken voor het bewaken van de antitumoractiviteit van neutrofielen, hun vermogen om te migreren en reactieve zuurstofsoorten te produceren, alsmede toezicht op hun fagocytische capaciteit ex vivo. We technieken beschrijven verder de neutrofielen in vivo traceeretiket en hun anti-metastatisch vermogen in vivo te bepalen. Al deze technieken zijn essentieel voor het begrip van het verkrijgen en karakteriseren neutrofielen met anti-tumorfunctie.

Introduction

Neutrofielen werden aanvankelijk gekarakteriseerd als het aangeboren immuunsysteem cellen die als eerste lijn verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Vandaag de dag is het bekend dat neutrofielen hebben verdergaande functies, betrokken zijn bij de montage van adaptieve immuunreacties tegen vreemde antigenen 1,2, het reguleren van hematopoiese 3, angiogenese 4 en wondgenezing 5. Daarbij mag neutrofielen tumorgroei en metastatische progressie beïnvloeden door hun pro- en anti-tumor activiteiten 6,7. Neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfe gesegmenteerde kern (vandaar aangeduid polymorfonucleaire (PMN) leukocyten) en ten minste drie verschillende subklassen van granules en secretorische blaasjes 8 (Figuur 1 A-C).

Neutrofielen hebben grote fagocytische capaciteit en hoge NADPH-oxidase activiteit essentieel is voor microbiële verwijdering en scheiden een groot aantal chemokinen belangrijk bijtraction extra neutrofielen en andere immuuncellen naar de plaats van ontsteking 8,9. Neutrofielen worden gekenmerkt door de expressie van een groot aantal oppervlaktereceptoren zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), C-type lectine receptoren (CLRS), complement receptor 3 (CD11b / CD18) en andere adhesiemoleculen (bijvoorbeeld, L-selectine, LFA-1, VLA-4 en carcinoembryonaal antigen gerelateerde celadhesie molecuul 3 (CEACAM3 / CD66b)), chemokine receptoren (bijvoorbeeld, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), chemoattractant receptoren (bv PAFR, LTB 4 R en C5AR) , cytokine receptoren (bijvoorbeeld, G-CSFR, IL-1 R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptide receptoren (bv FPR1-3) en Fc-receptoren (bijvoorbeeld CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) en CD64 (FcyRI) 10. Bij muizen worden gewoonlijk geïdentificeerd als neutrofielen CD11b + Ly6G +, terwijl menselijke neutrofielen worden geïdentificeerd met de CD 11, CD15, CD16 en CD66b leukocyten markers. Ook wordt algemeen aanvaard kleur wordt de granule-eiwitten myeloperoxidase (MPO) en neutrofiel elastase (NE) voor detectie van neutrofielen in weefsels.

Het blijft onduidelijk of de diverse functies van neutrofielen worden gemedieerd door dezelfde cel of door afzonderlijke cel subpopulaties. Accumuleren gegevens wijzen op de aanwezigheid van een heterogene populatie neutrofielen die een hoge mate van plasticiteit die door pro-inflammatoire stimuli en hun micro 11,12 vertoont. Fridlender et al. 13 hebben schromelijk verdeelde de neutrofielen bij kanker in twee belangrijke subpopulaties genoemd N1 met anti-tumor eigenschappen en N2 met pro-tumor eigenschappen. Bij kanker, alsmede in chronische ontsteking, is er een extra subpopulatie uit granulocytic myeloide suppressor cellen (G-MDSCs) dat T-celresponsen 14 onderdrukken. G-MDSCs worden als onrijpe myeloïde cellen gekenmerkt door een CD11b + Ly6C zijnlage Ly6G hi fenotype in muizen 15, terwijl het hebben van een CD15 + / CD16 laag fenotype in de menselijke 16. G-MDSCs uiten hogere niveaus van arginase en myeloperoxidase, terwijl lagere niveaus van cytokines en chemokines dan normaal circulerende neutrofielen. Ze zijn minder fagocytische en trekvogels, maar produceren hogere niveaus van ROS 15,17,18. In dit document zullen we een aantal fundamentele methoden voor isolatie en karakterisering van neutrofielen met anti-tumor eigenschappen te beschrijven.

Terwijl neutrofielen vormen de grootste bevolking van alle witte bloedcellen in het menselijk omloop (45-70%; 1800 - 6000 / ul), bij muizen, onder normale omstandigheden, ze zijn nogal mager (10 - 15%; 300-500 / ul ). De neutrofielen stijgt gestaag op ontstekingen en soms met kanker, die een toestand van chronische ontsteking 7 vertegenwoordigt. Neutrofielen ontwikkelen van multipotent gemeenschappelijke myeloïde voorloper (CMP) cells in het beenmerg, door een differentiatieproces passeren van de fasen van myeloblasten (MB), promyelocyten (PM), myelocyten (MC), metamyelocyten (MM) en band cellen (BC) 8. De volwassen, post-mitotische neutrofielen kan binnen het beenmerg blijven voor 4 - 7 dagen voordat ze worden vrijgegeven aan de circulatie 8. Neutrofielen omzet in het bloed is gewoonlijk snel met een gemiddelde halfwaardetijd van 6-12 uur, eventueel verlengd onder ontstekingsaandoeningen. Gestimuleerde neutrofielen hebben anti-tumorigene activiteit, een functie die kan worden verworven door het blootstellen van de naïeve neutrofielen naar de chemokinen IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 en CXCL5 6,19 of kunstmatig beperkt door ze bloot te stellen aan de forbolester forbol 12 -myristate 13-acetaat (PMA) 6.

De korte halfwaardetijd van bloed neutrofielen samen met het lage aantal neutrofielen (~ 3-5 x 10 5) bereikt van 1 ml bloed van een naïeve 6-8 weken oude muis, hebben het gemaaktmoeilijk om de functie van circulerende neutrofielen muis in vitro onderzoeken. Om deze moeilijkheid te overwinnen, zijn andere bronnen gebruikt. Zo kunnen grote aantallen neutrofielen worden verkregen uit het beenmerg 20 of het peritoneum volgend op de inductie van steriele ontsteking (bijvoorbeeld na intraperitoneale injectie van thioglycolaat cultuurvloeistof of Zymosan A). Opgemerkt wordt dat neutrofielen verkregen uit de peritoneale holte geen anti-tumorontwikkeling (ongepubliceerde waarneming) uitoefenen.

. Granot et al opgemerkt dat 6 BALB / c muizen geïnoculeerd met orthotopically de muis 4T1 borstcarcinoom cellijn ontwikkelen neutrofilie die verergert tot tumorprogressie 6 (figuur 2A), zodat 20-40000000 bloedneutrofielen gemakkelijk worden geïsoleerd uit 1 ml bloed 3-4 weken na de tumor-inoculatie. Deze neutrofielen hebben anti-tumor activiteiten verworven, en hebben daarom COI geweestned-tumor meegevoerde neutrofielen (TEN), teneinde deze te onderscheiden van naïeve neutrofielen 6 (Figuur 2B). Terwijl high-density neutrofielen (HDN figuur 1A) sterk anti-tumorigene, low-density neutrofielen (LDN figuur 1B) gegenereerd in de context van kanker niet 21. Ook, high-density neutrofielen uit het beenmerg en de milt van tumordragende muizen anti-tumor activiteit (ongepubliceerde gegevens). Opgemerkt wordt dat bij tumorprogressie de milt geleidelijk vergroot (splenomegalie), met toenemende hoeveelheden van neutrofielen.

Opgemerkt wordt dat de TEN ook geproduceerd in andere modellen van kanker waaronder zowel spontane (MMTV-PyMT en MMTV-Wnt1 mammaire tumoren en k-Ras driven longtumoren) en geïnjecteerd (AT-3 (MMTV-PyMT) en E0771 borstcarcinoom cellen, LLC Lewis longcarcinoom cellen en B16-F10 melanoomcellen). De mate van neutrofiel mobilisatie in deze tumof modellen veel minder dan van 4T1-geïnoculeerde muizen, tot 5-10 x 10 6 neutrofielen in 1 ml bloed na 3 weken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieren: 5-7 weken oude BALB / c muizen werden gekocht bij Harlan (Israel). Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Hebreeuwse Universiteit van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Human monsters: Verzamelen van bloed van kankerpatiënten en gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Inductie van neutrofielen met Anti-tumor Properties in vivo met behulp van een Breast Cancer Mouse Model.

LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van steriele oplossingen in een laminaire luchtstroom (LAF) Bio-Safety kast.

  1. Seed 5 x 10 5 4T1-cellen in 100 mm weefselkweekplaat in 10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 4,5 g / l D-glucose, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM D- glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U / ml penicilline G en 100 ug / ml streptomycine sulfaat. Incubate the cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 3-4 dagen. Zorg ervoor dat de cellen 50 - 100% confluent op de dag van het experiment.
  2. Om de tumorcellen uit het weefsel kweekplaat losmaken, zuig het kweekmedium, was de cellen met 5 ml PBS, zuig het PBS en voeg 3 ml van een 2,5 g / L trypsine-oplossing. Incubeer de cellen 2-3 minuten met trypsine bij 37 ° C.
  3. Voeg 10 ml serum-bevattend medium om de trypsine te neutraliseren en pipet op en neer totdat alle cellen werden losgemaakt. Breng de celsuspensie aan een 15 ml conische centrifugebuis.
  4. Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het medium waardoor 200 gl medium boven de celpellet. Resuspendeer de cellen in het restvolume en voeg 10 ml PBS. Inverteer de buis 2-3 maal een homogene celsuspensie af en nemen 10 pi om de cellen in een hemocytometer tellen. Gebruik trypanblauw om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur. Zuig het PBS en resuspendeer de cellen in PBS bij een eindconcentratie van 2 x 10 6 cellen / ml. Zorg ervoor dat de enkele cel schorsing heeft geen klonteren.
  5. Injecteer 1 x 10 6 cellen of 4T1-luciferase expressie brengende 4T1-cellen in 50 ul PBS orthotopically in de linker lies uiervet pad van vrouwelijke BALB / c-muizen met een 0,3 ml spuit met een 30G x 8mm naald.
    1. Vóór injectie, verdoven de muizen in een inductie kamer ontvangen een langzame debiet van isofluraan (3-5%) in 100% zuurstof.
    2. Leg de muis op een steriele chirurgische pad en zorg ervoor dat de kop goed in de isofluraan neuskegel geplaatst. Bevestig de juiste verdoving door knijpen de poot. Gebruik vet zalven ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Scheer het haar rond de injectieplaats en desinfecteren met 70% EtOH.
    3. Gebruik een steriele set van chirurgische instrumenten om een ​​kleine horizontale incisie te maken (5 mm) ca.nor- maal gesproken minstens halverwege tussen de lies en de buik tepels, bloot de dikke pad en injecteer 1 x 10 6 4T1 cellen in 50 ul. Sluit de insnijdingen met 9 mm clips die één week later worden verwijderd. Injectie van luciferase uiten cellen zorgt voor de opvolging van de grootte van de tumor en metastase door bioluminescentie beeldvorming.
      LET OP: Deze minimaal invasieve procedure geen post-operatieve behandeling nodig en de geïnjecteerde muizen herstellen binnen 2 - 3 min.
    4. Bewaken van de muizen tot ze weer bij bewustzijn, en zorg ervoor dat ze weer volledig bewustzijn voordat hij het gezelschap van andere muizen.
  6. Na 3-4 weken, wanneer de primaire tumor een volume van 2 cm 3 heeft bereikt, offeren de muizen een langzame CO 2 stroom, en onmiddellijk na de laatste adem, bloed verkregen door hartpunctie onder toepassing van een 25G x 5/8 "naald aangesloten op een 1 ml tuberculine spuit voorbehandeld met heparine. Houd de mond van de naald omhoog wanneer u deinjectiespuit in een horizontale positie door het membraan naar het hart, en langzaam en geleidelijk het bloed voorkomen overdruk (figuur 3) te trekken.

2. neutrofielen Isolatie

  1. Isolatie van cytotoxische neutrofielen uit het bloed van tumordragende muizen.
    1. Verdun 1 ml bloed dat uit tumor-dragende muizen (zie Protocol 1,11) in PBS met 0,5% (w / v) runderserumalbumine (BSA) tot een eindvolume van 6 ml.
    2. Fractionering van verdund bloed op een vers bereide discontinue sucrose gradiënt:
      1. Voeg 3 ml steriel-gefiltreerde sucrose 1,119 g / ml bij de bodem van een 15 ml kegelvormige polypropyleen centrifugebuis.
      2. Langzaam en voorzichtig layer 3 ml steriel-gefiltreerde sucrose 1,077 g / ml boven de 1,119 g / ml laag. Daarna, voeg langzaam en voorzichtig de 6 ml verdund bloed (Protocol 2.1.1) bovenop de 1.077 g / ml layer (Figuur 4A). Het wordt aanbevolen om de buis gekanteld te houden en eendding de verschillende componenten door een langzame maar continue stroom, waarbij de monding van de pipet naar de onderste wand van de buis, zodanig dat er geen turbulentie ontstaat.
    3. Centrifugeer de buis met het verdunde bloed op de sucrose gradiënt bij 700 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
    4. Haal de buis uit de centrifuge zonder enige turbulentie. Het merendeel van de erytrocyten wordt onderin de buis. High-density neutrofielen (HDN) worden aangetroffen als een witte tot rode ring aan het grensvlak tussen 1,119 g / ml en 1,077 g / ml lagen (om de 3 ml markering), terwijl de lage-dichtheid leukocyten worden gevonden in witte ring aan het grensvlak tussen de 1.077g / ml laag en de BSA-PBS bevattende (rond de 6 ml markering, zie figuur 4B).
    5. Zuig het PBS + 0,5% BSA tot aan 5 mm boven het lage-dichtheid cellaag. Pipet uit de lage dichtheid cellen door langzame zuigkracht in een 1 ml tip door middel langzaam wervelende rond de cellen.Breng de cellen in 30 ml PBS met 0,5% BSA.
    6. Zuig de bovenste laag in hetzelfde verloop buis tot aan 5 mm boven het high-density cell band. Pipetteer de high-density cellen, die meestal high-density neutrofielen, en breng de cellen in 30 ml PBS dat 0,5% BSA.
    7. Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    8. Zuig het supernatant en lyseren erytrocyten door resuspenderen van de cellen in 36 ml steriel HPLC kwaliteit water gedurende 30 sec. Isotoniciteit worden hersteld door toevoeging van 9 ml van een 5x geconcentreerde PBS aangevuld met 2,5% (w / v) BSA.
    9. Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    10. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in PBS-BSA. Tel het aantal neutrofielen in een hemocytometer en gebruik trypan blue onderscheid maken tussen levende en dode cellen.
    11. Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en resuspendeer de neutrofielen in gewenste incubatiemedium om uiteindelijke celdichtheid. Gebruikde neutrofielen onmiddellijk.
    12. Dan, na het andere centrifugatie, resuspendeer de neutrofielen in incubatiemedium met uiteindelijke celdichtheid. Gebruik de neutrofielen onmiddellijk.
  2. Isolatie van circulerende neutrofielen uit kankerpatiënten.
    1. Meng 10 ml heparine (20 U / ml) menselijk bloed met een gelijk volume van 3% Dextran T500 in zoutoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatie worden de erythrocyten sedimenteren.
    2. Bereid een 50 ml conische polypropyleenbuis met 10 ml sucrose 1,077 g / ml en langzaam laag het leukocyt-rijke supernatant boven de 1.077 g / ml sucrose layer (Figuur 4C).
    3. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem. De high-density neutrofielen (HDN) zal verschijnen in de pellet. Low-density neutrofielen (LDN) tezamen worden gezuiverd met monocyten en lymfocyten in het grensvlak tussen 1,077 g / ml sucrose laag en plasma (Figuur 4D).
    4. Resuspendeer de neutrofielen in 10 ml 0.2% NaCl gedurende 30 seconden om de contaminerende erytrocyten te lyseren, en isotoniciteit hersteld door toevoeging van 10 ml 1,6% NaCl en een keer om.
    5. Centrifugeer 5 minuten bij 160 x g bij kamertemperatuur en was drie keer in 20 ml Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing. Centrifugeer na iedere wasbeurt en zuig het supernatant.
    6. Tel de neutrofielen en resuspendeer de cellen in RPMI-1640 gesupplementeerd met 2% FBS bij 2 x 10 6 neutrofielen / ml of zoals gewenst.

3. Verrijking van Blood neutrofielen behulp van Magnetic Beads

  1. Positieve selectie
    1. Neem 1 ml bloed uit muizen zoals beschreven in protocol 1,8, met een gehepariniseerde injectiespuit.
    2. Centrifugeer het bloed in een 15 ml conische buis bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Zuig het supernatant of houd het bloedplasma voor verdere studies.
    4. Lyse de erytrocyten door resuspenderen de cellen in 8 ml HPLC-grade water. Na 30 sec herstellen isotoniciteit door toevoeging van 2 ml 5x concentrated PBS bevattende 2,5% BSA. Tel de cellen.
    5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Resuspendeer de celpellet in 200 pl PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA per 10 8 cellen.
    7. Voeg 50 pl gebiotinyleerd anti-Ly6G antilichaam. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast (niet op het ijs).
    8. Voeg 150 ul koud PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    9. Vortex de anti-biotine gecoat magnetische microbead voorraad oplossing. Breng 100 pi aan de celsuspensie. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast (niet op het ijs).
    10. Was de cellen door toevoeging van 10 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    11. Zuig supernatant volledig en resuspendeer in 500 ul koud PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    12. Plaats een magnetische scheiding kolom in een magneet houder die aan een magnetisch stand is bevestigd, en spoel het met 500 ul koude PBS met 0.5% BSA en 2 mM EDTA.
    13. Breng de celsuspensie op de kolom. De doorstroom bevat ongelabeld LyG6-negatieve cellen.
    14. Was de kolom met 500 pl PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Aanvullende ongelabelde cellen in de doorstroom.
    15. Herhaal de wasstap met een 500 pl PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    16. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats deze op een 15 ml collectie buis. Voeg 1 ml PBS die 0,5% BSA en 2 mM EDTA, en spoel de magnetisch gemerkte cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom. De stroom bevat door middel Ly6G + neutrofielen.
  2. Negatieve selectie
    1. Bereid bloed leukocyten volgens de stappen 3.1.1 tot en met 3.1.5.
    2. Resuspendeer 1 x 10 8 cellen in 1 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA in een 5 ml polystyreen ronde bodem buis.
    3. Voeg 50 ul normale rat serum.
    4. Voeg 50 ul van neutrofielen verrijking cocktail (met gebiotinyleerde antilichamen die specifiek zijn voor niet-neutrofielen witte bloedcellen), mengen en incuberen gedurende 15 minuten in de koelkast.
    5. Was de cellen door toevoeging van 4 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA en centrifugeer 400 xg gedurende 10 min.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    7. Voeg 50 ul van tetramere antistof complexen tegen biotine en dextran. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast.
    8. Vortex en de buis met dextran beklede magnetische korrels voor het toevoegen 150 pi aan de celsuspensie. Meng goed en incubeer 10 minuten in de koelkast.
    9. Breng de celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml door toevoeging van PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Meng voorzichtig om een ​​homogene celsuspensie te krijgen.
    10. Steek de buis (zonder de dop) in de magneet, en laat staan ​​voor 3 min.
    11. Keer de magneet met de buis in één doorlopendebeweging zodanig dat de ongebonden cellen in de vloeistof worden overgebracht naar een nieuwe buis. Laat de magneet en de buis omgekeerd voor 2 - 3 sec, dan terug naar rechtop. De magnetisch gelabelde ongewenste cellen gebonden aan de wand van de oorspronkelijke buis blijven, terwijl de ongebonden neutrofielen wordt het overgedragen fluïdum.

4. Cytologisch kleuring van neutrofielen

  1. Resuspendeer 1x10 5 neutrofielen in 50 pl PBS en breng de celsuspensie een dunne laag celpreparaat adapter zoals een Cytospin. Centrifugeer de adapter bij 150 xg gedurende 5 minuten. Scheid de gelabelde glasplaatje van de adapter.
  2. Fix cellen door dompelen van de glasplaatjes in 70% ethanol gedurende 2 minuten. Laat de voorbereidingen van de adapter (zie stap 4.1) drogen bij kamertemperatuur voordat kleuring. Dompel de objectglaasjes 5-6 keer gedestilleerd water.
  3. Vlekken 1-2 min in Mayer's hematoxyline oplossing. Spoel 1 min in leidingwater. Vlek 10 sec in Eosin Y-oplossing . Was in leidingwater. Uitdrogen door spoelen van de glaasjes in toenemende concentraties ethanol (70%, 96% en 100%). Laat de glasplaatjes lucht drogen kort en de dia's te inspecteren onder een lichtmicroscoop.
    OPMERKING: Hematoxylin heeft een diep blauw-paarse kleur en vlekken nucleïnezuren, terwijl eosine is roze en vlekken eiwitten niet-specifiek. De cytoplasmatische granules van neutrofielen blijft ongekleurd door zure of basische kleurstoffen, wat de oorsprong van de naam het houden neutraal ". Overwegende basofiele granulocyten vlek donkerblauw met hematoxyline en eosine en eosinophilc granulocyten helder rood, neutrofielen verschijnen neutrale roze (zie figuur 1A). Oudere neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfonucleaire kern, die over het algemeen groot met 2-5 lobben 'gesegmenteerde neutrofielen (figuur 1A en 1C). Onrijpe neutrofielen worden gekenmerkt door één of gelobde gebogen ringvormige nucleus (Figuur 1B).
ve_title "> 5. Bepaling van de zuiverheid van neutrofielen door flowcytometrie.

  1. Resuspendeer 1x10 6 cellen in 100 ui FACS-buffer (PBS met 0,5% BSA, 2 mM EDTA en 0,02% NaN3). Voor geheel bloedmonsters wordt hemolyse nodig voordat kleuring (stappen 3.1.1 tot 3.1.5). Voeg 10 ul van FcR Blocking Reagent gedurende 5 min.
  2. Voeg 0,5 ug fluorescent-gelabeld antilichaam met een specificiteit voor Ly-6G voor muizen neutrofielen of CD11b en CD66b menselijke neutrofielen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Stel het volume op 500 pl met PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA en kleuring geanalyseerd door flow cytometrie.

6. Follow Neutrofiel Poort in vivo

  1. In vivo BrdU labeling van neutrofielen
    1. Injecteer 100 ui van een 10 mg / ml broomdeoxyuridine (BrdU) oplossing in steriel PBS intraperitoneaal aan tumordragende muizen.
    2. Isoleer bloed neutrofielen 48 uur na de injectie eenolgens Protocol 2.1. Stain BrdU-gelabelde neutrofielen onder toepassing van een stroom BrdU kit.
  2. CFSE labeling van neutrofielen
    1. Resuspendeer 10 7 neutrofielen in 1 ml voorverwarmde PBS.
    2. Voeg 2 pi van een 5 mM voorraadoplossing CFSE de neutrofielen gesuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM. Goed mengen en incuberen gedurende 15 min bij 37 ° C. 5 mM CFSE wordt bereid door 2,8 mg CFSE (5- (en 6 -) - carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidyl ester) in 1 ml DMSO. Verdelen in 10 ul porties in steriele 200 ul buizen en op te slaan in het donker bij -20 ° C.
    3. Neutraliseer overtollige CFSE door toevoeging van een gelijk volume van RPMI-1640 bevattende 10% FBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer de neutrofielen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Was de neutrofielen tweemaal in 10 ml RPMI-1640 bevattende 10% FBS.
    4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min en resuspendeer in een geschikt volume van PBS. De neutrofielen (bijvoorbeeld, 1 x 10 7

7. In vitro Luciferase Assay voor de anti-tumor activiteit van geïsoleerde neutrofielen monitor.

  1. Telen luciferase-gelabelde tumorcellen zoals beschreven voor 4T1 cellen in Protocol 1,1-1,5, maar resuspendeer de trypsine-gedissocieerde cellen geoptimaliseerde verminderde serum medium gesupplementeerd met 2% FBS. Stel de celdichtheid 5 x 10 4 cellen per ml.
  2. Seed 5000 luciferase-gelabelde tumorcellen in 100 ul geoptimaliseerde gereduceerd serum medium dat 0,5% FBS in elk putje van een witte 96-vlakke bodem weefselkweek wells plaat.
  3. 4 uur na enten de tumorcellen, voeg 1 x 10 5 neutrofielen in 50 gl geoptimaliseerde gereduceerd serum medium dat 0,5% FBS en geïncubeerd O / N. Bereid een neutrofiel celsuspensie met een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Controleputjes moet 50 ul medium zonder neutrofielen. Doenmeerdere herhalingen van elke experimentele setting.
  4. De volgende ochtend, Zuig voorzichtig het supernatant en was elk putje met 200 ul PBS. Zuig het PBS en voeg 50 ul van passieve lysisbuffer. Voor gemakkelijk losmaken cellen (zoals AT-3-cellen), niet wassen in PBS en voeg onmiddellijk de celkweek lysisbuffer na opzuigen van het groeimedium.
  5. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer het op een orbitale schudinrichting bij 150 opm gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
  6. Plaats de plaat in een luminescentie plaatlezer. Injecteren goed wijs 50 ul luciferasetest oplossing, en lees de chemiluminescentie 10 seconden per putje.
  7. Bereken het% tumor lysis met de volgende formule:% tumor lysis = (1- [luminescentie van monsters met neutrofielen] / [luminescentie van monsters medium]) x 100%.

OPMERKING: Om de bijdrage van neutrofielen aan uitgezaaide zaaien beoordelen, kan neutrofielen worden uitgeput, zoals beschreven in het protocol 8.1. Voor een effectieve verarmdetion beheren-neutrofielen afbrekende antilichamen beginnen op dag 7 na de tumor implantatie.

8. Anti-metastatische activiteit van neutrofielen in een Breast Cancer Mouse Model.

  1. In vivo depletie van neutrofielen.
    1. Vers bereiden 12,5 ug anti-rat antilichaam Ly6G (neutrofiel afbrekende antilichaam) of rat isotype controle antilichaam (IgG2a, Κ) in zoutoplossing in een eindvolume van 100 pl per muis.
    2. Beginnend op dag 3 post-tumor implantatie dagelijks injecteren van een intraperitoneale dosis van 12,5 ug rat anti-Ly6G antilichaam (100 pi). Injecteer controlemuizen met of 12,5 pg (100 pi) rat isotype controle-antilichaam (IgG2a, Κ).
    3. Beginnend op dag 14, het beheer van de antilichamen tweemaal daags, als de neutrofielen productie snelheid drastisch verhoogt wanneer de 4T1 tumor groeit.
    4. Om de andere dag, het verkrijgen van een bloedmonster (2-3 druppels) door nicking de laterale staart-ader. Verzamel het bloed in een anti-coagulant met buis (heparine, citraat of EDTA).
    5. Controleer neutrofielen uitputting met flowcytometrie zoals beschreven in Protocol 5.
  2. Tumor Neutralisatie Test (Gewijzigd Winn Assay)
    1. Isoleer neutrofielen uit tumordragende muizen. Meng 1 x 10 6 tumorcellen en 3 x 10 6 neutrofielen in 50 gl zoutoplossing (per muis).
    2. Injecteer de cellen subcutaan in de flank van 6-8 weken oude naïeve BALB / c muizen. Scheer de flank voorafgaand aan de tumor aanslaan om nauwkeurige metingen van de grootte van de tumor mogelijk te maken. Meet tumorgrootte dagelijkse startpunt op dag 5 post-implantatie.
  3. Neutrofiel adoptieve overdracht
    1. Injecteer 2 x 10 4-luciferase expressie tumorcellen in 200 ul PBS om de staartader.
    2. Neutrofielen overdracht moet worden uitgevoerd 4 uur na injectie van tumorcellen. Daarom start de zuivering van HDN van tumor-dragende muizen (protocol 2.1) ongeveer 2 uur voor hun geplandvivo overdracht. Resuspendeer neutrofielen in PBS bij een eindconcentratie van 2,5 x 10 7 cellen / ml.
    3. 4 uur na de introductie van de tumorcellen plaatst de muizen onder een warmtelamp gedurende 5 min. Plaats de muizen in een restrainer en injecteer 5 x 10 6 HDN (200 ul) via de staartader. Controle muizen worden geïnjecteerd met drager (PBS).
    4. Bewaken van de vorming van longmetastasen op verschillende tijdstippen onder toepassing van een in vivo bioluminescentie beeldvormingssysteem of immunohistochemie.
  4. Longen uitgezaaide zaaien assay
    1. Injecteer 0,5-1 x 10 6 ouderlijke 4T1 cellen orthotopically in de linker lies uiervet pad zoals beschreven in protocol 1.
    2. Op dag 10, resuspendeer GFP tot expressie brengende 4T1-cellen in PBS bij een eindconcentratie van 5 x 10 5 cellen / ml. Plaats de muizen onder een warmtelamp gedurende 5 min.
    3. Plaats de muizen in een restrainer en injecteer 1x10 5 GFP tot expressie brengende 4T1-cellen (200 ui) intraveneus 4T1 tumordragende muizen en naïeve muizen.
    4. De volgende dag, euthanaseren de muizen en perfuseren de longen 20 ml PBS om de resterende RBC's te verwijderen.
    5. Uitsnijden van de longen voor de analyse van GFP-positieve cellen door immunohistochemie.
      OPMERKING: Om de bijdrage van neutrofielen aan uitgezaaide zaaien beoordelen, kan neutrofielen worden uitgeput, zoals beschreven in het protocol 8.1. Voor een effectieve uitputting beheren-neutrofielen afbrekende antilichamen beginnen op dag 7 na de tumor implantatie.

9. Onderdrukking van T-cel proliferatie door neutrofielen van tumor-dragende muizen.

  1. Verwijder de milt van een ingeslapen naïeve BALB / c muis en plaats in 10 ml PBS.
  2. Plaats de milt op een 40 um cel zeef die geschikt is op een petrischaal gevuld met RPMI-1640. De zuiger einde van de injectiespuit, wrijf de milt door de cellen zeef in de petrischaal. Spoel de cel zeef met 5 ml RPMI. Gooi de zeef.
  3. Breng de geresuspendeerde cellen in een 50 ml conische buis en centrifugeer 400 xg gedurende 10 min.
  4. Verwijder het supernatant en lyseren de erytrocyten door de schorsing van de cellen in 36 ml zuiver water voor 20 sec, en aan te passen aan isotoniciteit door het toevoegen van 4 ml PBS geconcentreerd x 10. Als alternatief, lyseren de erytrocyten door de schorsing van de cellen in 5 ml van erytrocyten lyserende buffer (ACK) en incubeer 5 min bij RT. Neutraliseer het ACK door toevoeging van 10 ml van RPMI-1640 medium. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 5 ml PBS en tel de cellen.
  5. Resuspendeer de splenocyten in PBS tot een uiteindelijke dichtheid van 4 x 10 7 cellen / 2 ml in 15 ml buis. Voeg 2 ml van een 2,5 uM CFSE-oplossing in PBS. Snel omkeren van de buis en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met af en toe mengen (elke 2 min), beschermd tegen licht.
  6. Quench overmaat CFSE door toevoeging van 4 ml voorverwarmde FBS (100%) en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Voeg 3 ml PBS en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10min.
  7. Was de cellen met 30 ml PBS en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min.
  8. Filter de cellen door een 40 um cel zeef en opnieuw wassen met PBS.
  9. Resuspendeer de cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS tot een uiteindelijke dichtheid van 2 x 10 7 cellen / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / goed (200 pl) in een 24-well weefselkweek plaat.
  11. Stimuleren van de cellen door toevoeging van 1 ug gezuiverd Armenian hamster anti-muis CD3e antilichaam in 500 ul RPMI-1640 met 10% FBS.
  12. Voeg 2 x 10 6 of HDN LDN in 300 ul RPMI-1640 met 10% FBS aan de CFSE-gelabelde splenocyten en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C. Wells zonder neutrofielen moeten krijgen 300 ul medium. Het totale volume in elk putje dient 1 ml.
  13. Verzamel de cellen en voorbereiden op flowcytometrie. Resuspendeer de cellen in 100 ui FACS buffer (protocol 5) en voeg 10 ul van FcR Blocking Reagent. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Voeg 1 &# 956; l APC-geconjugeerd anti-CD8a antilichaam en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Bepaal de CFSE fluorescentie-intensiteit op CD8 + T-cellen door flowcytometrie (Figuur 5). De CFSE intensiteit wordt gehalveerd bij elke celdeling. Aldus kan het aantal celdelingen worden bepaald door de intensiteit van CFSE kleuring.

10. neutrofielen Migratie Assay

  1. Zaad 5x10 5 4T1 cellen in 7 ml geoptimaliseerde verlaagde serum medium gesupplementeerd met 0,5% FBS in een 25 cm2 weefselkweek kolf en incubeer 24 uur bij 37 ° C.
  2. Breng 800 pi van het supernatant aan de onderste kamer van een migratie plaat met een poriëngrootte van 5 pm.
  3. Resuspendeer 2 x 10 5 neutrofielen in 400 gl geoptimaliseerde verminderde serum medium gesupplementeerd met 0,5% FBS. Breng de celsuspensie aan de bovenste kamer en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
  4. Aan het eind van de incubatie, verwijder de bovenste kamer entel het aantal neutrofielen die zijn gemigreerd naar de onderste kamer.

11. Monitoring neutrofielen productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS).

  1. Bereid 1,1 x 10 6 neutrofielen / ml in Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder fenolrood. Plate 180 ul met 2 x 10 5 neutrofielen in elk putje van een witte 96-platte bodem well plaat.
  2. Plaats de plaat in een luminescentie plaatlezer. Voeg 20 pi van een 500 pM oplossing luminol in PBS aan elk putje tot een eindconcentratie van 50 uM krijgen. Lees de basale chemiluminescentie voor 1sec in een tijdsverloop van 5 min 10 sec intervallen.
  3. Voeg een stimulerend middel (bijvoorbeeld PMA in een concentratie van 10 nM of 100 nM of fMLP bij een concentratie van 10 uM). Bereid een 10 x geconcentreerde oplossing van elk middel in Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder fenolrood en voeg 22 ul aan de desbetreffende putjes. Om controle putten toevoegen 22 ul voertuig.
  4. Measuopnieuw de chemiluminescentie in de plaat lezer. Doe zowel een korte (elke 10 seconden voor 5 min) en een lange (elke minuut voor 1 uur) tijdsverloop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In een recente studie van een anti-metastatische werking van neutrofielen 6 identificeerden we. Neutrofielen van tumordragende muizen verwerven van een cytotoxische fenotype en het vermogen om tumorcellen te doden 6. Dit in tegenstelling tot neutrofielen uit naïeve muizen die geen significante anti-tumor effect 6 hebben. Enkele van de in de sectie protocol beschreven technieken gebruikt voor het bestuderen van anti-tumor neutrofielfunctie in vitro en in vivo 6.

Tumor cytotoxische neutrofielen is verkrijgbaar bij tumordragende muizen 6. Om dit doel te bereiken, werden muizen orthotopically geïnjecteerd met 4T1 cellen in de linker lies uiervet pad (protocol 1). Tegen dag 21 na tumor inoculatie, de primaire tumor bereikten een grootte van 1-2 cm 3 (Figuur 3 - de tumor blijkt linksonder buik). Op dat moment werden de muizen gedood en 1 ml bloed afgenomen (per muis)door hartpunctie (figuur 3). Daarnaast bloed van naïeve, niet-tumor-dragende muizen werd getrokken. HDN werden vervolgens gezuiverd op een dichtheidsgradiënt (Protocol 2.1 en figuur 4) om een zeer zuivere (> 98%) verkregen populatie van neutrofielen. Neutrofielen levensvatbaarheid werd bepaald door trypan blauwe kleuring (Protocol 2.1). De neutrofielen werden vervolgens geresuspendeerd in geoptimaliseerde verminderde serum medium dat 0,5% FBS bij 2 x 10 6 neutrofielen / ml.

Om de omvang van neutrofielen cytotoxiciteit testen, voegden we 10 5 neutrofielen (50 ul van een 2 x 10 6 neutrofielen / ml voorraad oplossing) tot luciferase uiten 4T1 doelcellen (5.000 cellen / putje in 100 pi) in een vlakke bodem wit 96 -goed plaat (Protocol 7). Na een O / N incubatie werden de cellen gewassen in PBS en gelyseerd in passieve cellysis buffer en de luciferase-activiteit in elk monster werd getest om de mate van neutrofiel cytotoxiciteit (evaluatie (Figuur 2B, tumorvrij), neutrofielen gezuiverd uit tumordragende muizen vertonen significante cytotoxiciteit (Figuur 2B, tumordragende).

Om de immuunsuppressieve eigenschappen in LDN en HDN testen gebruikten we de T-celproliferatie assay (Protocol 9). We evalueerden deAantal CD8 + cellen in onbehandelde splenocyten en splenocyten behandeld met een aCD3 antilichaam die alleen waren gekweekt en cellen die in aanwezigheid van LDN of in aanwezigheid van HDN (Figuur 5A-D) gekweekt waren. Merk de dramatische toename van CD8 + CFSE + cellen na anti-CD3 stimulatie (vergelijk rechtsboven paneel A en B) de dramatische remmende effect van onderdrukkende LDN (vergelijk rechtsboven paneel B en C) en het gebrek aan remmende effect van HDN (paneel D). We evalueerden ook de mate van retentie CFSE, indicatief voor proliferatie. In Figuur 5E, de oranje curve weer onbehandelde CD8 + cellen, de blauwe curve CD8 + cellen behandeld met aCD3 antilichamen rood curve CD8 + cellen gestimuleerd met aCD3 in aanwezigheid van LDN en de groene curve geeft CD8 + cellen gestimuleerd met α, CD3 in aanwezigheid van HDN. Let op de verschuiving naar links in de aCD3 behandelde cellen (blauwe curve) en aCD3 behandelde cellen gekweekt met HDN (groene curve), welke CD8 + celproliferatie te geven.

Figuur 1
(C) Een transmissie elektronenmicroscopie beeld Figuur Lichtmicroscopie beeld van hoge dichtheid (A) en low-density neutrofielen (B) gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) na thin layer mobiele preparaat 1. neutrofiel morfologie.. (TEM) een high-density neutrofielen. De balk geeft 1.000 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Blood neutrofielen te verhogen met tumor progression en neutrofielen verwerven van een cytotoxische fenotype. (A) Het circulerende neutrofielen aantal per 1 ml werd geteld door FACS op verschillende dagen na tumorcel inoculatie in BALB / c-muizen. Het aantal circulerende CD11b + Ly6G + neutrofielen voortdurend toeneemt met 4T1 tumor progressie. (B) 4T1 mammacarcinoom cellen werden samen gekweekt met een hoge dichtheid neutrofielen van beide naïeve muizen (Tumor gratis) of 4T1-tumor dragende muizen (Tumor lager) muizen, of geïncubeerd in medium in afwezigheid van neutrofielen (Cont.) bij 37 ° C gedurende 20 uur. Neutrofielen van tumordragende muizen, maar niet van tumor-vrije muizen, tonen significante cytotoxiciteit jegens 4T1 tumorcellen. Fout balken geven ± SEM ** p <0,01 met behulp van een t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

"Figuur Figuur 3. Het verzamelen van muizen bloed via cardiale punctie. De muis werd gedood in een inductie kamer onder langzame CO 2 stroom. Onmiddellijk nadat de muis de terminal adem heeft genomen, wordt gelegd op zijn rug en een 1 ml gehepariniseerde spuit aan de onderkant van het borstbeen tot het bereiken van het hart geplaatst. Trek langzaam op de zuiger om het bloed te zuigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Neutrofiel zuivering uit volbloed. (A) 3 ml 1,077 g / ml sucrose wordt voorzichtig gelaagd bovenop 3 ml 1,119 g / ml sucrose een discontinue gradiënt te vormen. Hele muizen bloed, verdund in PBS-BSA (0,5%) tot een eindvolume van 6 ml, wordt vervolgens gelaagd bovenop de 1,077 g / ml sucrose (B) Na een 30 min centrifugeren bij 700 xg zonder onderbreking, 3 verschillende fracties kunnen worden waargenomen.; R - rode bloedcellen in het pellet, G - de granulocyten fractie met hoge dichtheid neutrofielen, M -. Mononucleaire fractie met mononucleaire cellen en low-density neutrofielen (C) vers afgenomen menselijk bloed gemengd met een gelijk volume van Dextran 500 ( 3%) en geïncubeerd bij KT gedurende 30 min. De topfractie die de witte bloedcellen (buffy coat) wordt dan gelaagd bovenop 10 ml 1,077 g / ml sucrose (D) Na een 30 min centrifugeren bij 400 xg zonder onderbreking kan 2 verschillende fracties worden waargenomen.; R + G - pellet met rode bloedcellen en high-density neutrofielen, M -. Mononucleaire fractie die mononucleaire cellen en een lage dichtheid neutrofielen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5
Figuur 5. Onderdrukking van T-celproliferatie. Flow cytometrie geanalyseerd met het aantal CFSE-gelabelde CD8 + cellen gekweekt in de afwezigheid van de stimulus (A), na stimulatie met aCD3 antilichaam in de afwezigheid (B) of aanwezigheid van LDN (C) of HDN (D) (E) Histogram presentatie van CFSE intensiteit in CD8 + cellen van panelen A -.. D Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofielen zijn de meest voorkomende van witte bloedcellen en de eerste responders bij infecties en ontstekingen. Als zodanig zijn ze zeer gevoelig voor externe stimuli en zijn allemaal toegewezen. Bovendien neutrofielen een zeer korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid. Samen vormen deze elementen voeren een aantal problemen bij het werken met neutrofielen, zodat unieke experimentele strategieën nodig. Zo zijn er verschillende neutrofielen zuiveringsstrategieën, elk met zijn eigen voor- en nadelen.

Een kritische stap in het werken met neutrofielen hun zuivering uit volbloed. Neutrofielen kan doeltreffend worden gezuiverd met behulp gradiënten density of antilichaam-gebaseerde strategieën (positieve of negatieve selectie). De voorkeursmethode is de toepassing van dichtheidsgradiënten aangezien zwicht hoge aantallen sterk gezuiverde neutrofielen met minimale niet-specifieke activatie. Echter, zoals we zien in een recente studie 21, with tumorprogressie neutrofielen accumuleren in grote aantallen in de mononucleaire low-density fractie. Onder deze omstandigheden is de toepassing van een dichtheidsgradiënt verschaft een zeer zuivere high-density neutrofiele fractie, die vertegenwoordigt niet de gehele circulerende neutrofielen repertoire en een lage dichtheid neutrofiele fractie die sterk verontreinigd is met andere mononucleaire cellen (lymfocyten en monocyten). Onder deze omstandigheden is de voorkeursmethode is een op antilichamen gebaseerde zuivering, bij voorkeur negatieve selectie. Het gebruik van antilichamen tegen neutrofielen zuiveren levert zeer zuiver neutrofielen en vertegenwoordigt beter het gehele circulerende neutrofielen repertoire. Echter, we hebben gemerkt dat hoe langer de neutrofielen geïncubeerd met antilichamen, de kans op niet-specifieke activering verhogen. We stellen daarom voor dat voor het beste resultaat, antilichaam-gebaseerde neutrofielen zuivering moeten worden zo snel mogelijk uitgevoerd. Antilichamen gebaseerde neutrofielen zuivering is ook de methode van keuze als purifying neutrofielen uit weefsels of tumoren.

Ongeacht de zuiveringsprocedure gekozen, de zuiverheid, levensvatbaarheid en functionele integriteit mag absoluut geëvalueerd. De zuiverheid van neutrofielen kan worden bepaald door middel van flowcytometrie onder gebruikmaking van antilichamen die reageren met neutrofielen oppervlaktemerkers. In muis Ly-6G is specifiek voor neutrofielen, die worden gekenmerkt door een CD11b + Ly-6C low Ly-6G + F4 / 80 - fenotype. Human neutrofielen niet drukken een marker analoog aan Ly-6G en worden vaak gekenmerkt door de expressie van CD11b, CD15, CD16, en CD66b. Aangezien neutrofielen Fc receptoren, moeten deze worden geblokkeerd voordat immunokleuring. Neutrofielen kunnen ook worden onderscheiden van de andere witte bloedcellen door het hebben van een hogere SSC. Levensvatbaarheid worden bepaald aan het einde van het zuiveringsproces (trypan blauw, protocol 2,1) en consequent meer dan 98% bedragen. Functionele integriteit moet worden bepaald door puricatie van neutrofielen uit naïeve muizen. De neutrofielen worden niet geactiveerd en zorgen niet cytotoxisch control bij tumor meegevoerd neutrofielen in een co-kweek omgeving met tumorcellen (protocol 7).

De korte halfwaardetijd van bloed neutrofielen alsmede het geringe aantal neutrofielen (~ 3-5 x 10 5) bereikt van 1 ml bloed van naïeve 6-8 weken oude muizen, hebben het moeilijk muizenbloed neutrofielfunctie staand binnen gemaakt vitro. Neutrofiel aantallen stijgen gestaag toestanden van inflammatie en soms met kanker, die een toestand van chronische ontsteking 7 vertegenwoordigt. Sommige onderzoekers hebben geprobeerd alternatieve bronnen voor neutrofielen, zoals het beenmerg 20 vinden. Een hoog aantal neutrofielen muis kunnen worden verkregen binnen 4-24 uur na intraperitoneale injectie van 1 ml van een 3% thioglycollaat bouillon oplossing of 1 ml van een 1 mg / ml Zymosan Een oplossing in zoutoplossing. Maar deze ontlokte neutrofielen niet uitoefenenny anti-tumorigene activiteit (ongepubliceerde waarneming).

. Granot et al opgemerkt dat 6 BALB / c muizen geïnoculeerd met orthotopically de muis 4T1 borstcarcinoom ontwikkelt neutrofilie die verergert upon tijd (Figuur 2A), zodat 20-40000000 bloedneutrofielen kan eenvoudig worden geïsoleerd uit 1 ml bloed 3-4 weken post-tumor inenting. Deze neutrofielen anti-tumor activiteiten verworven, en dienovereenkomstig zijn genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN), teneinde deze te onderscheiden van naïeve neutrofielen (figuur 2B). Terwijl high-density neutrofielen (HDN) zeer anti-tumorigene, low-density neutrofielen (LDN) gegenereerd in de context van kanker niet 21. High-density neutrofielen van beenmerg en milt van tumordragende muizen hebben ook anti-tumor activiteit (ongepubliceerde gegevens). Opgemerkt wordt dat bij tumorprogressie de milt geleidelijk vergroot (splenomegalie), met inkreuken hoeveelheden van neutrofielen.

Om het lot van neutrofielen volgen na de adoptieve overdracht, dient deze te worden aangebracht. Neutrofielen kunnen in vivo worden gemerkt door het injecteren van broomdeoxyuridine (BrdU) in tumordragende of naïeve muizen 2 dagen voor isolatie. BrdU is een analogon van de DNA precursor thymidine dat is opgenomen in nieuw gesynthetiseerde DNA in prolifererende cellen. Bij neutrofielen wordt BrdU in prolifererende precursor cellen die BrdU-kleuring behouden wanneer differentiëren tot rijpe post-mitotische neutrofielen worden opgenomen. De opgenomen BrdU kan worden gekleurd met specifieke anti-BrdU fluorescerende antilichamen. De BrdU + cellen kunnen dan worden geanalyseerd door flow cytometrie. Een andere benadering is de geïsoleerde neutrofielen label met een cel tracker kleurstof zoals 5-carboxyfluoresceïne N-succinimidyl ester (CFSE). CFSE een esterverbinding die kan passeren levensvatbare celmembranen. Het heeft een amino-reactieve succinimidylgroep die leidt naar de covalente binding van fluoresceïne eiwitten en andere aminogroepen in de cel en het celoppervlak. De CFSE-gelabelde cellen kunnen worden geanalyseerd door flow cytometrie met de 488 nm argon laser. De twee labeling technieken verschillen in het feit dat BrdU labeling afhangt prolifererende precursorcellen, en niet alle circulerende neutrofielen is vermeld, terwijl CFSE alle neutrofielen gekleurd worden. Detectie van CFSE is eenvoudiger dan BrdU kleuring, echter BrdU labeling is een goed middel om de onrijpe neutrofielen conversie rijpen volgen.

We hebben eveneens verschillende werkwijzen beschreven voor de anti-tumor en anti-metastatische werking van neutrofielen te bepalen. Deze omvatten neutrofielen uitputting, neutrofielen adoptieve overdracht, tumor neutralisatietest en long metastase zaaien assay. Elk van deze assays bewerkstelligt een specifiek aspect van anti-tumor neutrofiele functies. Zo Granot et al. 6 opgemerkt dat bij depletion van neutrofielen, is het aantal longmetastasen in 4T1-tumordragende muizen verhoogd, suggereert een anti-metastatische rol van neutrofielen. Bij neutrofielen adoptieve overdracht, worden de tumorcellen intraveneus geïnjecteerd 4 uur vóór injectie van gezuiverd HDN. Het vermogen van de tumorcellen long en levermetastasen vormt gevolgd in een tijdsverloop studie met gebruikmaking van een optisch afbeeldingsstelsel in vivo. Muizen die HDN kent minder metastatische foci dan wel controlemuizen 6. In de tumor neutralisatietest, worden de tumorcellen subcutaan geïnjecteerd met of zonder HDN, aanwezigheid van HDN vermindert tumorgroei 21. In het metastatische seeding bepaling worden GFP-gelabelde tumorcellen intraveneus ingespoten control of neutrofielen uitgeput pre-metastatische tumor dragende muizen, en het vermogen van de GFP-gemerkte cellen zaaizaad in de longen wordt bepaald. De longen van pre-metastatische tumor dragende muizen worden gekenmerkt door hoge neutrofiel infiltratie die tumor verhindertzaaien van cellen in de specifiek orgaan 6. Dit vertaalt zich naar meer metastatische foci in neutrofielen uitgeputte muizen vergeleken met de controle-tumor dragende muizen.

De protocollen beschreven gericht op het bestuderen van neutrofiel functie in de context van kanker en reiken strategieën kankergerelateerde neutrofielen eigenschappen zowel in vitro als in vivo geëvalueerd. De neutrofiel zuiveringsstrategieën evenals enkele van de beschreven experimentele procedures kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van neutrofielen bij een groot aantal experimentele omgeving waar neutrofielen spelen een cruciale rol (bijvoorbeeld, ontsteking en infectie).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ZG wordt ondersteund door subsidies van de I-CORE programma van de Israel Science Foundation (Grant No. 41/11), de Abisch-Frenkel Stichting, het Rosetrees Trust, het Israël Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award) en de ZORG stichting. ZGF wordt ondersteund door subsidies van de Israël Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award), Chief Scientist van het Israëlische Ministerie van Volksgezondheid en de Israël Lung Association.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Tags

Immunology neutrofielen isolatie-tumor meegevoerd neutrofielen high-density neutrofielen low-density neutrofielen anti-tumor cytotoxiciteit BrdU labeling CFSE labeling luciferase assay neutrofielen depletie anti-metastatische activiteit longen uitgezaaide zaaien assay neutrofielen adoptieve overdracht.
Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sionov, R. V., Assi, S.,… More

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter