Introduction
Beweging controle is een kernfunctie van het centrale zenuwstelsel (CNS). Motoriek is de belangrijkste uitgangsignaal van CNS-functie en de belangrijkste mogelijkheden voor mensen om te communiceren met de buitenwereld. Het begrijpen van de principes van de motorische functie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan het leren van een motorische taak is momenteel een van de grote uitdagingen in de neurowetenschappen. Morfologische, fysiologische en moleculaire veranderingen werden gevonden bij de overname van een nieuwe motor taak. Bijvoorbeeld, de vorm en het aantal synapsen veranderen als reactie op mobiliteitsfuncties training 1-5 en functionele veranderingen van de synaptische systeem waargenomen na motorisch leren. Synaptic was hoger in de aansluitingen van de voorpoot die regio de getrainde motorische cortex vergeleken met de ongeoefende halfrond van hetzelfde dier of antwoorden van ongetrainde dieren 6,7. Elektrofysiologische waarnemingen suggereren ook dat langetermijnpotentiëring (LTP) en lange-termijn depressie (LTD) zoals mechanismen plaatsvinden tijdens het leren van een nieuw motorische vaardigheden en dat het bereik van synaptische operatie, die wordt gedefinieerd tussen de beperkende grenzen van LTP en LTD verzadiging wordt gewijzigd 8. Bovendien is aangetoond dat de activiteit merkers en plasticiteit bevorderen moleculen zoals c-fos, GAP-43, of BDNF maar plasticiteit remmende moleculen zoals Nogo-Weergeefinrichting regelgevingsrollen voor leergerelateerde neuronale plasticiteit 9-16.
Deze voorschotten op weg naar een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het motorisch leren kon alleen worden bereikt met het gebruik van behavioral paradigma's die een nauwkeurige controle op de verwerving van een nieuwe motorische vaardigheden, bijvoorbeeld, geschoolde voorpoot verstrekkende mogelijk te maken. Slechts een gestructureerde gedragstaak maakt het bewaken en vastleggen van correlatieve veranderingen die optreden op het leren en uitvoeren van de respectievelijke taak. Here we visueel een gewijzigde versie van de geschoolde voorpoot tonensingle-pellet bereiken taak bij ratten aangepast van Buitrago et al. 17 De gepresenteerde paradigma laat de analyse van de beweging overname binnen een dagelijkse training (binnen-sessie) die de snel leren component en primaire acquisitie evenals geschoolde motorisch leren over verschillende sessies (tussen-sessie) die de langzame leren component en het onderhoud van de geleerde taak 18. Belangrijk is dat deze behavioral paradigma verhoogt de moeilijkheidsgraad en complexiteit van de motorische taak vanwege twee kenmerken: Ten eerste, worden de ratten getraind om te draaien rond hun as na elke greep en zo hun lichaam opnieuw uitlijnen voor de volgende pellet bereik en verlengen het lichaam oriëntatie, het voorkomen van constante uitvoering beweging vanuit dezelfde hoek. Ten tweede, worden pellets opgehaald uit een verticale staander geplaatst voor de kooi. Vanwege de kleine diameter van de post, kunnen pellets gemakkelijk worden afgetrapt die een nauwkeurige greep voor een succesvolle ophalen en preventing eenvoudig trekken van de pellet in de richting van het dier.
Dergelijke complexe gedragsproblemen testen laat dieper inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het motorisch leren. In vergelijking met muizen, ratten superieur in hun bij complexe gedragstaken en daardoor beter geschikt voor complexe paradigma zoals gepresenteerd in deze studie. Gezien de toenemende genetische mogelijkheden voor ratten 19,20, de combinatie van nauwkeurige en goed gecontroleerde behavioral testmethoden met genetische manipulaties, beeldvorming en fysiologische technieken vormt een krachtige gereedschapskist om beter inzicht in de neurobiologische basis van motorisch leren en geheugen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Veterinair Bureau van het kanton Zürich, Zwitserland.
1. Dierlijke Behandeling en Gewenning
- Animal Handling
Opmerking: 5 dagen voor de start van het experiment, stap 1.1.1 voeren dagelijks.- Voor gedragsexperimenten, wennen de dieren naar de experimentator. Heb dagelijkse behandeling sessies van 10-15 minuten per dier. Maak de doos na sessie van elk dier.
- Aanvankelijk plaatst de hand van de experimentator in een kooi, waardoor de dieren om te verkennen en te ruiken aan vertrouwd gemaakt met de experimentator te worden.
- Vervolgens, til het dier met de hand van de experimentator op een veilige manier door grijpen het lichaam van de rat tussen de voor- en achterpoten waardoor verdere kennismaking.
- Weeg elk dier dagelijks in om een basislijn lichaamsgewicht voor het onthouden van voedsel te verkrijgen.
- Apparatuur Gewenning en Voedselkwaliteit Kennismaking
- Weeg elk dier dagelijks in om een basislijn lichaamsgewicht voor het onthouden van voedsel te verkrijgen.
- Start voeding ontnemen ratten 3 dagen voor het begin van pre-training op een standaard laboratorium dieet. Geef ratten 0,05 gram voedsel per 1 gram lichaamsgewicht per dag (bijvoorbeeld een rat met een gewicht van 200 g, beginnen met 10 g voedsel). Zorgen lichaamsgewicht meer dan 10% per dag niet afnemen monitoren lichaamsgewicht per dag.
- Als er meerdere dieren worden gehouden in een kooi, kan dominante ratten meer dan minder dominant degenen eten. In het geval het lichaamsgewicht van een dier afneemt, voer het dier afzonderlijk in plaats van de groep geeft. Geef water ad libitum.
- Om de rat met het grijpen apparaat vertrouwd te maken, plaatst u het dier in de doos training (figuur 1). Hebben suiker pellets in de box geplaatst training in de nabijheid van de ingesneden opening aan het dier met het voedsel pellets vertrouwd. Voer deze step 10-15 minuten per dag gedurende 3 dagen.
2. Pre-training en motorische vaardigheden leren
- Pre-training
- Een dag na gewenning, plaats het dier in het vak training en plaats de pellet nauw samen om de spleet opening, zodat het kan worden bereikt door de tong van het dier. Dieren die pellets met hun voorpoot te halen uit te sluiten tijdens de pre-training
Opmerking: In dit stadium pellet retrieval met de tong cruciaal en meestal voorkeurswerkwijze van het dier. Pellets moeten in geen geval begrepen de voorpoot tot de eerste dag van de motorische vaardigheden leren om adequaat toezicht op de geleerde bereiken taak mogelijk te maken. Pellet ophalen met de voorpoot tijdens de pre-training is een uitsluiting criterium en is in de meeste gevallen niet waargenomen. - Leer de rat om ofwel lopen naar de achterzijde van de kooi en terugkeren naar de ingesneden opening of stap terug en draaien rond zijn eigen as om de volgende voedselpellet ontvangen metde tong. Laat tijd voor het dier naar de kooi te verkennen, lopen aan de achterzijde en terug te keren naar de spleet opening. Wanneer het dier de taak niet goed worden uitgevoerd als, gebruikt een tang om voorzichtig tikken eind achterzijde van de kooi en aandacht vangen van het dier. Zodra het dier aan de achterzijde voorzichtig tikken op de kooi voor het dier leiden naar de spleetopening.
Opmerking: Nadat het dier een gedefinieerde standaard waarde bereikt (bijvoorbeeld, 50 succesvolle pellet opvragingen met de tong in minder dan 15 min), het dier in aanmerking komt voor de motorische vaardigheden leerfase. Op dag 1 en 2 van pre-training kunnen cursisten reeds onderscheiden van niet-leerlingen. Non-leerlingen kan uit het onderzoek bij deze stap worden uitgesloten. Dit vermindert de waarschijnlijkheid van een groot aantal niet-cursisten in de motor leren stap (2.2). - Tijdens de pre-training, voedsel ontnemen ratten op een standaard laboratorium dieet. Geef water ad libitum. Monitor lichaamsgewicht per dag gedurende de studie. DoenGebruik dezelfde kamer aan mannelijke en vrouwelijke ratten trainen. Zorg voor een rustig en ruisvrije omgeving voor het dier.
- Een dag na gewenning, plaats het dier in het vak training en plaats de pellet nauw samen om de spleet opening, zodat het kan worden bereikt door de tong van het dier. Dieren die pellets met hun voorpoot te halen uit te sluiten tijdens de pre-training
- Bepaling van Paw Preference en motorische vaardigheden leren
- Tijdens de eerste zitting van motorische vaardigheden leren, vervangt de schuif aan de voorkant van het venster met een post. Plaats de suiker pellet ongeveer 1,5 cm afstand van het raam op de post, zodat het dier de korrel met zijn tong niet kan bereiken, maar alleen op te halen door een nauwkeurige voorpoot reiken en grijpen beweging.
- Om pellet ophalen dwingen de voorpoot, gebruik een tang om voorzichtig breng de pellet dicht bij de mond van het dier en schuif de pellet, terwijl het dier tracht consumentenproducten onder de tong. Voer deze taak herhaaldelijk totdat het dier strekt zich uit van de voorpoot en grijpt een pellet.
- Plaats de paal centraal in de vensteropening. Om poot voorkeur te bepalen, goed te kijken naar de eerste 10 proeven op training dag 1. Meer dan 70% van de reaching pogingen (dat wil zeggen, 7 van de 10) moeten worden uitgevoerd met dezelfde voorpoot. Indien dit niet wordt bereikt, verder met een andere ronde van 10 proeven tot 70% wordt bereikt.
- Na poot voorkeur vastberadenheid, verschuiven de post naar de gewenste voorpoot en lijn centraal aan de rand van de raamopening. Geprefereerde paw uitlijnmiddelen de paal is in strijd verschoven naar de respectievelijke poot een optimale hoek staan voor het bereiken (Figuur 1B, C).
- Classificeren een proef, gedefinieerd als een nieuwe pellet gepresenteerd aan het dier, zo succesvol (te bereiken, greep, ophalen en eet de korrel), drop (te bereiken, greep en verliest pellet tijdens retrieval) of niet (knock pellet de paal). Noteer elke beproeving in je vel en analyseren van de gegevens na het experiment.
- Voer een dagelijkse sessie bestaat uit een bepaald aantal studies (bv 150) of een maximale tijd (bijvoorbeeld 1 uur) voor elk dier.
- Onderzoek precisie en fine-tuningvan de beweging met behulp van eerste poging analyse. Een eerste poging wordt bepaald door het grijpen van de pellet in een enkele monolithische beweging zonder onderbreking, aarzeling of herhaling van de individuele beweging componenten. Observeren elke greep door de rat voorzichtig.
- Als de rat aarzelt of terugtrekt tijdens een bereik of pogingen verschillende proeven te kunnen begrijpen van de pellet, let op de respectieve proces als succes, maar niet de eerste poging. Als het dier met succes grijpt de pellet in een enkele monolithische bereik, noteer het desbetreffende proces zo succesvol eerste poging in een aparte kolom in uw vel.
- Tijdens motorische vaardigheden leren, voedsel ontnemen ratten op een standaard laboratorium dieet. Geef water ad libitum. Monitor lichaamsgewicht per dag gedurende de studie.
- Tijdens de eerste zitting van motorische vaardigheden leren, vervangt de schuif aan de voorkant van het venster met een post. Plaats de suiker pellet ongeveer 1,5 cm afstand van het raam op de post, zodat het dier de korrel met zijn tong niet kan bereiken, maar alleen op te halen door een nauwkeurige voorpoot reiken en grijpen beweging.
- Voor gedragsexperimenten, wennen de dieren naar de experimentator. Heb dagelijkse behandeling sessies van 10-15 minuten per dier. Maak de doos na sessie van elk dier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle motorische vaardigheid overname wordt alleen bereikt door de vaste praktijk. Ondanks zorgvuldige afweging van alle aspecten, waarvan sommige ratten niet de taak (figuur 2) leren. Deze "niet-lerende missen ofwel motivatie resulteert in weinig of afwezige pogingen pellets retrieval vanaf de start van het experiment of algemeen verliezen interesse bereiken van de pellets waardoor continu mislukte pogingen. Daarentegen, sommige dieren vertonen agressief en over-gemotiveerd gedrag resulteert in overhaaste en rende grijpen pogingen die leiden tot storingen. Een derde groep van succesvolle leerlingen zijn die dieren die met hoge slagingspercentages en geen significante verbetering leidt tot stagneren of zelfs gedaald leren bochten niet maken.
Succesvolle motorische vaardigheden leren bestaat uit twee fases: Een snelle leercomponent vertegenwoordigen primaire overname meestal waargenomen binnen de eerste dag van de motor training (binnen-sessie;
Om de prestaties tijdens elke dagelijkse sessie (binnen-sessie analyse) te analyseren, verdeel het totale aantal proeven in 25 proef bakken (bijvoorbeeld 6 bakken voor 150 trials). Na het experiment wordt het percentage van succesvolle begrepen pellets voor elke bin door deling van het aantal successen in de betreffende bak door het totale aantal proeven met de respectieve dag.
Er moet worden overwogen dat motorische vaardigheden verwerven kan variëren tussen individuele dieren. Verschillende ratten hebben verschillende aantallen dagen naar het plateau niveau te bereiken. Zo individueel leren curves zijn gebruikelijkely niet zo glad als de gemiddelde leercurve.
Een andere uitdrukking van succesvolle motor leren is de analyse van de afgestemd motorisch leren. Zou hierover, maten we het aantal pellets gegrepen bij de eerste poging bij een monolitische bewegen zonder aarzeling of verstoringen in vergelijking met alle succesvol gemeten pellets (Figuur 5).
De voorbeelden in figuur 2-5 tonen de leercurve van 150 begrepen pellets / dag in de loop van 6 dagen. Dag 1 betrekking op de eerste dag van motorisch leren.
Figuur 1: Ontwerp van de doos training rat (A) De training doos met zijn respectievelijke afmetingen.. Voor het ophalen van pellets die verloren zijn gegaan in de doos te vermijden, wordt de bodem van de training kamer van metalen staven , Waardoor verloren pellets vallen. (B) Sluit het oog van de spleet opening en de post. Let op de positie van de paal uitgelijnd centraal in de spleetopening. (C) Voorbeeld van een rat met succes grijpen een pellet door de spleetopening. Let op de verschoven na de positie en de resulterende hoek naar geprefereerde voorpoot van het dier (in dit geval rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Voorbeeld van een dier dat niet vertonen succesvolle overname van de motorische vaardigheden in de loop van 6 dagen Het succespercentage stagneert ongeveer 20% zonder verbetering verdere training.
ad / 53010 / 53010fig3.jpg "/>
Figuur 3: In-dag-analyse van hetzelfde voorbeeld als getoond in figuur 4. Het slagingspercentage is verdeeld in 6 bakken van 25 pellets illustreren de verbeterde motor educatie in een enkele dagelijkse sessie. Let op de aanvankelijke succes tijdens de eerste 25 proeven van de eerste 2 dagen ten opzichte van het slagingspercentage van de betreffende dag in figuur 4 en de algemene verbetering binnen dagen 1 en 2 in vergelijking met figuur 4.
Figuur 4:. Voorbeeld van een dier met een typisch succesvol leercurve in de loop van 6 dagen Het percentage succesvolle begrepen pellets (succes) toeneemt tijdens de eerste 3 dagen en bereikt een plateau tijdens de resterende dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in deze studie paradigma is een bewerking van Buitrago et al 18 en verschilt van de klassieke interne korrel bereiken paradigma 17 voornamelijk in twee aspecten.:
Ten eerste, het bestuderen van binnen-sessie verbetering maakt analyse van de geleerde taak binnen één dag, die een ander niveau van de informatie kan verstrekken, zoals onderzoek naar de snelle learning component in vergelijking met de langzame leren component weergegeven door de gemiddelde dagelijkse waarden (zie figuren 3 en 4). Ten tweede, de gedrags paradigma hier gepresenteerde verhoogt de moeilijkheidsgraad en complexiteit van de motorische taak. Het dier wordt gedwongen om zijn lichaam en het bereiken oriëntatie uitlijnen voor elke pellet retrieval. Dit voorkomt eenvoudige repetitieve uitvoering beweging vanuit dezelfde hoek en noopt tot een grondige ruimtelijke oriëntatie. Bovendien zijn pellets opgehaald uit een dunne verticale staander die is geplaatst voor the kooi en past bij de diameter van de korrel die aldus een nauwkeurige greep voor een succesvolle ophalen en voorkoming eenvoudig trekken van de pellet in de richting van het dier.
Een belangrijke stap leert het dier lopen aan de achterzijde van de kooi en terugkeren naar de ingesneden opening tijdens de pre-training. Hinting de rat naar de gewenste locatie met behulp van een tang en zacht omschakelen tussen achterzijde van de kooi helpt het dier om de taak te begrijpen. De experimentator moet dit instrument zorgvuldig te gebruiken als overtapping produceert te veel lawaai en irriteert het dier. Zodra de rat is teruggekeerd naar de voorzijde van de kooi door diverse suiker pellets in de ingesneden opening van de dieren om te wennen aan de smaak, geur en locatie van de pellet krijgen. Een andere belangrijke stap is pellet ophalen met de voorpoot op de eerste dag van het motorisch leren. Het dier blijft vaak pogingen om de pellet op te halen met de tong als geleerd tijdens de pre-training. Met behulp van een tang om voorzichtig te brengen the pellet dicht bij de mond en intrekken van de pellet van het dier, terwijl het dier pogingen consumentenproducten onder de tong dwingt de rat te strekken de voorpoot voor succesvolle pellet ophalen. Het doel is om het dier aan de pellet van de tang met de voorpoot te begrijpen en de suiker pellet om zijn mond te halen. Zodra dit is bereikt, kunnen pellets worden geplaatst op de post en poot voorkeur bepaling kan worden geëvalueerd. Deze twee stappen zijn de cruciale onderdelen van het gehele experiment en vereisen een voorzichtige aanpak het dier en geduld van de experimentator.
Het is belangrijk op te merken dat de verschillen in leren bestaan tussen individuele dieren en tussen geslacht (mannetjes kom langzamer dan vrouwen 18) en stammen (volgens onze waarneming, Sprague-Dawley-ratten die in deze studie en Long-Evans ratten superieur leren opzichte bijvoorbeeld Lewis-ratten). Aldus, om te voldoen aan de uitdagende vereisenmenten van de taak, kan slagingspercentages modificaties van het paradigma, afhankelijk van geslacht en stam vereisen. Om de variantie laag te houden, niet stammen en geslacht te mengen in een experimentele serie.
Goed gestructureerde en controleerbare behavioral paradigma's zijn van cruciaal belang voor onderzoeken naar cellulaire correlaten onderliggende mechanismen van pathologische en fysiologische gedrag. De complexere gedragstaken dat ratten zijn in staat om te leren een belangrijk voordeel ratten in muizen. De voortdurende vooruitgang in de technologie voor genetische manipulaties in de rat zal in de nabije toekomst experimenten in ratten die tot nu toe alleen bij muizen 19-21 waren. In combinatie met nieuwe imaging technologieën en technieken waardoor gerichte manipulatie van neuronale circuits, kunnen gedragsproblemen paradigma bij ratten nieuwe wegen naar het begrijpen van fysiologische en pathologische principes van het zenuwstelsel functies te openen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Swiss National Science Foundation (Grant 31003A-149315-1 om MES en Grant IZK0Z3-150809 naar AZ), om AZ de Heidi Demetriades Foundation, aan de European Research Council ('Nogorise'), MES en de Christopher en Dana Reeve Foundation (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Yu, X., Zuo, Y.
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290, 533-536 (2000).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Hess, G., Donoghue, J. P. Strengthening of horizontal cortical connections following skill learning. Nature neuroscience. 1, 230-234 (1998).
- Rioult-Pedotti, M. S., Donoghue, J. P., Dunaevsky, A.
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66, 198-204 (2010).
- Ghiani, C. A., Ying, Z., de Vellis, J., Gomez-Pinilla, F. Exercise decreases myelin-associated glycoprotein expression in the spinal cord and positively modulates neuronal growth. Glia. 55, 966-975 (2007).
- Josephson, A., et al. Activity-induced and developmental downregulation of the Nogo receptor. Cell and tissue research. 311, 333-342 (2003).
- Karlen, A., et al. Nogo receptor 1 regulates formation of lasting memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20476-20481 (2009).
- Kleim, J. A., Lussnig, E., Schwarz, E. R., Comery, T. A., Greenough, W. T. Synaptogenesis and Fos expression in the motor cortex of the adult rat after motor skill learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 4529-4535 (1996).
- Mironova, Y. A., Giger, R. J. Where no synapses go: gatekeepers of circuit remodeling and synaptic strength. Trends in neurosciences. 14, 7-23 (2013).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. Neuroscience. 14, 7-23 (2013).
- Zemmar, A., et al. Neutralization of Nogo-A enhances synaptic plasticity in the rodent motor cortex and improves motor learning in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 8685-8698 (2014).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural brain research. 41, 49-59 (1990).
- Buitrago, M. M., Ringer, T., Schulz, J. B., Dichgans, J., Luft, A. R. Characterization of motor skill and instrumental learning time scales in a skilled reaching task in rat. Behavioural brain research. 155, 249-256 (2004).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tews, B., et al. Synthetic microRNA-mediated downregulation of Nogo-A in transgenic rats reveals its role as regulator of synaptic plasticity and cognitive function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 681-683 (2013).
