Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beeldvorming van de intracellulaire mensenhandel van APP met fotoactiveerbare GFP

Published: October 17, 2015 doi: 10.3791/53153
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University

Summary

Hoewel het transport van celoppervlak-eiwitten relatief gemakkelijk bestudeerd visualiseren van de handel in intracellulaire eiwitten is veel moeilijker. Hier gebruiken we constructen waarin activeerbare GFP en tonen een werkwijze om nauwkeurig volgen amyloïd precursor eiwit van het Golgi apparaat naar stroomafwaartse compartimenten en volg de klaring.

Abstract

Beta-amyloïde (AB) is het hoofdbestanddeel van seniele plaques in de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer. Aß wordt afgeleid van de opeenvolgende splitsing van Amyloid Precursor Protein (APP) van β en γ-secretasen. Ondanks het belang van Aß AD pathologie, de subcellulaire lokalisatie van deze splitsingen niet goed vastgesteld. Werken in ons laboratorium en anderen impliceren de endosomale / lysosomale systeem APP verwerking na internalisatie van het celoppervlak. Echter, de intracellulaire mensenhandel van APP is relatief weinig bestudeerd.

Terwijl celoppervlakte-eiwitten wijzigbaar vele labeltechnieken, er geen eenvoudige werkwijzen voor het volgen van het transport van membraaneiwitten uit de Golgi. Daartoe hebben we APP constructies die werden gelabeld met foto-activeerbare GFP (paGFP) aan de C-terminus. Na synthese paGFP een lage basale fluorescentie, maar kan worden gestimuleerd met 413 nm licht to produceren een sterke, stabiele groene fluorescentie. Via de Golgi marker galactosyltransferase gekoppeld Cyan Fluorescent Protein (GalT-GVB) als doelwit, kunnen wij nauwkeurig photoactivate APP in het trans-Golgi netwerk. Foto-geactiveerde APP-paGFP kan dan worden gevolgd als het trafieken aan downstream compartimenten geïdentificeerd met fluorescent gelabeld compartiment markereiwitten voor de vroege endosoom (Rab5), de late endosoom (Rab9) en de lysosomen (LAMP1). Bovendien gebruiken remmers APP verwerking zoals chloroquine of γ-secretase inhibitor L685, 458, kunnen wij pulse-chase experimenten met de verwerking van APP in individuele cellen te onderzoeken.

We vinden dat een groot deel van APP beweegt snel naar het lysosoom zonder dat het lijkt op het celoppervlak, en vervolgens uit het lysosoom gewist door secretase-achtige splitsingen. Deze techniek toont het nut van paGFP voor het volgen van de handel in en verwerking van intracellulaire eiwitten weerm de Golgi stroomafwaarts compartimenten.

Introduction

Het kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD) is de aanwezigheid van seniele plaques en neurofibrillaire tangles (NFT's) in de hersenen. Het belangrijkste bestanddeel van seniele plaques is β-amyloïde (AB). Aß wordt afgeleid uit zijn precursor; amyloïd precursor eiwit (APP) 1. De amyloidogenic splitsing van APP begint met het verwijderen van het ectodomein van APP door β-secretase 2. De overblijvende 99 residu carboxyl terminale fragment (CTF) kan worden gesplitst door γ-secretase Ap 3-7 te produceren. Hoewel veel experimenten de splitsing van APP celoppervlak hebben gedocumenteerd na internalisatie van het celoppervlak in het endosomale / lysosomale systeem een aantal recente studies hebben gesuggereerd dat intracellulair transport van APP is ook belangrijk bij de regulering van de verwerking 11/08.

Er zijn een aantal pogingen geweest bij het moduleren van de niveaus van Aß met γ-secretase remmers en Ap immunotherapies. Echter, recente klinische onderzoeken met deze therapieën vertoonden geen voordeel en, in sommige gevallen veroorzaakt schade 12. Een onbenutte strategie Ap moduleren is om de subcellulaire lokalisatie van APP en γ-secretase interactie veranderen. Het Golgi, plasmamembraan en endosomen / lysosomen zijn allemaal voorgesteld als mogelijke plekken voor γ-splitsing van APP. Onderzoek naar onze laboratorium blijkt dat APP en de γ-secretase woonachtig zijn eiwitten van het lysosomale membraan 13. Verder hebben wij gevonden dat de lysosomale γ-secretase een zure optimale pH 13. Bovendien alkalisering van de endosomale / lysosomale systeem met chloroquine of NH 4 Cl, is aangetoond dat de productie van Ap 14 verminderen. y-secretase remming of knockout of Preseniline leidt tot APP-CTFs ophoping in de lysosomen 15-17. Bovendien verstoren APP endocytosis verlaagt Ap productie 18-20.

Ondanks het belang van de Golgi als sorteerstation voor ontluikende proteïnen en eiwitten gerecycleerd uit de endosomale / lysosomale systeem, is de intracellulaire mensenhandel van APP niet in detail bestudeerd 21. Recent werk heeft aangetoond dat APP kan worden teruggevoerd naar het trans-Golgi netwerk (TGN) via interactie met de retromer complex. Neerwaartse regulatie van de retromer complex vermindert Aß productie 8,22-24. De uitgang van APP uit de Golgi is niet goed bestudeerd.

Hoewel na de endocytose van celoppervlakte-eiwitten, zoals de transferrinereceptor, gemakkelijk gelabeld en vervolgens, na het transport van intracellulaire eiwitten moeilijker. In feite hebben weinig eiwitten hadden hun intracellulaire mensenhandel afgebeeld. De komst van fluorescerend eiwit markeringen, zoals foto-activeerbare-GFP (paGFP) heeft nieuwe instrumenten verschaft om intracellulair verkeer te onderzoeken. Foto-activeerbare-GFP is een vorm van GFP, dat is bijna onzichtbaar na de synthese, maar ontwikkelt zich sterk groen (GFP) fluorescentie na wordt geactiveerd door 413 nm laserlicht en dit signaal is stabiel dagen 25,26. Constructen gebruikt paGFP zijn gebruikt om de intralysosomal handel van het lysosomale eiwit aantonen membraaneiwit 1 (LAMP1) 25, het celoppervlak levering van de Vesiculaire Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVG, een marker van de secretieroute) 27 en de omzet van peroxisomen 28 en 29 autofagosomen.

Om het sorteren van APP van de TGN in levende cellen zichtbaar, ontwierpen we plasmide dat de laatste 112 aminozuren van APP gekoppeld met foto-activeerbare (paGFP) op de C-terminal (hierna PAPP-paGFP) 30. Ook hebben we deze experimenten uitgevoerd met volledige lengte APP en vergelijkbare resultaten behaald; de PAPP construct wordt hier gebruikt omdat het helderdere beelden. Vervolgens hebben we foto-activate &# 946; APP-paGFP alleen in de TGN, zoals afgebakend door de TGN marker galactosyltransferase (GalT). Hoewel APP is gemarkeerd met paGFP een snelle axonale transport van APP en klaring visualiseren van de perinucleaire regio, dit is de eerste demonstratie van APP handel van een nauwkeurig omschreven naar het andere 11,31,32. Hier tonen we nauwkeurige foto-activering binnen de TGN en de uitgang van APP in downstream compartimenten en de daaropvolgende splitsing en de klaring van lysosomen 30. De nauwkeurige foto-activatie in de Golgi is breed toepasbaar op andere eiwitten systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Plating en Transfectie

  1. In een celkweek kap, plaat ~ 300.000 tot ~ 500.000 SN56 cellen (een soort geschenk van Dr. Jane Rylett) op een 35 mm glazen bodem confocale schaal en bedek met pre-transfectie media (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, aangevuld met 10% FBS).
  2. Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator te prolifereren.
    Opmerking: De cellen moeten ongeveer 50% -70% confluent voor transfectie zijn.
  3. In een celkweek kap, transfecteren cellen met plasmiden die een fluorescerend eiwit gelabeld TGN marker (galactosyltransferase- gekoppeld aan Cyan Fluorescent Protein, GalT-CFP), een fluorescerend eiwit gelabeld compartiment marker (hier lysosome geassocieerd membraaneiwit 1, LAMP1, gelabeld met mRFP), en het eiwit van belang gelabeld met paGFP (PAPP-paGFP). (Deze constructen zijn eerder beschreven 30)
  4. Incubeer de cellen met transfectie reagens en plasmide-DNA fof 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Met een verhouding van ~ 2 ug DNA tot 5 ui transfectiemiddel (bijvoorbeeld Lipofectamine 2000) goede balans cytotoxiciteit en transfectie-efficiëntie. Werkelijke concentraties moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende plasmiden. In de hier beschreven experimenten, gebruik 1 ug / confocale schotel van PAPP-paGFP, 0,3 ug / confocale schotel van LAMP1-mRFP en 0,2 ug / confocale schotel van GalT-GVB.
    Opmerking: De hoeveelheid plasmide zal afhangen van transfectie-efficiëntie.
  5. Voor neuronale cellijnen: Na stap 1,4, in een celkweek kap, verwijdert pre-transfectie media en differentiëren SN56 cellen in 2 ml DMEM aangevuld met 0,1% penicilline / streptomycine met 1 mM dibutyryl cyclisch AMP (dbcAMP) gedurende 24 uur.

2. microscoop podium Voorbereiding

  1. Pre-warm-fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) tot 37 ° C. Warm-up microscoop stadium vóór Imaging tot 37 ° C.
  2. Was de cellen tweemaal met PBS, differentiatie media verwijderd en vervangen door 2 ml HBSS bij 37 ° C. Plaats cellen op microscooptafel verwarmd tot 37 ° C.
    Opmerking: De cellen levensvatbaar gedurende ongeveer 1,5-2 uur in HBSS.
  3. Laat 5-10 min voor confocale plaattemperatuur evenwicht komen met de microscoop podium.

3. Foto-activering van ROI over de Golgi

  1. Met de microscoop oculair, vind cellen die met GalT-GVB LAMP1-mRFP en PAPP-paGFP.
    1. Gebruik een olie-immersie objectief met een hoge vergrotingsfactor (dwz 63X of 100X). Voor visuele conformatie van fluorescentie, gebruik maken van een filter instellen staat visualiseren FITC (voor het GVB en GFP fluorescentie) en rhodamine (voor mRFP fluorescentie).
  2. Stel de confocale segment voor elk kanaal 1 urn. Neem het met een lage resolutie.
  3. Gewas om de afbeelding alleen de cel van belang.
  4. Met behulp van de regelknop, handmatig in te stellenhet brandvlak naar het midden van de cel. Dit is typisch het deel van de cel waar de kern het grootste.
  5. Tekenen 3-5 cirkelvormige Regio's van belangen (ROI) binnen de TGN (GalT GVB-fluorescentie).
    1. Om ROI te trekken (dat wil zeggen in de Zeiss LSM-programma), selecteer de 'Edit ROI' knop in de command console.
    2. Selecteer de ronde ROI knop.
    3. Klik en sleep dan GalT GVB-positieve gebieden van de cel.
      Opmerking: De foto-bleken pakketten voor veel microscopen hebben deze mogelijkheid.
  6. Neem een ​​beeld van de cel met de overlay ROI. Sla een kopie van de ROI voor latere referentie.
    1. Om de ROI te slaan in de afbeelding, selecteert u de knop 'Macro'.
    2. Druk op de "Load" knop om de 'CopyRoisToOverlay' (pad: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb) starten.
      Opmerking: Een confocale microscoop voorzien van 475-525 nm (GVB) band pass (BP), een 500-530 nm BP (GFP),en een 560 nm lange pass (LP) filter sets nodig. Een argon laser van 458 nm en 488 nm emissie en een HeNe laser van 540 nm emissie is ook vereist.
  7. Set-up van de microscoop voor een bleekmiddel tijdsverloop.
    1. Stel de laserdiode (25 mW 405 nm laser) maximaal vermogen.
      Let op: Overmatig foto-activering kan leiden tot een foto-toxiciteit of schade aan de celmembranen. Gebruik oogbescherming om schade aan het netvlies te voorkomen.
    2. Set-up van de microscoop voor 120 cycli van beeldvorming.
      Opmerking: Een imaging cyclus bestaat uit het bleken binnen de ROI en de beeldvorming van de gehele cel. Dit is een bleekmiddel tijdsverloop.
    3. Stel de microscoop te bleken (foto-activeren) alleen de ROI voor 20-30 herhalingen na elke afbeelding. De tijd om imago en bleekmiddel een beeld zal variëren. Stel een vertraging tussen de beelden, zodat elke cyclus is ongeveer 30 sec.
      Opmerking: De beeldvorming gedeelte van elke cyclus duurt ongeveer 15-30 seconden, afhankelijk van het beeldformaat. Het bleken voor elke ROI is ongeveer 50 msec. Bleken van 4 ROI voor 20 iteraties zal 4 seconden aan het einde van elke bleken / image cycle.
  8. Start het bleekmiddel tijdsverloop.
  9. Zet het bleken na 15 min (30 cycli van beeldvorming en bleken), maar verder vastleggen van beelden van de cel.
    Opmerking: Tijd 0 tot 15 min is de 'hartslag' periode.
  10. Blijven vastleggen van beelden gedurende 45 min (zonder bleken), de goedkeuring van de PAPP-paGFP volgen.
    Opmerking: Tijd 15 tot 45 minuten is de 'jacht' periode.
  11. De analysemethode in stap 6 is beschreven, co-lokaliseren de eiwit van belang (hier PAPP-paGFP) met het compartiment van belang (hier LAMP1-mRFP) door vlakken elk kanaal.

4. Bepaal de Downstream compartiment

  1. Om te bepalen of lysosomen (in deze experimenten) de eindkamer, voeg membraan-permeabel proteaseremmers veroorzaken eiwitten accumuleren in het lysosoom.
    1. Voor PAPP Gebruik 0,5 uM L685, 458 (specifieke γ-secretase remmer) 's nachts of 100 uM chloroquine (deacidifies lysosomen) gedurende 30 minuten voor de beeldvorming.
  2. Vind cellen en photoactivate als in stap 3,1-3,8.
  3. Beeld de cel gedurende nog 45 min (zonder foto-activering) om te bepalen waar PAPP-paGFP accumuleert in afwezigheid van splitsing.
  4. Analyseer het leveren van eiwit aan lysosomen (of andere stroomafwaartse compartiment) en opeenvolgende afstanden overeenkomstig de in stap 6 beschreven werkwijze.

5. Zorg ervoor Nauwkeurigheid van de Foto-activering binnen de Golgi

  1. Warm-up HBSS tot 37 ° C.
  2. Bereid een 2 ml oplossing voor elke confocale plaat af te beelden, van 66 pM nocodazole (behandeling) of DMSO (controle) in HBSS.
    1. Voor een confocale plaat, pipet 2 ml van 37 ° C HBSS en voeg 7,96 ul van nocodazole uit een 16,60 mM nocodazole voorraad.
    2. Als een controle, zodatlutie, pipet 2 ml van 37 ° C HBSS in een 2 ml buisje en voeg 7,96 pl DMSO.
  3. Incubeer cellen in HBSS met of nocodazole DMSO gedurende 5 min voor beeldvorming.
  4. Zoek cellen zoals in stap 3,1.
  5. Voordat fotoactivatie, de voorbereiding van de microscoop om een ​​Z-stack na de foto-activering periode nemen.
    1. Klik op de 'Z-Stack' knop. Te scannen met behulp van Fast XY.
    2. Stel het brandvlak van de microscoop instelknop tot de bovenkant van de cel. Druk "Mark First 'naar de eerste positie in de stapel te stellen.
    3. Stel het brandvlak van de microscoop instelknop naar beneden (het dichtst bij het glas) van de cel. Druk "Mark Last 'naar de laatste positie in de stapel te stellen.
    4. In de Z-stack paneel, druk op de "Z snijden 'knop. Stel de 'Interval' tot 1 pm.
      Opmerking: Voor een hogere ruimtelijke resolutie stack een kleinere stack interval, maar meer afbeeldingen moetgenomen verlengen van de beeldvormende periode van de stapel.
  6. Bleek de cellen, zoals beschreven in stap 3,7-3,8. Foto-activeren en de afbeelding van 0 min tot 15 min (30 frames).
  7. Stop beeldvorming na 30 frames. Direct opslaan van een beeld van de video.
    Let op: Sommige microscopen kunnen eerste video overschrijven als het niet voor het starten van een tweede beeldvormende sequentie wordt opgeslagen.
  8. Na het opslaan van de video, onmiddellijk een Z-stack te verwerven, met behulp van de parameters van stap 5.5.
  9. Co-lokaliseren pAPP-paGFP met GalT-GVB (of andere Golgi marker), zoals beschreven in stap 6.
    Opmerking: GVB fotobleken snel en mogen niet zichtbaar zijn voor het einde van de beeldvorming periode. Colocalization wellicht niet mogelijk met GalT-GVB. Als colocalization nodig is, gebruik mRFP labelen GalT.

6. Vesicle Filtering en colocalization

  1. Gebruik een analyse programma (bijv Imaris) aan oppervlakken van het compartiment (bijv LAMP1-mRFP) en een eiwit o makenf belang (bijvoorbeeld PAPP-paGFP).
  2. Voer de sectie 'Overtreffen' van de analyse programma door te klikken op de knop Overtreffen op de bovenste menubalk.
  3. Selecteer de Surface-wizard knop aan de bovenkant van de meest linkse paneel (5 e knop van links).
  4. Selecteer een kanaal om blaasjes (dwz pAPP-paGFP fluorescentie, eiwit van belang) te filteren.
  5. Uitvoeren achtergrond aftrekken door het indienen van de diameter van de grootste blaasje in het veld om de wizard en klik op Volgende. Het analyseprogramma selecteert automatisch - gebaseerd op een drempel afgeleid van het grootste vesicle in het veld - een gebied in het kanaal plaats.
    1. Handmatig aanpassen van de drempel achtergrond om de selectie te verfijnen indien nodig.
  6. Aan de onderkant van de drempel selectie scherm, controleert de optie 'Splits ontroerende objecten' van de gecombineerde Surfaces scheiden.
    Opmerking: Als er veel blaasjes nauw gegroepeerdGether, de analyse programma wil de groep deze objecten onder één oppervlak.
    1. Kies 10-15 representatieve blaasjes en het berekenen van de gemiddelde vesicle diameter en voer het resultaat in de wizard.
  7. Verfijnen van de geselecteerde zaad punten door het verhogen of verlagen van de drempel voor 'Quality' (de intensiteit van het kanaal in het midden van elke plek).
    Let op: De oppervlakken van het kanaal van belang zal worden gecreëerd. Verdere verfijning van de geselecteerde oppervlakken kan worden uitgevoerd op dit moment. Drempel blaasjes op basis van het aantal pixels in elke blaasje.
  8. Maskeren de oorspronkelijke kanaal met dit oppervlak. Te maskeren, selecteer het tabblad 4 van links in de creatie oppervlak tovenaar (potlood).
  9. Selecteer 'All Mask'. Een nieuw kanaal met de blaasjes van de rente zal worden gemaakt.
    Opmerking: Tijdens het masker proces, is een optie om de oorspronkelijke kanaal dupliceren aangeboden. Selecteer deze optie als de oorspronkelijke gegevens moeten worden opgeslagen.
  10. Herhaal sTEPs 6.1 tot 6.7 voor de ongefilterde kanaal (dwz LAMP1 mRFP, compartiment).
  11. Op de bovenste werkbalk, selecteert u de colocalization tool.
    1. In het bovenste paneel, zoals de histogrammen van de kanalen te colocalized verschijnen, selecteert u de onlangs opgerichte gemaskerde kanalen.
    2. Selecteer alle beschikbare gegevens. Er zijn donkere pixels die soms aanwezig is na analyse. Heeft deze pixels in het histogram niet selecteren, zullen ze de resultaten scheef.
    3. In de uiterst rechtse paneel, selecteer 'Build Coloc Channel'. Dit creëert een nieuw kanaal met alleen de colocalized pixels. De gegevens worden in hetzelfde paneel onder het 'Channel Statistics' knop. De gegevens kunnen worden geëxporteerd als een CSV-bestand.
    4. Gebruik de 'Percentage van Material colocalized' statistiek. Deze optie houdt rekening met de intensiteit van de pixels en de grootte van het object.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typische resultaten tonen PAPP verlaten TGN en lijkt het verkeer te snel LAMP1 (figuur 1a en b). Tijdens de foto-activering periode kan blaasjes te zien vertrekken de Golgi bestemd voor lysosomen (figuur 1b). Zonder inhibitor behandeling zal paGFP fluorescentie zichtbaar in lysosomen zijn zolang er fotoactivering in TGN. Na het stoppen fotoactivatie, wordt de PAPP-paGFP snel uit het lysosoom (vergelijk figuur 1a 1b). Behandeling met nocodazole leidt tot de accumulatie van APP in de GalT-GVB gemerkte vakken en voorkomt handel met lysosomen (figuur 1c).

De Zweedse mutatie van APP (APPsw) verhoogt de snelheid van β-splitsing door 10-voudig 34. Met een snelle splitsing van βAPPsw-paGFP, verschijnt het paGFP fluorescentie als een diffuse fluorescentie-signaal in de cytosol. Vermoedelijk dit is het resultaat van de snelle PAPP splitsing door γ-secretase bevrijding van de C-terminale paGFP in het cytoplasma (Figuur 2). In aanwezigheid van γ-secretase inhibitor, PAPP accumuleert in lysosomen.

Na levering van PAPP naar het lysosoom, wordt de paGFP fluorescentie snel geklaard. De korte verblijftijd kan het gevolg zijn van de handel van de lysosoom naar een andere afdeling. Omgekeerd zou splitsing van PAPP door γ-secretase gemakkelijk leiden tot verspreiding van paGFP fluorescentie van het lysosomale membraan (Figuur 3a). De diffuse fluorescentie is moeilijker te detecteren met confocale microscopie. Om te bepalen of PAPP wordt geleverd aan een ander compartiment of gewist, werden SN56 cellen behandeld met een specifieke remmer tegen γ-secretase (L685, 458) of een basisch makende (chloroquine). De toevoeging van ofwel L685, 458 of chloroquine geleid APP accumulatie in het lysosoom ( rong> Figuur 3b en c).

Het is algemeen aanvaard dat APP wordt afgegeven aan het celoppervlak alvorens endocytose en verwerkt in endosomen en lysosomen 35. In onze onbehandelde cellen celoppervlak PAPP kon niet worden gedetecteerd door confocale microscopie. Foto-geactiveerde PAPP niet geconcentreerd in een bepaald gebied van plasmamembraan. In plaats daarvan kan er een diffuse fluorescentie over het grote oppervlak van het plasmamembraan zijn. Interessant is γ-secretase remmer leidt tot PAPP-paGFP detecteerbaar op het celoppervlak (figuur 3b). γ-secretase remmer routeren meer PAPP naar het celoppervlak, in aanvulling op het remmen enzymfunctie. Daarom is het grote oppervlak van het plasmamembraan paGFP verspreidt over een groter oppervlak en maakt detectie moeilijk, maar het eiwit wordt verhandeld om het compartiment.

1 "src =" / files / ftp_upload / 53.153 / 53153fig1.jpg "/>
Figuur 1. Beeldvorming van de mensenhandel van APP op lysosomen. SN56 cellen werden met LAMP1-mRFP, GalT-GVB en PAPP-paGFP. A) De cel was nauwkeurig foto-geactiveerd binnen ROI geplaatst over de Golgi (ROI aangeduid met witte cirkels ). De cel was als alternatief-foto geactiveerd en belicht gedurende 15 minuten aan PAPP-paGFP mensenhandel te bepalen. Inzet toont mensenhandel binnen het perinucleaire gebied van Golgi naar lysosomen. Co-gelokaliseerde pixels verschijnen geel. B) de handel in een blaasje met PAPP-paGFP naar het lysosoom. Gele pixels duiden LAMP1 en PAPP-paGFP colokalisatie. C) SN56 cellen werden behandeld met nocodazole voor beeldvorming ter voorkoming PAPP-paGFP uitgang van de TGN. Een representatief beeld uit het einde van de foto-activeringsperiode. In het rechter paneel, een Z-stack van dezelfde cel onmiddellijk genomen na foto-activering. Th e GalT-GVB is valse gekleurde rood naar visualisatie van colocalized GalT-GVB en PAPP-paGFP verbeteren. Gele pixels duiden colocalization tussen GalT-GVB en PAPP-paGFP. Schaal balken geven 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Handel van βAPPsw-paGFP. SN56 cellen werden met LAMP1-mRFP, GalT-GVB en βAPPsw-paGFP (PAPP met de familiale Zweedse mutatie). De Zweedse mutatie verhoogt het tarief dat APP wordt gesplitst. Cellen werden als alternatief binnen het Golgi-foto geactiveerd en afgebeeld. Een diffuse fluorescentie kan worden gezien na paGFP losgemaakt van het lysosomale membraan diffunderen in het cytoplasma. Schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Het bepalen van de terminal organel. SN56 cellen werden met LAMP1-mRFP, GalT-GVB en PAPP-paGFP. Na foto-activatie cellen werden gevolgd gedurende een additionele 45 min. De twee meest linkse panelen tonen de cellen voordat fotoactivatie (uiterst links) en 15 min na fotoactivatie (midden). Het paneel aan de rechterkant geeft APP fluorescentie na 45 min van de totale beeldvorming in a) niet wordt behandeld, b) γ-secretase remmer behandeld, of c) chloroquine behandeld. Pijlpunten wijzen naar APP co-gelokaliseerd met LAMP1 na 45 min van beeldvorming. Schaal balken geven 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze techniek beschrijft de nauwkeurige foto-activatie van membraaneiwitten gelabeld met paGFP in de TGN latere mensenhandel en decolleté te visualiseren. Terwijl paGFP werd gemaakt meer dan tien jaar geleden 25 is dit het eerste voorbeeld van accurate fotoactivering de handel in ontluikende eiwitten volgen downstream compartimenten. Vorige studies met APP-paGFP constructen foto-geactiveerde a peri-nucleaire gebied van de cel, die werd beschouwd als de Golgi 11. Zoals blijkt uit onze microfoto, lysosomen, vroege endosomen, late endosomen en kan ook in deze regio (figuur 1 en referentie 30). Deze experimenten werden met succes uitgevoerd in HEK293-cellen, COS7 cellen, neuronale cellen SN56, SH-SY5Y cellen en muis neuronen, hoewel de transfectie-efficiëntie van muis neuronen laag. Soortgelijke experimenten zijn uitgevoerd met behulp van de volledige lengte APP constructies en verkort constructies, waarvan de laatste 112 aminozuren bevattenzuren van APP, met β- en γ-knipplaatsen, gefuseerd aan paGFP. De ingekorte constructen zijn gemakkelijker te transfecteren en een hoger fluorescentiesignaal, en deze worden getoond in de bijgevoegde figuren. De ingekorte constructen missen ook de N-terminale ectodomein, die ongedefinieerde splitsingen en sorteersignalen 38 heeft. Ondanks deze N-terminale signalen en breuklijnen, vinden we dat onze verkorte constructie heeft vergelijkbare lokalisatie van en handel als een full-length APP-paGFP 30, 33.

Door de vele organellen in de peri-nucleaire oppervlakte van de cel, is toegewijd om de nauwkeurigheid van de foto-activatie waarborgen. Gedurende de beeldvormende periode, zal de cel en het Golgi bewegen. Daarom moet de foto-activatie ROI zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens de foto-activeringsperiode en aangepast bovenop het Golgi blijven. Confocale microscopen zijn gevoelig voor kleine veranderingen in temperatuur. Bijvoorbeeld, AC of verwarming ventilatieopeningen over de Micrpe zou kunnen leiden tot een verandering van het beeldvlak.

Met het oog op samenhang tussen experimenten te houden, stellen we een vertraging tussen elke foto-activering / imaging cyclus. Tijd nodig is om bleken de ROI en het beeld van de cel. Afhankelijk van de grootte van de cel en het aantal ROI, de tijd bleken en neem een ​​beeld variëren. Met het oog op de consistentie van de afbeelding om de afbeelding te behouden, stelt u een vertraging tussen de beelden, zodat elk beeld, met inbegrip van bleken, vereist ongeveer 30 seconden. Verhoogde temporele resolutie kan worden bereikt door gebruik detectiesystemen die een bundelvormer (bijv LSM5 live detector) dienst. Deze microscopen kunnen het op 120 frames / seconde zonder verlies van de resolutie.

Om de nauwkeurigheid van de foto-activering te bevestigen, is het noodzakelijk om een ​​nocodazole controle uit te voeren. Door het blokkeren van het vervoer uit de Golgi tijdens foto-activering, dit zorgt ervoor dat paGFP niet wordt significant geactiveerd in de andere compartimenten.CFP foto-bleekmiddelen snel met herhaalde beeldvorming en bleken en kan colocalization maken met GalT-CFP moeilijk. Indien het grootste deel van paGFP fluorescentie blijft in de Golgi gebied, kan deze ook aangeven nauwkeurige foto-activatie. Alternatief kan GalT worden gelabeld met mRFP, die meer foto- stabieler dan CFP in deze experimenten.

Verbeterde activering binnen het Golgi kan ook worden bereikt met een multi-foton microscoop. Terwijl de confocale beeldvlak in deze experimenten is typisch een 1 urn schijfje, de laser imaging en foto-activatie zal door de gehele cel. Een multi-foton laser kan worden gebruikt voor deze experimenten en kan de nauwkeurigheid in drie dimensies 35 verbeteren. Zoals hier getoond, een traditionele 405 nm laserdiode voldoende nauwkeurig foto-activeren PAPP-paGFP binnen de TGN.

Als een controle hebben we vergelijkbare experimenten uitgevoerd VSVG-paGFP fluorescentie. VSVG-paGFP, dat isconstitutief afgegeven aan het celoppervlak 27,37, werd gevisualiseerd specifieke subgebieden van het plasmamembraan 30 geleverd. Dit verzekert dat het transport naar intracellulaire compartimenten niet wordt geactiveerd door overexpressie of de aanwezigheid van de paGFP tag.

Diffuse paGFP fluorescentie kan moeilijk te lokaliseren door confocale microscopie zijn. In onze ervaring, is APP snel gesplitst en lijkt een korte levensduur als een full-length eiwit op de lysosomale membraan hebben. Dit probleem wordt verergerd door het FAD Zweedse mutatie die de snelheid van APP splitsing 34 versnelt. De techniek voor het snel gesplitst eiwitten dienst, een remmer is van cruciaal belang voor de uiteindelijke stroomafwaartse compartiment bepalen. Remming van γ-secretase door L685, 458 of chloroquine leiden tot significante accumulatie van APP in lysosomen; zelfs met de Zweedse mutatie.

Als teveel inhibitor wordt gebruikt, kan dit leiden tot intracellulaire accumulatie van PAPP-paGFP, en kan leiden tot eiwit insluitsels. Geaccumuleerde paGFP in insluitsels resulteert in fluorescerende paGFP insluitsels in de cel voor het experiment is gestart (onze gepubliceerde waarnemingen, dat wil zeggen de behandeling 's nachts met 40 uM chloroquine). Een remmerconcentratie dat splitsing van het eiwit van belang voorkomt, maar leidt niet tot vorming opneming worden gebruikt. Over-transfectie van cellen met paGFP kan ook leiden tot duidelijke insluitingen van paGFP, die fluoresceren zonder foto-activatie. Nieuw foto-geactiveerde paGFP zal preferentieel verkeer naar deze insluitsels en interfereren met de interpretatie van de resultaten. Bij het zoeken naar de cellen om de afbeelding, te voorkomen cellen met duidelijke paGFP insluitsels. In onze ervaring met PAPP-paGFP, er is een zeer zwakke groene fluorescentie in cellen die pAPP-paGFP uiten op het juiste niveau. Deze zwakke fluorescentie kenmerkend niet kunnen worden afgebeeld en kan alleen worden gezien door het oculair.

(dwz plasmamembraan) kunnen moeilijk te detecteren. Dit kan zijn omdat het fluorescentiesignaal, verspreid over een groot gebied wordt verdund of omdat het membraan profiel in dwarsdoorsnede dan de resolutie van de confocale microscoop. Het kan mogelijk zijn om dit probleem te omzeilen door beeldvorming via een epifluorescentiemicroscoop. Dit zal echter aanzienlijk de ruimtelijke resolutie van de techniek beperken.

Een voordeel van deze techniek is de toepassing van andere membraaneiwitten. Hoewel deze techniek is afhankelijk overexpressie van verscheidene eiwitten blijkt dat eiwittransport niet openlijk verstoord, zoals is aangetoond met VSVG-paGFP en PAPP-paGFP 30. Naast het lysosoom, andere markers van de endosomale / lysosomale systeem ook met succes toegepast. Deze omvatten Rab5-mRFP voor de vroege eindeOsome en rab9-mchFP (cherry fluorescerend eiwit) voor de late endosoom. Deze krachtige microscopie techniek kan worden uitgebreid tot het transport van andere eiwitten van de TGN volgen. Het zou ook van toepassing op de handel tussen de afzonderlijke compartimenten voorzien welbepaalde compartiment markers zijn beschikbaar volgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
  2. Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
  3. De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
  4. Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
  5. Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
  7. Pawar, A. P., et al. Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
  8. Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
  9. Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
  10. Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
  11. Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
  12. Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
  13. Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
  14. Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
  15. Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
  16. Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
  17. Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
  18. Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
  19. Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
  20. Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
  21. Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
  22. Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
  23. Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
  24. Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
  25. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  26. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
  27. Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
  28. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
  29. Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
  30. Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
  31. Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
  32. Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
  33. Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
  34. Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
  35. Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
  36. Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
  37. Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
  38. Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).

Tags

Cellular Biology Amyloid precursor protein foto-activeerbare GFP Golgi Lysosomen Intracellulaire trafficking ziekte van Alzheimer β-amyloid live-cell microscopie
Beeldvorming van de intracellulaire mensenhandel van APP met fotoactiveerbare GFP
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tam, J. H. K., Pasternak, S. H.… More

Tam, J. H. K., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter