Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme

Published: October 17, 2015 doi: 10.3791/53153
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University

Summary

Hücre yüzey proteinlerinin nakil nispeten kolay çalışılan birlikte, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı görselleştirme çok daha zordur. Burada, biz fotoaktıfleştırılebılır GFP içeren yapıları kullanmak ve doğru aşağı akım bölmelerine Golgi aygıtı gelen amiloid öncü proteinin izleyin ve açıklığını takip etmek bir yöntem ortaya koymaktadır.

Abstract

Beta-amiloid (Aβ) Alzheimer hastalarının beyinlerinde bulunan senil plakların temel bileşenidir. Aβ p ve γ-sekretazlar Amiloid Prekürsör Protein (APP) sıralı bölünmesinden türetilmiştir. AD patolojiye Aβ önemine rağmen, bu bölünmeler hücre içi lokalizasyonu iyi kurulmuş değil. Laboratuvarımızda çalışmak ve diğerleri hücre yüzeyinden içselleştirilmesi sonra APP işleme endozomal / lizozom sistemini ima. Bununla birlikte, APP'nin hücre içi nispeten örüntüsü oldukça olup.

Hücre yüzey proteinleri birçok markalama tekniklerine düzeltilebilir olanı olsa da, Golgi zar proteinlerinin kaçakçılığı aşağıdaki için basit bir yöntem vardır. Bu amaçla, C-terminalinde foto-aktifleştirilebilen bir GFP (paGFP) etiketlenen APP yapıları oluşturulur. Sentezden sonra, paGFP düşük taban floresans sahiptir, ancak 413 nm ışık t uyarılabiliro güçlü, istikrarlı bir yeşil floresan üretir. Kullanarak Golgi markör galaktosil transferaz, bir hedef olarak Cyan Floresan Protein (GaIT-CFP) bağlanmış biz trans-Golgi ağı doğru olarak photoactivate APP edebiliyoruz. Bu floresan ile tanımlanan alt bölmelere trafiğini ilk endozoma (Rab5), geç endozom (Rab9) ve lizozom (LAMP1) için bölmesi markör proteinlerin etiketlenmiş olarak fotoaktif APP-paGFP daha sonra takip edilebilir. Bundan başka, klorokin ve γ-sekretaz inhibitörü L685, 458 de dahil olmak üzere APP işleme önleyiciler kullanılarak, tek hücreler içinde APP dönüşümünü incelemek için darbe kovalayıcı deneyler gerçekleştirmek mümkündür.

Biz APP büyük bir kısmı hücre yüzeyinde görünen olmadan lizozoma hızla hareket eder ve daha sonra sekretaz benzeri çatlamalarla lizozoma temizlenir bulabilirsiniz. Bu teknik fro hücre içi proteinlerin kaçakçılığı ve işlenmesini takip için paGFP kullanımını gösteriraşağı bölmeleri golgi m.

Introduction

Alzheimer hastalığı (AD), ayırt edici senil plakların ve beyinde nörofibriler yumakların (NFTler) varlığıdır. Yaşlılık plaklarının ana kurucu β-amiloid (Aβ) 'dir. Aβ kendi öncüsünden elde edilir; amiloid öncü proteini (APP) 1. APP Amiloidojenik bölünme β-sekretaz 2 ile APP ektoalan uzaklaştırılması ile başlar. Geri kalan 99 kalıntılı bir karboksil terminal parçası (CTF) Aβ 3-7 üretilmesi için γ-sekretaz ile bölünebilen. Birçok deneyler endozomal / lizozomal sistemine hücre yüzeyinden içselleştirilmesi sonra hücre yüzeyi APP bölünme belgelenmiş olmasına rağmen, son çalışmalar çok sayıda APP hücre içi ticareti, aynı zamanda işleme 8-11 düzenlenmesinde önemli olduğunu ileri sürmüşlerdir.

Γ-sekretaz inhibitörleri ve Aβ Immun ile Aβ düzeylerini modüle girişimleri bir dizi olmuşturotherapies. Bununla birlikte, bu tedaviler ile son klinik çalışmalarda bazı durumlarda, zarar 12 neden olduğu, hiç bir yarar gösteren, vb. Aβ üretimini modüle etme bir atıl bir strateji APP alt-hücresel lokalizasyon ve γ-sekretaz etkileşimi değiştirmektir. Golgi plazma membranı ve endozomlar / lizozom Tüm APP γ-bölünmesi için mümkün olan yerel olarak önerilmiştir. Laboratuvarımızda yapılan araştırmalar APP ve γ-sekretaz lizozomal zarın 13 yerleşik proteinler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, lızozomal γ-sekretaz bir asidik pH değerine uygun 13 sahip olduğunu bulduk. Buna ek olarak, klorokin ve NH4CI ile endozomal / lızozomal sisteminin alkalizasyon, Aβ 14 üretimini azalttığı gösterilmiştir. -y olan sekretaz engellenmesi veya nakavt veya Presenilin lizozom 15-17 APP-CTFS birikimine yol açar. Ayrıca, APP endositoz kesintiye Aβ üretimi 18-20 düşürmektedir.

Doğmakta olan proteinler ve endozomal / lizozomal sisteminden geri dönüştürülmüş proteinler için bir sıralama istasyonu olarak Golgi önemine karşın, APP hücre içi ticareti detaylı 21'de çalışılmamıştır. Son çalışmalar, APP retromer kompleksi ile etkileşim yoluyla trans-Golgi ağı (TGN) geri edilebilir olduğunu göstermiştir. Retromer kompleksinin Aşağı regülasyon Aβ üretimi 8,22-24 azalır. Ancak, Golgi dan APP'nin çıkış iyi çalışılmamıştır.

Örneğin transferrin reseptörü gibi hücre yüzey proteinleri, endositozu takip ederken, kolayca etiketli ve takip edilmesini, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı, aşağıdaki daha zordur. Aslında, birkaç proteinler, hücre içi ticareti görüntülü vardı. Bu tür fotoğraf aktifleşebilen-GFP (paGFP) gibi floresan protein etiketleri, gelişi içi ticaretini incelemek için yeni araçlar sağladı. Foto-aktive olan GFP-GF şeklidirSentezden sonra neredeyse görünmez, ancak 413 nm lazer ışığı ile aktive edildikten sonra güçlü yeşil (GFP) floresan geliştirir ve bu sinyal gün 25,26 stabildir P. PaGFP kullanılarak yapılar Lizozomal Protein intralizozomal kaçakçılığı göstermek için kullanılmıştır zar proteini 1 (LAMP1) 25, Vesicular Stomatitis virüsü glikoproteini (VSVG, salgı yoluna bir belirteci) 27 hücre yüzey teslimat ve peroksizom ciro 28 ve 29 autophagosomes.

Canlı hücrelerdeki TGN APP'nin sıralama görselleştirmek amacıyla, C-terminali foto-aktifleştirilebilen (paGFP) bağlanmış APP'nin son 112 amino asidini ifade plazmidi olarak tasarlanmış 30 (βAPP-paGFP olarak da adlandırılır). Ayrıca, tam uzunlukta APP bu deneyleri ve benzeri sonuçlar elde ettik; daha parlak görüntüler sağlar çünkü ΒAPP yapı burada kullanılmıştır. Daha sonra fotoğraf-activate &# 946; sadece TGN APP-paGFP, TGN işaretleyici galaktosiltransferaz (GalT) tarafından sınırları çizilmiş olarak. APP perinükleer bölgeden hızla aksonal APP taşınmasını ve temizlenmesini görselleştirmek için paGFP ile etiketlendi olmasına rağmen, bu bir dikkatle tanımlanmış bölmeden başka 11,31,32 APP ticaretinin ilk göstergesidir. Burada, biz doğru TGN içinde foto-aktivasyonu ve aşağı bölmeleri ve lizozomlar 30 sonraki bölünme ve açıklık içine APP çıkışını göstermektedir. Golgi içinde doğru fotoğraf etkinleştirme diğer protein sistemleri yaygın olarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Ekimi ve transfeksiyonu

  1. Bir hücre kültür kaput, plakasının 300,000 ~ 500.000 SN56 hücreleri (Dr. Jane Rylett bir tür hediye) 35 mm cam alt konfokal çanak ve (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM ile takviye ön transfeksiyon ortamı ile kapak % 10 FBS).
  2. Çoğalan bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri.
    Not: Hücreler yaklaşık olarak% 50 transfeksiyondan önce -70% konfluent olmalıdır.
  3. Bir hücre kültür davlumbaz, bir flüoresan proteini eksprese eden plazmidler ile transfekte hücreler bir floresan proteini burada bölmesi işaretleyici (ile etiketlenmiş lizozom bağlantılı membran proteini 1, LAMP1 etiketli TGN markör (GaIT-CFP Cyan Floresan Protein bağlanmış galaktosil transferaz) etiketli MRFP) ve paGFP (βAPP-paGFP ile etiketlenmiş ilgi protein). (Bu yapılar daha önce 30 tarif edilmiştir)
  4. Transfeksiyon reaktifi ve plazmid DNA f hücreleri inkübeveya% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat. En iyi dengeyi sitotoksisite ve transfeksiyon verimi transfeksiyon ajanı 5 ul (örneğin, Lipofectamine 2000) DNA 2 ~ ug oranı kullanın. Güncel konsantrasyonları farklı plazmid için optimize edilmesi gerekebilir. Burada tarif edilen deneylerde, 1 ug βAPP-paGFP bölgesinin / konfokal çanak LAMP1-MRFP 0.3 ug / konfokal çanak ve GalT-CFP 0,2 ug / konfokal çanak kullanmayın.
    Not: kullanılan plazmid miktarı transfeksiyon verimliliğine bağlıdır.
  5. Nöronal hücre hatları için: Aşama 1.4 sonra, hücre kültürü kaputu, ön-transfeksiyon ortamını çıkarın ve 1 mM 24 saat boyunca siklik AMP (dbcAMP) dibutiril% 0.1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş 2 ml DMEM içinde SN56 hücreleri ayırt.

2. Mikroskop Sahne Hazırlığı

  1. Ön sıcak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 37 ° C Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). IMAGI önce ısınma mikroskop aşaması37 ° C'ye kadar değişmektedir.
  2. Iki kez PBS ile yıkayın hücreleri, farklılaşma ortamını çıkarın ve 37 ° C 'de 2 ml HBSS ile değiştirmek için. Mikroskop aşamasında üzerine yerleştirin hücreleri 37 ° C'ye kadar ısıtıldı.
    Not: Hücreler HBSS yaklaşık 1.5-2 saat yaşayabilir.
  3. Konfokal plaka sıcaklığı mikroskop sahne ile dengelenmesi için 5-10 dakika bekleyin.

Golgi üzerinde İB'nin 3. Fotoğraf aktivasyon

  1. Mikroskop mercek ile GalT-CFP, LAMP1-MRFP ve βAPP-paGFP transfekte hücreleri bulabilirsiniz.
    1. Yüksek büyütme (yani 63X veya 100X) ile bir yağ daldırma objektifi kullanın. Floresan görsel yapısındaki için, ve rodamin (MRFP floresan) (OBP ve GFP floresan) FITC görselleştirme yeteneğine set bir filtre kullanın.
  2. 1 mikron Her kanal için konfokal dilim ayarlayın. Düşük çözünürlüklü görüntü almak.
  3. Görüntüye Crop ilgi sadece hücre.
  4. Ayar düğmesini kullanarak, manuel olarak ayarlanabilirHücrenin ortasında odak düzlemi. Bu, tipik olarak en büyük hücre çekirdeği bir parçasıdır.
  5. TGN (GalT-OBP floresan) içinde (ROI) İlgi 3-5 dairesel Bölgeler çizin.
    1. (Yani Zeiss LSM programında) İB'leri çizmek için, komut konsolunda 'Düzenle ROI' düğmesini seçin.
    2. Dairesel ROI düğmesini seçin.
    3. Tıklayın ve GalT-OBP hücrenin pozitif bölgeleri üzerinde sürükleyin.
      Not: Birçok mikroskoplar fotoğraf beyazlatma paketleri, bu yeteneğe sahip.
  6. Kaplanmış ROI ile hücrenin bir görüntü alın. Daha sonra başvurmak üzere ROI bir kopyasını kaydedin.
    1. Görüntüye İB'leri kaydetmek için, 'Makro' düğmesini seçin.
    2. 'CopyRoisToOverlay' (c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb dosya yolu) başlatmak için 'Load' düğmesine basın.
      Not: 475-525 nm (CFP) bant geçiren (BP), bir 500-530 nm BP (GFP) ile donatılmış bir konfokal mikroskopve 560 nm uzun geçiş (LP) filtre setleri gereklidir. 458 nm ve 488 nm emisyon ve 540 nm emisyon için HeNe lazer için bir argon lazer de gereklidir.
  7. Set-up bir ağartma süresi kurs için mikroskop.
    1. Maksimum güç lazer diyot (25 mW 405 nm lazer) ayarlayın.
      Dikkat: Aşırı fotoğraf aktivasyon hücresel membranlara fotoğraf toksisite veya hasar görmesine neden olabilir. Retina hasarı önlemek için koruyucu gözlük kullanın.
    2. Set-up görüntüleme 120 döngüleri için mikroskop.
      Not: Bir görüntüleme döngüsü ROI içinde ağartma ve tüm hücre görüntüleme oluşur. Bu bir ağartıcı zaman derstir.
    3. Her resmin sonra 20-30 yineleme sadece İB'leri (foto-activate) ağartmak için mikroskop ayarlayın. Bir görüntü değişecektir imajı ve çamaşır suyu zamanı. Her döngü yaklaşık 30 sn yani görüntüler arasında bir zaman gecikmesi ayarlayın.
      Not: her döngünün görüntüleme bölümünün görüntü boyutuna bağlı olarak yaklaşık 15-30 sn sürer. Her RO için beyazlatmaBen yaklaşık 50 milisaniye olduğunu. 20 yineleme için tüm 4 İB'nin Beyazlatma her ağartıcı / resim döngüsünün sonunda 4 sn alacaktır.
  8. Ağartma süresi kursu başlatın.
  9. 15 dakika (görüntüleme ve beyazlatma 30 döngü) sonra beyazlatma kapatın, ancak hücre görüntüleri yakalamak devam edin.
    Not: min 'darbe' dönemdir 0 15 zamanı.
  10. ΒAPP-paGFP temizlenmesini takip etmek, (ağartma) olmadan 45 dakika için görüntü yakalamayı devam edin.
    Not: min 'kovalamak' dönemi 15 45 zamanı.
  11. Aşama 6'da tarif edilen analiz yöntemi kullanılarak, her bir kanala yüzeyleri yaparak (burada LAMP1-MRFP) ilgi bölme ile ilgi (burada βAPP-paGFP) proteini ko-lokalize.

4. Alt Bölme belirleyin

  1. (Bu deneylerde) lizozom son bölmesi olup olmadığını belirlemek için, proteinler lizozom birikmesine neden zar geçirgen proteaz inhibitörleri ekleyin.
    1. ΒAPP için, 0.5 uM L685, 458 (spesifik γ-sekretaz inhibitörü), gece boyunca ya da görüntüleme önce 30 dakika süre ile 100 uM klorokuinin (deacidifies lizozomlar) kullanın.
  2. 3.8 - 3.1 adım olarak hücreleri ve photoactivate bulun.
  3. ΒAPP-paGFP bölünme yokluğunda birikir burada görüntü (foto-aktivasyon) olmadan ek bir 45-dakika boyunca hücre belirlenmesi.
  4. Aşama 6'da tarif edilen yönteme göre, lizozomlar (veya diğer alt bölmeye) proteinin teslim ve daha sonra boşluk analiz edin.

5. Golgi içinde Photo-aktivasyon Doğruluğu sağlamak

  1. 37 ° C'ye ısınma HBSS.
  2. Her konfokal plaka HBSS 66 mcM nokodazolun (tedavi) veya DMSO (kontrol), görüntülü için, 2 ml solüsyon hazırlayın.
    1. Tek konfokal plaka, pipet 2 37 ° C HBSS ml ve 16.60 mM nokodazol stoktan nokodazolun içinde 7,96 ul ekleyin için.
    2. Bir kontrol olarak, böylecedökülmesinden, pipet 2 bir 2 ml'lik tüp içine 37 ° C HBSS ml DMSO 7.96 ul ekle.
  3. Görüntüleme önce 5 dakika boyunca nokodazolun veya DMSO içeren HBSS içinde hücreleri inkübe edin.
  4. Adım 3.1 olarak hücreleri bulun.
  5. Fotoaktivasyon önce, foto-aktivasyon süre sonra Z-yığını almaya mikroskop hazırlar.
    1. 'Z Stack' butonuna tıklayın. Hızlı XY kullanarak taramaya başlayın.
    2. Hücrenin üstüne mikroskop ayar düğmesi ile odak düzlemi ayarlayın. Basın 'Mark İlk' yığının ilk pozisyonunu ayarlamak için.
    3. Hücrenin altına mikroskop ayar düğmesinin (cam yakın) ile odak düzlemi ayarlayın. Basın 'Mark Son' yığınında son konumunu ayarlamak için.
    4. Z yığını panelinde, 'Z kesit' düğmesine basın. 1 mikron 'Aralık' ayarlayın.
      Daha yüksek uzaysal çözünürlüğü daha küçük bir yığın yığın aralığı için, ama daha fazla resim gerekecektir: Notyığının görüntüleme süresini uzatma alınacak.
  6. Aşama 3,7-3,8 de tarif edildiği gibi, hücreler, peroksijen ağartıcıdır. 15 dakika (30 kare) 0 dk Foto-activate ve görüntü.
  7. 30 kare sonra görüntüleme durdurun. Hemen videonun bir görüntü kaydetmek.
    Dikkat: ikinci bir görüntüleme dizisi başlamadan önce kayıtlı değilse bazı mikroskoplar ilk video üzerine yazabilir.
  8. Videoyu kaydettikten sonra, derhal adım 5.5 parametreleri kullanarak, Z-yığını kazanır.
  9. Aşama 6'da tarif edildiği gibi, GalT-CFP (ya da diğer Golgi işaretleyici) βAPP-paGFP Co-lokalize.
    OBP hızla ağartıcılar ve görüntüleme dönemi sonunda görünür olmayabilir: Not. Ko GalT-OBP mümkün olmayabilir. Ko gerekiyorsa, GALT etiketlemek için MRFP kullanın.

6. Vesikül Filtreleme ve ko

  1. Bölmenin yüzeyleri (örneğin LAMP1-MRFP) ve bir protein o yapmak için bir analiz programı (örneğin Imaris) kullanınf ilgi (örneğin βAPP-paGFP).
  2. Üst menü çubuğunda Aşan butonuna tıklayarak analiz programı 'Aşmak' bölümüne girin.
  3. En soldaki panelden (soldan gelen 5. düğmesi) üstündeki yüzey sihirbazı düğmesini seçin.
  4. Veziküller (yani βAPP-paGFP floresan, ilgi protein) filtrelemek için bir kanal seçin.
  5. Bir sonraki sihirbazı ve basına alanında büyük vezikül çapını göndererek arka plan çıkarma gerçekleştirin. Analiz programı otomatik olarak seçer - ilgi kanalında bir alanda - alanındaki en büyük vezikül türetilen bir eşiğe göre.
    1. Elle gerekirse seçimi rafine eşik arka plan ayarlayın.
  6. Eşik seçim Ekranın alt kısmında, birleşik Yüzeyler ayırmak için 'Split dokunmadan nesnelerin seçeneğini işaretleyin.
    Not: Birçok veziküller yakından gruplandırılmış isegether, bir yüzey altında bu nesneler analiz programı olacak grubudur.
    1. 10-15 temsilci veziküller seçin ve ortalama vezikül çapı hesaplamak ve sihirbaz içine sonucu yazınız.
  7. Artan ya da 'Kalite' (her yerde ortasında kanalın yoğunluğu) hakkında eşiği azaltarak seçilen tohum noktalarını daraltın.
    Not: ilgi kanalın yüzeyler oluşturulur. Seçilen yüzeylerin daha hassas hale bu noktada gerçekleştirilebilir. Her bir kesecik piksellerin sayısına göre eşik vesiküller dahil bulunmaktadır.
  8. Bu yüzeye sahip orijinal kanal Maske. Maskelemek için, yüzey oluşturma sihirbazı (kalem) 'de, soldan 4 sekmesini seçin.
  9. 'Tüm Maske' seçeneğini seçin. Ilgi veziküller ile yeni bir kanal oluşturulur.
    Not: Maske işlemi sırasında, orijinal kanal çoğaltmak için bir seçenek sunuluyor. Orijinal veri kaydedilmesi gereken bu seçeneği belirleyin.
  10. Tekrarlama sfiltre kanalı (örneğin, LAMP1 MRFP, bölme) için 6.7 ile Teps'in 6,1.
  11. Üst araç çubuğundan, ko aracını seçin.
    1. Üst panelde, kolokalize edilecek kanalların histogramlar göründükleri gibi, son zamanlarda oluşturulan maskeli kanalları seçmek.
    2. Mevcut tüm verileri seçin. Bazen analizden sonra mevcut karanlık pikseller vardır. Histogramda bu pikselleri seçmeyin, onlar sonuçları çarpık olacaktır.
    3. Sağında panelinde, 'Coloc Kanal Oluştur' seçeneğini seçin. Bu yalnızca kolokalize pikselleri içeren yeni bir kanal oluşturur. Veri 'Kanal İstatistikleri düğmesinin altında aynı panelde olacaktır. Veriler CSV dosyası olarak ihraç edilebilir.
    4. 'Malzeme Yüzde kolokalize' istatistiğini kullanın. Bu seçenek, dikkate nesnenin piksel ve boyutu yoğunluğunu alır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipik sonuçlar βAPP (Şekil 1a b) TGN bırakarak hızla LAMP1 trafiğe görünür göstermektedir. Foto-aktivasyon süresi boyunca, veziküller lizozomlar (Şekil 1b) için tahsis golgi çıkış görülebilir. TGN foto-aktivasyon varken inhibitör tedavisi olmadan, paGFP floresan lizozomlarda görünür olacaktır. Foto-aktifleşmesini durdurduktan sonra, βAPP-paGFP hızla (1b Şekil 1a karşılaştırın) lizozoma silinir. Nokodazolun tedavisi bölmeleri etiketli GalT-OBP içinde APP birikimine yol açar ve lizozomlar (Şekil 1c) ile ticaretini önler.

APP'nin İsveç mutasyonu (APPsw) 10-kat 34 ile β-bağlanma oranını arttırır. ΒAPPsw-paGFP hızlı bölünme ile, paGFP floresans sitozol içinde diffüz floresan sinyali olarak ortaya çıkar. Muhtemelen bu is sitoplazmaya C-terminal paGFP serbest γ-sekretaz (Şekil 2) ile hızlı βAPP bölünme sonucu. Γ-sekretaz inhibitörü varlığında βAPP lizozomlar içinde birikir.

Lizozoma βAPP teslim sonra paGFP floresan hızla temizlenir. Kısa kalma süresi bir bölmeye lizozoma gelen insan ticareti sonucu olabilir. Tersine, γ-sekretaz tarafından bölünmesi, βAPP lizozomal membran (Şekil 3a) ile ilgili paGFP floresan difüzyonu yol açması beklenecektir. Yaygın floresan konfokal mikroskobu ile tespit etmek daha zordur. ΒAPP başka bir bölmeye iletilecektir ve temizlenmiş olup olmadığını belirlemek için, hücre SN56 γ-sekretaz (L685, 458) ya da alkalinize madde (klorokin) karşı spesifik bir inhibitörü ile tedavi edildi. Ya da L685, 458 ya da klorokin ilaveli lizozom APP birikmesi ile sonuçlanmıştır ( rong> Şekil 3b ve c).

Genellikle APP endocytosed önce hücre yüzeyine verilir ve endozomlarda işlenir ve 35 lizozomlar geldiği kabul edilir. Ancak, muamele edilmemiş hücrelerdeki, hücre yüzeyi βAPP konfokal mikroskobu ile tespit edilememiştir. Foto-aktif βAPP plazma membranının belirli bir bölge içinde konsantre olabilir. Bunun yerine, plazma zarının geniş yüzey alanı boyunca diffüz floresan olabilir. İlginç bir şekilde, γ-sekretaz inhibitörü tedavisi, hücre yüzeyinde βAPP-paGFP bulgulanabilir neden olur (Şekil 3b). γ-sekretaz inhibitörü tedavisi enzim fonksiyonunu inhibe edilmesine ek olarak, hücre yüzeyine βAPP yolu daha fazla olabilir. Protein bölmesine ticareti yapılan bir sonucu, bu plazma zarının geniş yüzey alanı, daha büyük bir alana yayılır paGFP ve tespit zorlaştırmaktadır.

1 "src =" / files / ftp_upload / 53153 / 53153fig1.jpg "/>
Lızozomlara APP'nin ticaretiyle Görüntüleme Şekil 1.. SN56 hücreleri. LAMP1-MRFP, GalT-OBP ve βAPP-paGFP ile transfekte edildi: a) hücre doğru beyaz çevreler tarafından ifade Golgi (ROI üzerine yerleştirilen ROI içinde fotoğraf aktive oldu ). Hücre alternatif fotoaktif ve βAPP-paGFP kaçakçılığı belirlemek için 15 dakika için görüntülendi. Ankastre Golgi dan lızozomlara perinükleer alanı içinde ticaretini gösterir. Co-lokalize piksel sarı. B) lizozoma βAPP-paGFP içeren bir kesecik kaçakçılığı görünür. Sarı piksel LAMP1 temsil ettiği ve βAPP-paGFP ko c.) SN56 hücreleri TGN gelen βAPP-paGFP dışarı çıkmasını önlemek için görüntüleme öncesi nokodazolun ile tedavi edildi. Temsili resim foto-aktivasyon süresinin sonunda alınan. Sağ panelde, aynı hücreye bir Z-yığın fotoğraf aktivasyon hemen sonra çekilen. Th e GalT-CFP kolokalize GalT-OBP ve βAPP-paGFP görselleştirme artırmak için sahte renkli kırmızı olmuştur. Sarı piksel GalT-OBP ve βAPP-paGFP arasındaki ko belirtir. Ölçek çubukları 5 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
ΒAPPsw-paGFP. SN56 hücrelerinin Şekil 2. Ticareti LAMP1-MRFP, GalT-CFP ve βAPPsw-paGFP (irsi İsveç mutasyonu ile bir βAPP) ile transfekte edilmiştir. İsveç mutasyonu APP parçalanır hızını artırır. Hücreler Golgi fotoğrafın aktive ve görüntülü içinde alternatif vardı. PaGFP sitoplazma içine yayılmaya lızozomal zardan müstakil sonra bir floresan yaygın görülmektedir. Ölçek bar 5 mikron temsil eder.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Terminal organel belirlenmesi. SN56 hücreleri LAMP1-MRFP, GalT-CFP ve βAPP-paGFP ile transfekte edildi. Foto-aktivasyon sonra hücreler ek bir 45 dakika boyunca takip edilmiştir. En soldaki iki paneller hücreleri fotoaktivasyon önce (en soldaki) ve fotoaktivasyon (ortada) 15 dakika sonra göstermektedir. Panel sağında a) işlenmemiş, b) γ-sekretaz inhibitörü toplam görüntüleme 45 dakika muamele edilmiş, ya da c) klorokin işlem gördükten sonra APP floresans sergilenmektedir. Ok uçları, APP ko-lokalize görüntüleme 45 dakika sonra LAMP1 sahip olduğuna işaret etmektedir. Ölçek çubukları 5 mikron temsil etmektedir. Th büyük halini görmek için tıklayınızrakamdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu teknik daha sonraki ticareti ve bölünme görselleştirmek için TGN içinde paGFP ile etiketlenmiş membran proteinlerinin doğru fotoğraf aktivasyonunu açıklar. PaGFP 25 on yıl önce yaratılmış iken, bu aşağı bölmelere doğmakta proteinlerin kaçakçılığını takip etmek doğru fotoğraf aktivasyon ilk örneğidir. APP-paGFP kullanılarak önceki çalışmalar, fotoaktif Golgi 11 olduğu kabul edildi hücrenin bir peri-nükleer bölgesini oluşturur. Ancak, mikrograflar, lizozomlarla erken endozomlarda ve geç endozomlarda belirgin olarak bu bölgede bulundu (Şekil 1 ve referans 30) 'de bulunabilir. Fare nöronların transfeksiyon verimi düşük olmakla birlikte bu deneyler, HEK293 hücreleri, COS7 hücreleri, nöronal SN56 hücreleri, SH-SY5Y hücrelerinin ve fare nöronlarda başarıyla işletilmektedir. Benzer deneyler, son 112 amino, tam uzunluktaki APP yapıları ve kısa yapıları kullanılarak gerçekleştirilmiştirAPP'nin asitler, β- ve γ-yarılma bölgeleri olan, paGFP kaynaşık. Kısaltılmış konstruktlar transfekte ve daha yüksek bir floresan sinyal temin etmek daha kolaydır ve bu ekli şekillerde gösterilmiştir. Bizim kısaltılmış yapılar da tanımsız çatışmaları ve sıralama sinyalleri 38 sahip N-terminal ektoalan, yoksundur. Bu N-terminal sinyaller ve bölünmeler rağmen, bizim kısaltılmış yapı tam uzunlukta APP-paGFP 30, 33 gibi benzer yerelleştirme ve ticaretini sahip olduğunu bulmak.

Çünkü hücrenin peri-nükleer alanda birçok organellerin, unutulmaz bir foto-aktivasyon doğruluğunu sağlamak için yapılmıştır. Görüntüleme döneminde, hücre ve golgi hareket edecek. Bu nedenle, foto-aktivasyon ROI dikkatle fotoğraf aktivasyon döneminde izlenen ve Golgi üstünde kalmaya ayarlanması gerekir. Konfokal mikroskoplar sıcaklıklarda küçük değişikliklere duyarlıdır. Mikroskobik üzerinde Örneğin, AC veya ısıtma delikleripe görüntüleme uçağın bir değişikliğe neden olabilir.

Deneyler arasındaki tutarlılığı korumak amacıyla, her fotoğraf aktivasyon / görüntüleme döngüsü arasında bir zaman gecikmesi ayarlayın. Zaman İB'leri ve görüntüyü hücreyi ağartmak için gereklidir. İB'nin hücre sayısı ve büyüklüğüne bağlı olarak, zaman ağartıcı ve bir görüntü değişir tutmak için kullanılır. Görüntüden görüntüye tutarlılığı korumak amacıyla, ağartma dahil olmak üzere her görüntünün, yani görüntüler arasında bir gecikme süresi ayarlamanızı yaklaşık 30 saniye sürer. Artan zamansal çözünürlüğü bir ışın şekillendirici (örneğin LSM5 Canlı dedektör) kullanan algılama sistemleri kullanılarak elde edilebilir. İkinci çözünürlük kaybı olmadan 120 kare / de bu mikroskoplar yapabilirsiniz görüntü.

Foto-aktivasyon doğruluğunu onaylamak için, bir nokodazol kontrolünü gerçekleştirmek zorunludur. Fotoğraf etkinleştirme sırasında Golgi dışına taşınmasını engelleyerek, bu paGFP anlamlı diğer bölümlerinde aktif hale olmadığını garanti eder.CFP foto-ağartıcılar hızla ile görüntüleme ve ağartma tekrarlanan ve zor GalT-OBP ile ko yapabilirsiniz. PaGFP floresan toplu Golgi alanında kalırsa, bu da doğru fotoğraf aktivasyonu gösterebilir. Alternatif olarak, GalT fazla foto stabil OBP daha bu deneylerde olan MRFP ile etiketlenmiş olabilir.

Golgi içinde geliştirilmiş aktivasyon, aynı zamanda, bir çoklu foton mikroskopu ile elde edilebilir. Bu deneylerde konfokal görüntüleme düzlemi genellikle 1 mikron dilim, tüm hücreye geçecek görüntüleme ve fotoğraf aktivasyonu için lazer iken. Bir çok-fotonlu lazer Bu deneyler için kullanılabilir ve her üç boyutta 35 doğruluğunu geliştirmek olabilir. Burada gösterildiği gibi, ancak, geleneksel bir 405 nm lazer diod doğru TGN olan βAPP-paGFP foto-aktif hale getirmek için yeterlidir.

Bir kontrol olarak, VSVG-paGFP floresan benzer deneyler gerçekleştirdik. Olan VSVG-paGFP,yapısal olarak plazma zarının 30 spesifik alt bölgeler teslim edilen görselleştirildi, hücre yüzeyi 27,37 teslim edilir. Bu hücre içi ulaşım tetiklediği olmadığını garanti aşırı ekspresyon veya paGFP etiketinin varlığına.

Yaygın paGFP floresan konfokal mikroskobu ile lokalize edilmesi zor olabilir. Deneyimlerimize göre, APP hızlı ayrıldı ve lizozomal membran tam boyda bir protein gibi kısa ömürlü olması için görüntülenir. Bu sorun, APP bölünme 34 oranını hızlandırır İsveçli FAD mutasyon şiddetlenir. Hızla bölünen proteinler için bir yöntem kullanır için, bir inhibitör nihai alt bölme belirlemek için son derece önemlidir. L685, 458 veya lizozomlarda APP önemli birikimi klorokin kurşun γ-sekretaz engellenmesi; Hatta İsveç mutasyonu ile.

Çok fazla inhibitör kullanılırsa, bu hücre içi ac yol açabilirβAPP-paGFP bölgesinin birikimi ve protein inklüzyonlar yol açabilir. Deneme başlamadan önce hücreye floresan paGFP kapanım içinde inklüzyonlar sonuçlarında paGFP Birikmiş (bizim yayınlanmamış gözlemler, 40 uM klorokin ile gecede tedavi yani). Ilgili proteinin bölünmesini önler, ancak bunlar katkısız da oluşumuna yol açmaz bir inhibitör konsantrasyonu kullanılmalıdır. Aşırı transfeksiyon paGFP hücrelerin de foto-aktivasyon olmadan floresan olacak paGFP belirgin inklüzyonları neden olabilir. Yeni fotoğraf aktive paGFP tercihen Bu inklüzyonlar trafik ve sonuçların yorumlanması engel olacak. Görüntü hücreler ararken bariz paGFP kapanım ile hücreleri kaçının. ΒAPP-paGFP ile bizim deneyim, uygun düzeyde βAPP-paGFP ifade eden hücrelerde çok soluk yeşil floresan var. Bu soluk floresan genellikle görüntülü edilemez ve sadece mercek aracılığıyla görülebilir.

(yani plazma zarı) ile insan ticaretine bu proteinin tespit etmek zor olabilir olduğunu. Bu flüoresan sinyal, geniş bir alana yayılmış olması nedeniyle, seyreltilmiş veya kesitte membran profili konfokal mikroskop çözünürlük altında olduğu için bir olabilir. Bir epifloresans mikroskop kullanılarak görüntülenebilir, bu problemi aşmak için mümkün olabilir. Ancak, bu anlamlı tekniğin uzaysal çözünürlüğü azaltacaktır.

Bu tekniğin bir avantajı, diğer membran proteinleri uygulanabilmesidir. Bu teknik, çeşitli proteinlerin ekspresyonu üzerinde bağlı olsa da, VSVG-paGFP ve βAPP-paGFP 30 ile gösterilmiştir protein ticareti açıkça, bozulmamasına dikkat gösterilir. Lizozom ek olarak, endozomal / lızozomal sisteminin diğer belirteçler de başarıyla kullanılmıştır. Bu ilk sonu rab5-MRFP bulunmaktadırosome ve geç endozom için rab9-AÇSAP (kiraz floresan protein). Bu güçlü mikroskop tekniği TGN gelen diğer proteinleri kaçakçılığı takip uzatılabilir. Bu aynı şekilde iyi tanımlanmış bölmesi işaretleri mevcuttur mesafede ayn bölmeler arasındaki kaçakçılığı takip uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını ya da çıkar çatışmalarının var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
  2. Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
  3. De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
  4. Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
  5. Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
  7. Pawar, A. P., et al. Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
  8. Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
  9. Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
  10. Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
  11. Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
  12. Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
  13. Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
  14. Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
  15. Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
  16. Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
  17. Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
  18. Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
  19. Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
  20. Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
  21. Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
  22. Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
  23. Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
  24. Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
  25. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  26. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
  27. Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
  28. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
  29. Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
  30. Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
  31. Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
  32. Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
  33. Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
  34. Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
  35. Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
  36. Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
  37. Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
  38. Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).

Tags

Cellular Biology Sayı 104 Amyloid haberci proteini Foto-aktive edilebilir GFP Golgi Lizozom hücre içi Alzheimer hastalığı β-amiloid canlı hücre mikroskopi
Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tam, J. H. K., Pasternak, S. H.… More

Tam, J. H. K., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter