Introduction
Der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen von Blindheit bei Personen im Alter von über 50 1-3. AMD kann in zwei Formen eingeteilt werden: atrophische ("trocken") AMD und neovaskulären ("wet") AMD. Ersteres wird durch geographische Atrophie des retinalen Pigmentepithel (RPE), Choriokapillaris und Photorezeptoren gekennzeichnet, während diese durch die Invasion der abnormen Gefäßen aus der Aderhaut in die äußeren Netzhautschichten gekennzeichnet Undichtigkeit verursachen, Blutungen, und Fibrose und schließlich was zu Blindheit 1,2. Der beiden Formen, Konten neovaskulärer AMD für die Mehrheit der Sehverlust 1. Glücklicherweise ist dieses Formular mit zahlreichen wirksamen pharmakologischen Management-Optionen, während sein Pendant atrophische derzeit hat kein nachweislich medizinische Behandlungen 3. Da darüber hinaus der neovaskulären Form wurde leicht in einem Tiermodell neu kapituliert, hat es mehr allgemein zugänglich, grundlegende A gewesenMD Forschung Erforschung der zugrunde liegenden Pathomechanismen, um neue Therapien 4 zu entwickeln.
Die erste Tiermodell der experimentellen CNV (CNV) wurde durch Ryan et al. in nicht-menschlichen Primaten 5. Dieses Modell induzierten Ruptur der Bruch-Membran mittels Laser-Photokoagulation, die eine lokale Entzündungsreaktion, was zu Angiogenese ähnlich wie bei neovaskulärer AMD gesehen verursacht. Die histopathologischen Progression der Angiogenese post-Laserinduktions wurde festgestellt, neovaskulärer AMD, die das Modell der Gültigkeit 6 bestätigt imitieren. Primaten bieten die ähnlichste Anatomie den Menschen, aber leider sind teuer zu erhalten, kann nicht leicht genetisch manipuliert werden können, und eine langsame zeitliche Verlauf der Progression der Erkrankung. 7 Im Gegensatz dazu sind auch im Nagetiermodell sehr viel kostengünstiger zu erhalten, kann genetisch mit relativer Leichtigkeit gehandhabt werden, und haben eine viel schnellere COURSE der Krankheitsprogression (Versuche kann auf einer Zeitskala von Wochen statt Monate durchgeführt werden). Diese Versuche sollten nur in pigmentierten Nagetieren durchgeführt werden, da es sehr schwierig ist, bei Albino Tieren visualisieren.
Die Maus Laser-induzierten CNV-Modell, die zuerst von der Campochiaro Gruppe in den späten 90er Jahren 10 entwickelt, hat sich zu der dominierende Tiermodell in der Mehrzahl der neueren Studien 11-16 sein. Aufgrund der komplexen und noch immer unklar Pathogenese der CNV, hat der Laser-Modell in allen Aspekten der feuchten AMD Forschung reichen von der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Fahrt Angiogenese zur Bewertung neuer Behandlungsmodalitäten für zukünftige Anwendung beim Menschen angewendet. B. Sakurai et al. und Espinosa-Heidmann et al. verwendet das Lasermodell, um die Wirkung von Makrophagen auf die Entwicklung der CNV unter Verwendung transgener Mäuse und pharmakologische Behandlungen Verarmungs 15, 16 zu untersuchen. Giani et al. und Hoerster et al. gebrauchte optischen Kohärenztomographie (OCT), die dem Bild das laserinduzierte CNV in dem Bemühen, das Fortschreiten der CNV zu charakterisieren und vergleichen Sie die histopathologischen Befunden den Feststellungen auf OCT-Bildgebung 12,17 gesehen. Schließlich haben Studien mit intravitreale Injektion von anti-angiogene Mittel als Voraussetzung für Studien am Menschen eingesetzt worden und waren von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung der ersten Generation im Management der neovaskulären AMD heute 10,18,19 verwendet Anti-VEGF-Agenten.
Alternative Modelle für experimentelle CNV nutzen zu chirurgischen Methoden zur CNV induzieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Injektion pro-angiogene Substanzen (zB rekombinante virale Vektoren überexprimierenden VEGF, subretinalen Injektion von RPE-Zellen und / oder Polystyrolkügelchen), um die erhöhte Expression von VEGF in neovaskulären AMD gesehen imitieren, mit dem Ziel, wodurch die Angiogenese 8,20. , Liefert diese Methode jedoch eine drastisch geringere Inzidenz von Gefäßneubildung; Diese Studien zeigten, dass CNVC57 / BL6-Mäusen tritt in 31% der Injektionen gegen die ~ 70% Erfolgsrate in der Laser-Photokoagulation Verfahren in der gleichen Mäusestamm 8,14 gesehen. Aus diesen Gründen und angesichts der Vorteile der Verwendung von Nagetieren im Vergleich zu nicht-menschlichen Primaten, hat sich die Maus-Modell der Laser-induzierten CNV sich zum Standard-Tiermodell CNV für die meisten neovaskulärer AMD Studie Versuche 8.
Die Maus-Auge ist ein winziges, empfindliche Gewebe, mit zu arbeiten. Manövrieren des Auges auf die Netzhaut zu visualisieren ist schwierig und erfordert viel Übung, bis Meisterschaft erreicht. Diese Aufgabe wird durch die Tatsache, dass es mit der dominanten und nicht-dominanten Hand gelernt werden kompliziert. Darüber hinaus, nachdem die feinen Bewegungen erforderlich, um die Netzhaut zu visualisieren gelernt wurden, die Koordination zwischen beiden Händen und dem Fußpedal Betrieb des Lasers sind wichtig. In diesem Artikel haben wir versucht, die Herausforderungen des Lernens alle physikalische Manipulationen in der Laser-induzierten CNV proc eingebunden zu destillierenEDURE in eine Führung, die helfen würden Betreiber zu erreichen schnellen Erfolg mit diesem Modell.
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Protocol
Alle Tiere werden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Pflege und Verwendung von Labortieren Ausgabe 2013 behandelt, der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research, und wie von der Institutional Animal zugelassen Pflege und Verwendung Komitee für Northwestern University.
Hinweis: Das folgende Verfahren kann vollständig mit einem Bediener durchgeführt werden; ist es jedoch wesentlich effizienter mit zwei Operatoren durchgeführt mit den Aufgaben entsprechend aufgeteilt.
1. Bereiten Bahnhof Laser und Pre-Laser
- Positionieren Sie den Laser und Spaltlampe, wo sie leicht zugänglich sein. Schalten Sie Laser und stellen vor, bestimmten Parameter (zB 75 um Punktgröße, 100 mW Leistung, 100 ms Dauer).
ACHTUNG: Stellen Sie sicher, Betreiber trägt alle Tier-und Laserschutz persönliche Schutzausrüstung und zugehörige Laser-Sicherheitsschilder befinden sich außerhalb des Verfahrens Raum angezeigt.- Vor dem Einsatz von Versuchstieren, finden Sie ideale Parameter mit Hilfe einer Eich, nicht-experimentellen Maus. Laser-Parameter auf dem Laser abhängen. Ideal Parameter werden von der niedrigsten Laserleistungseinstellung, die konsequent verursacht "Blase" Bildung, wenn richtig scharf definiert. Video starten zB der Läsion mit der richtigen "Blase" Bildung.
- Bereiten Sie den Pre-Laserstation, so dass Anästhesie, Tierwärmer, Gewebetücher, und alle Augentropfen (Tropicamid, Tetracain und künstliche Tränen) sind leicht zu erreichen, um Bediener.
- Stellen Sie sicher, dass Tier wärmer wird vorgewärmt, um Temperatur (37 ° C) vor der Injektion Anästhetikum in erste Maus, um Anästhesie induzierte Hypothermie vermeiden, zu korrigieren.
- Platzieren Sie die Maus auf der Bühne wärmeren so Wärme zu halten und warm bleiben, wenn Laser-Verfahren beginnt.
2. Maus Anästhesie und Pre-Laser-Vorbereitung
- Vor spritzening Anästhesie, inspizieren die Augen makroskopisch, um sicherzustellen, es hat keine Missbildungen oder Anomalien, die Hornhautklarheit (zB Katarakt) zu verringern.
- Wiegen Sie die Maus.
- Nehmen Sie Gewicht, Geschlecht, und Tier ID-Nummer.
- Verwenden Gewicht, berechnen Sie entsprechende Menge an Narkosemittel auf Basis von Richtlinien, die von Institution gegeben (zB 100 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid, 10 mg / kg Xylazin ODER Tribromethanol 250 mg / kg zu verwenden; für eine 20 g-Maus injiziert 0,20 ml Xylazin / Ketamin-Cocktail OR 0,25 ml Tribromethanol). Haben Sie eine Tabelle von vorberechneten Dosierungen pro Gewicht in Schritten von 1 g, um Rechenfehler zu reduzieren.
- Scruff Maus und injizieren Narkose intraperitoneal auf Berechnungen in Schritt 2.4 basiert.
- Platzieren Sie die Maus über Tier wärmer und warten Sie, bis der Maus vollständig durch die Überprüfung der Pedalreflex über toe Prise (ca. 3-5 min) anästhesiert.
- Rollen Sie oben einen Gewebe zu wischen und zu schützen Nasenbereich die Maus, um zu verhindern aspiratIonenflüssigkeits roll-off. Roll-Maus auf die Seite und einen Tropfen (etwa 30 ul) Tetracainhydrochlorid in jedes Auge für die Lokalanästhesie. Warten Sie 2 Minuten für die Lösung zu übernehmen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.7 mit einem Tropfen topische Tropicamid zur Pupillenerweiterung. Alternativ können Sie Phenylephrinhydrochlorid (2,5%) für die Dilatation.
- Warten Sie 2 Minuten nach Lösungen zu übernehmen; halten Tier auf wärmere während dieser Zeit.
- Nach entsprechender Zeit abgelaufen ist, schnell die Maus an der Maus Bühne und platzieren Sie die Bühne, auf Kinnstütze der Spaltlampe.
- Schalten Sie Spaltlampe auf die niedrigste Lichthelligkeit und überprüfen Sie den Grad der Pupillenerweiterung. Wenn Schüler nicht ausreichend geweitet (ungefähr 2,5-3 mm), Rück Maus, um Tier wärmer und warten. Alternativ zu verwalten einen Tropfen Tropicamid. Nach Augen ausreichend erweitert, um Laser-Prozedur fort.
3. Laser Procedure
Hinweis: Stellen Sie sicher, andere personen im Zimmer Schutzbrille tragen, wenn weg von Laser-geschützten Spaltlampe Okular
- Anpassen der Positionierung der Maus auf der Mausstufigen, so dass sie sich hervorragend zur Visualisierung des Sehnervs (siehe 3.1.2) positioniert ist.
- Richten Sie die Maus auf der Halterung so dass es horizontal liegt, senkrecht zur Lampenträger geschlitzt, mit dem Kopf auf der einen Seite und Schwanz am anderen. Ideal Maus Platzierung machen Sehnerv Visualisierung viel einfacher, wenn Deckglas aufgebracht wird.
- Leicht drehen Sie die Maus, damit es zu einem ~ 170 ° Winkel mit dem Kopf näher an Laser Betreiber ist.
- Stellen Sie sicher, dass Maus ist so nahe wie möglich in der Lage Spaltlampe, aber immer noch, wo sie stabil und in dem die Hand des Bedieners wird genügend Platz für die Feinmanipulation haben ist.
- Nachdem die Maus ist ideal positioniert, einen Tropfen künstliche Tränenflüssigkeit auf einem 25 mm x 25 mm Deckglas.
- Geben Sie einen Tropfen künstliche Tränenflüssigkeit auf Maus opposite eye - dies stellt sicher, Auge hydratisiert und helfen Verzögerung Kataraktbildung.
- Halten Ecke des Deckglases zwischen Daumen und Zeigerfinger; Position, so daß das Glas zwischen den Spitzen der beiden Fingern gequetscht.
- Sanft wickeln Sie die übrigen drei Finger um den Körper des Tieres für die Unterstützung und Stabilisierung der Hand. Position der Hand, so dass das Deckglas leicht auf das Auge des Maus platziert werden.
- Achten Sie darauf, dass das Handgelenk auf einer festen Oberfläche, um Zittern der Hand zu reduzieren stabilisiert.
- Sobald stabile Position erreicht ist, drücken Sie vorsichtig Deckglas (mit Tropfen künstliche Tränen noch eingehalten) auf das Auge des Maus.
- Sicherzustellen, dass das Deckplättchen möglichst senkrecht zu dem Laserstrahl, um Laserstrahlstreuung oder Reflexion zu verhindern positioniert. Das Deckglas wirkt wie eine Kontaktlinse, die Hornhaut zu glätten.
- Schauen Sie durch Spaltlampe und mit der freien Hand Knie konzentrieren until Netzhaut kann visualisiert werden. Die Netzhaut wird ein hellgelbes / rote Farbe je nach Standort sichtbar gemacht haben, werden verschiedene, rot Gefäße sichtbar sein.
- Langsam und vorsichtig manipulieren Mauskopf und / oder Deckglas, bis die Visualisierung des Sehnervs. Der Sehnerv wird in der Farbe gelb mit mehreren Schiffen strahlenförmig von ihm zu sein.
- Sobald Betreiber Visualisierung der Sehnerv bestätigt, schalten Sie Laser Fokussierstrahl.
- Sobald Laserstrahl eingeschaltet wurde, zu manövrieren Laserfokussierungsstrahl in die gewünschte Position (etwa 1 Scheibendurchmesser vom Sehnerv).
- Konzentrieren Laserstrahls auf dem RPE des Augenhintergrundes. Ein korrektes Fokussieren wird durch mit den schärfsten und klarsten Laserstrahl erreicht. Wenn Zielstrahl sieht oval oder unscharf, Kniespaltlampe Fokus oder Wiederposition Deckglas.
- Sobald der Zielstrahl auf RPE konzentriert, zu initiieren Laser Verabreichung unter Verwendung des Lasers Fuß Auslöser.
- Achten Sie darauf, Netzhautgefäße zu verhindern, zu vermeiden Augeninnen ermorrhage.
- Uhr für das Auftreten einer Blase unmittelbar nach Laser Verabreichung. Der Umriss des Laserschuss sollte klar und nicht in irgendeiner Weise verschwommen sein.
- Wenn die Laserschuss nicht in Blasenbildung führen, oder den Bereich des Aufpralls sieht trübe (trübes Aussehen mit schlecht definierten Kreisgrenze gegen klare, scharf definierte Grenze für eine erfolgreiche Wirkung) oder wenn Blutung nach der Laser Verwaltung gesehen, weiß nicht sind diese Läsionen für eine spätere Analyse.
- Die Schritte 3.10-3.12 für alle gewünschten Positionen CNV (gewöhnlich 3, 6, 9 und 12 Uhr-Positionen in der Umgebung des Sehnervs). Wenn Laser Induktionen in annähernd gleichen Abstand von Sehnerv aufgetragen sollte Refokus nicht notwendig sein. Jedoch aufgrund der starken Krümmung der Maus Auge und kleinen Variationen, die in der Netzhaut bestehen kann, Refokussierung des Strahls erforderlich zwischen aufeinanderfolgenden Laser Behörden sein.
- Nehmen Sie in einem Notizbuch die Lage und Folge der each Laserschuss Verwaltung und Ergebnis (erfolgreich, dunstig, Blutungen, etc.) jedes verabreicht Schuss für das Auge. Achten Sie darauf, um den Laser im Stand-by-Modus bei Nichtgebrauch zu platzieren.
- Wiederholen von 3,1 bis 3,14 für die Maus andere Auge, falls erforderlich, mit der anderen Hand zur Stabilisierung und ein neues Deckglas.
- Nachdem alle gewünschten Laserschüsse verabreicht werden, schalten Sie Laser und Spaltlampen.
- Entsorgen Sie Deckglas und Ort der Maus an wärmeren für die Erholung von der Anästhesie. Makroskopisch inspizieren Auge für Verletzungen und einen Tropfen künstliche Tränenflüssigkeit, um das Auge zu halten hydratisiert und möglicherweise verhindern, dass künftige Kataraktentwicklung. Sobald die Maus wieder aus der Narkose, um Käfig zurück.
| AVERTIN | AVERTIN | AVERTIN | XYL / KET | XYL / KET | |
| Maus-Gewicht (g) | Dosis (mg / kg) | Narkosedosis (ml) | Dosis (mg / kg) | Narkosedosis (ml) | |
| 15 | 250 | 20 | 0,1875 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,15 |
| 16 | 250 | 20 | 0,2 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,16 |
| 17 | 250 | 20 | 0,2125 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,17 |
| 18 | 250 | 20 | 0,225 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,18 |
| 19 | 250 | 20 | 0,2375 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0,25 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,2 |
| 21 | 250 | 20 | 0,2625 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,21 |
| 22 | 250 | 20 | 0,275 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,22 |
| 23 | 250 | 20 | 0,2875 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,23 |
| 24 | 250 | 20 | 0,3 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,24 |
| 25 | 250 | 20 | 0,3125 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,25 |
| 26 | 250 | 20 | 0,325 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0.26 |
| 27 | 250 | 0,3375 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0,35 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,28 |
| 29 | 250 | 20 | 0,3625 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0.29 |
| 30 | 250 | 20 | 0,375 | 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin | 0,3 |
Tabelle 1: XyIKet Dosierungstabelle.
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Representative Results
Die Quantifizierung der CNV Läsionen können durch die Analyse von Flach montiert Aderhaut mit Immunfluoreszenzfärbung, die CNV Schiffe kennzeichnen durchgeführt werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden der Gewebepräparation sind FITC-Dextran Kennzeichnung, über Perfusion unmittelbar vor dem Tieropfer oder Post-mortem-Immunfärbung mit einem Endothelzellen-Markierung. Beide dieser Verfahren wurden bereits im Detail beschrieben worden 13,14,21; Figuren 1 und 2 zeigen Beispiele von jedem sind. Nach der konfokalen Mikroskopie Bild Erwerb, entweder Bereich (2-Abmessungen) oder Volumen (3-Abmessungen) berechnet und mit ImageJ Software oder Volocity visualisiert werden. Zusätzlich zur Quantifizierung kann OCT-Bildgebung verwendet, um die CNV-Läsion in vivo zu visualisieren. Ein Beispiel für eine Querschnittsbild der Netzhaut mit resultierenden CNV ist in Abbildung 3 dargestellt.
lt = "1" src = "/ files / ftp_upload / 53.502 / 53502fig1.jpg" />
Abb. 1: CNV Perfusion Färbung und Fläche (2D) Berechnungsbeispiel (25x) (A) FITC-Dextran perfundiert CNV-Läsion. (B) ImageJ Bereich Quantifizierungsmethode via Schwellen. Mausstamm:. C57BL / 6J Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: CNV Immunfärbung & Volume (3D) Berechnungsbeispiel (25x) (A) Isolectin GS-IB4 befleckt CNV-Läsion.. (B) 3D-Rekonstruktion der CNV-Läsion en face Blick. (C) 3D-Rekonstruktion Seitenansicht (B und C eine Fliese width = 35 & mgr; m). Mausstamm: C57BL / 6J.g2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: Oktober Querschnitts CNV Visualization (A) Oktober en face Blick auf CNV-Läsion. (B) Oktober Querschnitt B-Scan der Netzhaut mit CNV kreiste in gelb. Mausstamm:. C57BL / 6J Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt mehrere Faktoren, die Laser-Lieferung und resultierende CNV Läsionsentwicklung nach erfolgreicher Laserinduktion beeinflussen können. Diese Faktoren sollten für kontrollierte und um die zuverlässigsten Ergebnisse müssen vereinheitlicht werden. Der wichtigste dieser Faktoren sind Mausauswahl (Genotyp, Alter und Geschlecht), Anästhesieauswahl und Lasereinstellungen.
Die spezifische Maus-Modell verwendet werden, können eine signifikante Wirkung auf den Verlauf der CNV Entwicklung. Das am häufigsten verwendete Genotyp der C57BL / 6-Maus. Der Verkäufer, aus dem die Tiere erhalten werden, können die resultierenden CNV Größe beeinflussen. Schlechte et al. zeigten signifikante Unterschiede in der endgültigen CNV Läsionsgröße in C57BL / 6 Mäuse von Jackson, Charles Rivers, und Taconic Labors, mit Mäusen von Taconic Entwicklung deutlich größer CNV als die beiden anderen Anbieter 4. Daher Kauf aus einer Hand und mit allen Mäusen ab dem gleichen Anbieter wird dazu beitragen, externe Unterschiede zu minimierenin CNV Läsionsgröße. Alter und Geschlecht der Maus wurde auch gezeigt, dass ein wichtiger Faktor bei der Gestaltung des Experiments. Weibliche Mäuse entwickeln CNV als männliche Mäuse des gleichen Alters und älteren Mäusen beiderlei Geschlechts entwickeln CNV als jüngere Mäuse 22,23. In Abhängigkeit von den experimentellen Parametern, sollten Betreiber, diese Faktoren im Auge zu behalten. Zum Beispiel, wenn Bediener unter Verwendung einer laser CNV Verfahren mechanistischen und arzneimittelEntwicklungsZwecke zu erläutern, sollten beide Geschlechter in verschiedenen Altersstufen verwendet werden, um Mechanismen, die spezifisch für den Geschlechtern und solchen, die es nicht sind zu definieren.
Proper Anästhesie ist ein entscheidender Schritt für dieses Verfahren, vor allem während des Lernprozesses. Die meisten IACUC zugelassenen Therapien können Anästhesie für mindestens 15-30 Minuten, was mehr als genug Zeit, um 4-5 Laserschüsse für jedes Auge zu liefern, sobald das Verfahren bewältigt wurde ist zu induzieren. Wenn jedoch zu viel Zeit verstreicht, Anästhesie können reversible Linsentrübung, erneute führenndering das Auge optisch undurchlässig für experimentelle CNV 24. Die beiden wichtigsten Protokolle zur Narkoseeinleitung sind ein Xylazin / Ketamin Cocktail oder Tribromethanol (TBE) intraperitoneal geliefert. Obwohl einige Berichte setzen die Vorteile der TBE auf Xylazin / Ketamin in Bezug auf die Kataraktbildung, die beide schließlich in der Entwicklung einer getrübten Linse führen, wenn der Bediener nicht schnell 14 zu arbeiten. Ein Weg, um die Zeit vor Kataraktentwicklung erstrecken Hydratation des Auges aufrecht zu erhalten, wie in der detaillierten Protokoll erwähnt, durch die Anwendung von künstlichen Tränen 25. Dieses Verfahren, unabhängig von anästhetischen Stoff verwendet wird, sollten helfen, Kataraktbildung verzögern und geben dem Bediener mehr Zeit, um den Vorgang abzuschließen.
Laser-Einstellungen kann ein wichtiger Faktor bei der zuverlässigen Induktion von CNV zu sein. Kalibrieren der Laserleistung und Laufzeit sind ein wichtiger erster Schritt vor der Durchführung des Verfahrens an Versuchstieren. Laserschüssedass Ursache Blutungen oder unscharf sind ohne Blasenbildung sollte von der Berechnung ausgeschlossen werden, da dies stört die CNV Entwicklungsprozess. Wenn mehrere Gefäße zerrissen verursacht diffuse Blutung sollte das gesamte Auge ausgeschlossen. Idealerweise sollte die niedrigste Leistungsaufnahme und kürzeste Dauer von Laser, die konsequent Bruch-Membran verursacht Blasenbildung und eine Läsion mit klaren Abgrenzung zerreißt verwendet 4 werden. Protokolle das Experimentieren mit verschiedenen Leistungsstufen haben, dass eine erhöhte Leistung und Dauer führen zu übermäßiger Gewebeschäden und in der Folge niedrigere CNV Bildung 4, 14,17 demonstriert. Weiterhin kann Ort des Laser Verletzungen betreffen auch CNV Entwicklung. Auswirkungen geliefert ca. 1 Scheibendurchmesser (DD) von der optischen Platte ergab deutlich größere Fläche CNV Volumina als die gelieferte <1 DD oder 2 oder mehrere DDs entfernt 23. Abhängig von der Post-Laseranalyse Läsion Lage kann oder auch nicht entscheidend. Beispielsweise,wenn ein OCT-Bild, um aller Läsionen erhalten werden soll, ist in zentraler Lage um den Sehnerv von entscheidender Bedeutung. Im Gegensatz dazu, wenn Läsionen sind über flache Halterung analysiert werden, ist Läsion Lage nicht so entscheidend. Schließlich sicherstellen, dass die letzten Schüsse sind nicht zu nahe aneinander oder auch zwei Läsionen können "wachsen" zusammen gestellt.
Die CNV-Assay ist eine robuste Methode, um experimentell zu studieren neovaskulärer AMD. Die Angiogenese von Laserinduktions resultierenden ähnelt in Lage und Gesamterscheinungsbild zu der in der menschlichen AMD-Patienten beobachtet Angiogenese. Es ist jedoch weit von einem perfekten Modell. Im Gegensatz zum menschlichen Auge weiß Mäusen keine definierte Makula und die akute Verletzung bezogenen Angiogenese im Laser-induzierten CNV Modell gesehen unterscheidet sich grundlegend von der genetisch beeinflusst, chronische Pathologie AMD 7,8,14. Die Maus retinalen Umgebung ist gesund und die resultierende Angiogenese als Reaktion auf das Trauma durch die Lasereinwirkung, sondern als genetischer / e verursacht auftrittnvironmental Faktoren und Alter, wie in menschlichen AMD. Im Gegensatz dazu ist die menschliche Retina Umgebung in AMD in einem Zustand chronischer Entzündung, wobei Abweichungen in der Expression von VEGF und andere Cytokine verursachen CNV 3. Offensichtlich ist die neovaskulären Entwicklung in diesen beiden Umgebungen deutlich verschieden.
Zusammenfassend ist das laserinduzierte CNV-Protokoll ein, dass zunächst schwierig durchzuführen, aber letztlich lohnend zu meistern ist. Die feine Geschicklichkeit erforderlich, um die Maus und Deckglas zu halten, als auch zu manipulieren das Deckglas und-Maus-Kopf, um den Sehnerv zu visualisieren sind Übungen, die Geduld und Übung erfordern, zumal sie müssen gut mit entweder Hände der Bedienungsperson durchgeführt werden. Sobald jedoch der Technik erfuhr sie eine effiziente Möglichkeit zum Implementieren experimentellen CNV sein und kann für die meisten Aspekte der neovaskulären AMD Forschung angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
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