Introduction
年龄相关性黄斑变性（AMD）是失明的个体50 1-3岁以上的主要原因之一。 AMD可分为两种形式：萎缩性（“干”）AMD和新生血管（“湿”），AMD。前者的特征在于视网膜色素上皮细胞（RPE），脉络膜，和光感受器地理萎缩，而后者的特征在于侵入从脉络膜异常血管的插入外视网膜层造成渗漏，出血和纤维化，最终导致失明1,2。这两种形式中，新生血管性AMD占绝大多数视力减退1。幸运的是，这种形式有许多有效的药物管理选项，而它的萎缩对应目前还没有成熟的医学治疗3。此外，由于新生血管形态已经很容易地重新投降的动物模型，它已经被越来越广泛地接触到基本的AMD研究探索潜在的病理机制，以便开发新型疗法4。
由Ryan等人开发的实验性脉络膜新生血管形成（CNV）的第一动物模型。在非人灵长类5。布鲁赫膜通过激光光凝该模型诱发破裂，这引起导致血管生成类似于见于新生血管性AMD的局部炎症反应。血管生成后的激光诱导的组织病理学进展，发现以模仿新生血管性AMD，这证实了模型的有效性6。非人灵长类提供最相似解剖人类，但不幸的是，维护费用昂贵，不能轻易遗传操作，并且有疾病进展7的慢时间过程。与此相反，啮齿动物模型是更经济有效的维护，可以遗传操作相对容易，并具有更快的凑疾病进展的RSE（实验可以在周的时间尺度来进行与个月）。这些实验应该只在有色啮齿类动物中进行，因为它是非常困难的白化动物来可视化。
鼠标激光诱导CNV模型，首先由坎波基亚罗集团在90年代末10开发，已经成长为在大多数最近的研究11-16的占主导地位的动物模型。由于CNV的复杂，目前还不清楚发病机理，激光模式已在湿性AMD的研究，从学习驾驶血管生成来评估新的治疗模式为未来的人类使用的分子机制各个方面的应用。例如，Sakurai等人和埃斯皮诺萨，Heidmann 等 。使用的激光模型，探讨巨噬细胞对CNV的使用转基因小鼠和药理耗尽处理15，16中的发展的影响。吉亚尼等 。和Hoerster 等。用的光学相干断层扫描（OCT），以图像的激光诱导的CNV在努力表征CNV的进展和比较组织病理学结果以看到的OCT成像12,17的调查结果。最后，涉及玻璃体内注射的抗血管生成剂的研究已被用作先决条件人体试验并分别在显影的第一代中新生血管性AMD今天10,18,19的管理中使用的抗VEGF剂是至关重要的。
替代模式的实验CNV利用手术的方法，诱导CNV。此过程涉及注射促血管生成物质 （如重组病毒载体过量表达血管内皮生长因子，视网膜下注射RPE细胞和/或聚苯乙烯珠），以模仿见于新生血管性AMD的增加的VEGF表达，以引起血管生成8,20的目标。然而，这种方法产生新血管形成的显着较低的发生率;这些研究显示，在CNVC57 / BL6小鼠中发生注射抗小鼠8,14的相同应变出现在激光光凝法的〜70％的成功率的31％。由于这些原因，并给予使用啮齿类动物对非人类灵长类动物的优势，激光诱导CNV的小鼠模型已成为CNV的标准动物模型对于大多数新生血管性AMD的研究实验8。
鼠标的眼睛是微乎其微的，细腻的组织一起工作。眼可视化的视网膜机动是困难的，需要大量的练习，直到掌握为止。这个任务是由一个事实，即它必须与显性和非优势手学习复杂。此外，以显现视网膜所需的精细动作已经被学习之后，双手和脚踏板操作激光之间的协调是重要的。在本文中，我们试图以蒸馏学习所有参与的激光诱导的CNV进程内的物理操纵的挑战edure成一个指南，将帮助运营商实现快速成功，这种模式。
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Protocol
所有的动物都按照实验动物的护理和使用2013版的指南治疗，研究协会在视觉与眼科（ARVO）机构在眼科和视觉研究的用途声明，并作为批准的机构动物护理和使用委员会为西北大学。
注意：下面的过程可以完全与一个操作者来完成;然而，可以更有效地与两个操作员进行的任务分割相应。
1.准备激光和预激光站
- 位置激光器和裂隙灯它可以很容易地访问。打开激光，并设置到预先确定的参数 （例如为75μm斑点尺寸，100毫瓦功率，100毫秒持续时间）。
注意：确保操作人员佩戴所有的动物和激光安全个人防护装备和相关的激光安全标志显示在操作室之外。- 使用任何动物实验之前，要使用校正，非实验小鼠理想的参数。激光参数将取决于所用的激光器。理想的参数是由最低的激光功率设置，始终会导致“泡沫”的形成正确的时候集中定义。例如，见病变，适当的“泡沫”的形成视频。
- 制备预激光站，使得麻醉，动物温暖，组织擦拭物，以及所有滴眼剂（托品，丁卡，以及人工泪液）容易伸手可及到操作者。
- 确保动物温暖被预热以纠正注射麻醉剂到第一鼠标以避免麻醉诱导的低温之前的温度（37℃）。
- 放置在温暖的鼠标的阶段，因此它可以保持热量和保持温暖，一旦激光过程开始。
2.鼠标麻醉和预激光制备
- 注射前荷兰国际集团麻醉，检查眼睛宏观，以确保它有没有畸形，或减少角膜透明度（ 如白内障）异常。
- 称量鼠标。
- 记录体重，性别，和动物的ID号。
- 使用重量，计算麻醉剂的合适量基于由机构给予（ 如100毫克/千克氯胺酮盐酸盐，10毫克/千克甲苯噻嗪或三溴250毫克/千克的准则来使用;对于20克小鼠注入0.20 ml的甲苯噻嗪/氯胺酮鸡尾酒或0.25毫升三溴的）。有为了减少的数学错误中的1克增量每重量预先计算的剂量表。
- 颈背鼠标和注入腹腔麻醉根据计算步骤2.4。
- 将鼠标放在动物的温暖，等待鼠标被通过脚趾捏（约3-5分钟），检查踏板反射完全麻醉。
- 卷起纸巾擦拭，并保护鼠标的鼻区，以防止aspirat离子液体的滚降。在其一侧滚动鼠标，并将盐酸丁卡因一滴（约30微升）到每只眼睛局部麻醉。等待2分钟的解决方案才能生效。
- 用一滴局部托吡卡胺的瞳孔扩张，重复步骤2.7。另外，使用盐酸去氧肾上腺素（2.5％），用于扩张。
- 等待2分钟的解决方案才能生效;在此期间，保持动物的温暖。
- 经过适当的时间过去后，迅速将鼠标鼠标舞台放在裂隙灯的下巴休息阶段。
- 打开裂隙灯到最低光亮度和检查瞳孔扩张的程度。如果学生没有充分扩张（约2.5-3毫米），返回鼠标动物温暖和等待。另外，管理另一滴托吡卡胺。一旦眼睛充分扩张，进入激光治疗。
3.激光治疗
注意：确保其他的persons在房间里戴防护眼罩时远离激光保护裂隙灯目镜
- 调整的放置鼠标在鼠标阶段，因此，它是理想的位置为视神经可视化（参见3.1.2）。
- 定向鼠标在其支架中，使其位于水平，垂直于裂隙灯光束，用头在一侧和尾部在其他。理想的鼠标放置会使视神经视觉一次盖玻片应用于容易得多。
- 稍微转动鼠标所以它是在一个〜170°角与头部更接近激光操作者。
- 确保小鼠是尽可能接近到裂隙灯，但仍然在一个位置，它是稳定的并且其中所述操作者的手将有足够的空间用于精细操作。
- 之后，鼠标的理想位置，放置的人造泪液一滴在25毫米×25毫米的玻璃盖玻片。
- 将一滴人造泪液鼠标的OPPosite的眼睛 - 这将确保眼睛的滋润，有助于延缓白内障的形成。
- 用拇指和指针手指之间盖玻片的角落;位置，以使该玻璃被挤压两根手指的尖端之间。
- 轻轻地缠绕在动物的尸体，其余三个手指的支持和手部稳定。位置手使玻璃盖玻片可以容易地放置在鼠标的眼球。
- 确保手腕稳定在一个坚固的表面，以减少手震。
- 一旦获得稳定的位置，小心地按玻璃盖玻片（用一滴人工泪液仍然坚持）到鼠标的眼睛。
- 确保盖玻片被定位为垂直尽可能激光束，以防止激光束散射或反射。盖玻片用作隐形眼镜变平角膜。
- 看看通过裂隙灯和自由之手拨动集中UNTIL视网膜可以可视化。视网膜将具有浅黄色/红色取决于可视的位置，不同的，红色船只将可见。
- 慢慢地，小心地操纵鼠标的头部和/或盖玻片，直到可视化的视觉神经。视神经将黄色与多支来自它的辐射。
- 一旦运营商已经确认视神经的可视化，打开激光聚焦光束。
- 一旦激光束已经接通，操纵激光聚焦束以期望的位置（约1盘直径从视神经）。
- 聚焦激光束在眼底的视网膜色素上皮。正确的焦点是通过具有锐利和最清晰的激光束来实现。如果瞄准光束看起来呈椭圆形或失焦，拨动裂隙灯焦点或重新定位玻璃盖玻片。
- 一旦瞄准光束聚焦在视网膜色素上皮，启动用激光的脚触发激光施用。
- 一定要避免视网膜血管，防止眼内，他morrhage。
- 观看的气泡的激光施用后立即出现。激光照射的轮廓应该是明确的，不以任何方式朦胧。
- 如果激光照射不会导致泡沫的形成，或冲击的区域看起来朦朦胧胧（混浊外观上采用不明确的圆形边框与一个成功的影响，明确，清晰的边界），或出血激光给药后看到，不包括这些病变，供日后分析。
- 重复步骤3.10-3.12对于所有所需的CNV的位置（通常在3，6，9，及左右视神经12点钟的位置）。如果激光导入装置被应用在从视神经大致相同的距离，再聚焦没有必要。然而，由于在小鼠眼和小的变化的强曲率中可能存在的视网膜上，再聚焦光束可以是连续激光施用之间必要的。
- 记录在笔记本上的位置和电子邮件的结果ACH激光照射管理，结果管理的每个镜头的眼睛（成功，朦朦胧胧，出血等 ）。一定要放置在激光待机模式时不使用。
- 重复3.1-3.14为鼠标的另一只眼，如果需要的话，用另一只手进行稳定和一个新盖玻片。
- 毕竟所需的激光枪施用，关闭激光器和裂隙灯。
- 丢弃盖玻片和地点鼠标回暖从麻醉中苏醒。宏观检查眼睛的任何伤害，并把一滴人工泪液解决方案，以保持眼睛水分，并可能防止未来白内障的发展。一旦小鼠从麻醉中恢复，回到笼子里。
| 阿佛丁 | 阿佛丁 | 阿佛丁 | XYL / KET | XYL / KET | |
| 鼠标重量（g） | 剂量（毫克/千克） | 麻醉剂剂量（毫升） | 剂量（毫克/千克） | 麻醉剂剂量（毫升） | |
| 15 | 250 | 20 | 0.1875 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.15 |
| 16 | 250 | 20 | 0.2 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.16 |
| 17 | 250 | 20 | 0.2125 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.17 |
| 18 | 250 | 20 | 0.225 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.18 |
| 19 | 250 | 20 | 0.2375 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0.25 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.2 |
| 21 | 250 | 20 | 0.2625 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.21 |
| 22 | 250 | 20 | 0.275 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.22 |
| 23 | 250 | 20 | 0.2875 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.23 |
| 24 | 250 | 20 | 0.3 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.24 |
| 25 | 250 | 20 | 0.3125 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.25 |
| 26 | 250 | 20 | 0.325 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.26 |
| 27 | 250 | 0.3375 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0.35 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.28 |
| 29 | 250 | 20 | 0.3625 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.29 |
| 三十 | 250 | 20 | 0.375 | 100毫克/千克氯胺酮; 10mg / kg的甲苯噻嗪 | 0.3 |
表1：XyIKet剂量图表。
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Representative Results
CNV病变的定量可以通过使用免疫荧光染色以标记CNV血管平置式脉络膜分析来执行。组织制备的两个最频繁使用的方法是FITC-葡聚糖标记，立即动物牺牲，或与内皮细胞标记物验免疫染色之前经由灌注完成。这两种方法都已经详细13,14,21先前描述;图每1 和 2示出的例子，分别共聚焦显微镜图像采集，或者区域（2-尺寸）或音量后（3-尺寸）可被计算和可视化处理的ImageJ软件或Volocity。除了 量化，OCT成像可用于可视化的CNV病变的体内 。用所得的CNV视网膜的横截面图像的一例示于图3。
LT =“图1”SRC =“/文件/ ftp_upload / 53502 / 53502fig1.jpg”/>
图1：CNV灌注染色和面积（2D）计算例（25X）（A）FITC葡聚糖灌注CNV病变。通过阈值（B）的ImageJ面积定量方法。小鼠品系：C57BL / 6J 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：CNV免疫染色及成交量（3D）计算例（25X）（A）植物凝集素GS-IB4染色CNV 病变。 （二）三维重建CNV病变恩面对看法。 （C）三维重建侧视图（B和C一个区域宽度= 35微米）。小鼠品系：C57BL / 6J。g2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：华侨城截CNV可视化 （A）华侨城EN CNV病变的正视图。 （二）视网膜CNV的OCT截面B扫描圆圈为黄色。小鼠品系：C57BL / 6J 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
有成功的激光诱导后会影响激光传输和由此产生的CNV病变的发展多因素。这些因素应控制为与标准化，以便能有最可靠的结果。最相关的这些因素中的鼠标选择（基因型，年龄和性别），麻醉剂的选择，以及激光设置。
使用的特定小鼠模型可以对CNV的发展过程中一个显著效果。最广泛使用的基因型是C57BL / 6小鼠。从该动物得到的供应商可以影响所得CNV大小。普尔等人。证明在C57BL / 6小鼠自Jackson，查尔斯河，和Taconic的实验室最终的CNV病变的大小显著差异，自Taconic小鼠显影显著更大CNV比其他两个供应商4。因此，从一家公司购买和使用所有小鼠来自同一个供应商，将有助于减少外部差异在CNV病灶大小。年龄和鼠标性也被证明是设计实验时要考虑的一个重要因素。雌性小鼠开发更多的CNV比同年龄的雄性小鼠，并且两种性别的老年小鼠开发更多的CNV比年轻小鼠22,23。根据不同的实验参数，运营商应该把这些因素考虑。例如，如果运营商所使用的激光的CNV过程阐明机械和药物开发的目的，两性在不同的年龄应被用来定义特定于两性和那些不机制。
适当的麻醉是这个过程的一个关键步骤，特别是在学习过程。大多数IACUC批准的治疗方案可以诱导麻醉至少15-30分钟，这是足够多的时间来提供4-5次激光照射到每只眼睛一旦程序已经掌握。但是，如果太多时间的流逝，麻醉可能会导致可逆的晶状体混浊，再ndering眼睛光学不透水实验CNV 24。用于诱导麻醉的两个主要协议是一个甲苯噻嗪/氯胺酮鸡尾酒或三溴（TBE）腹腔内交付。尽管有些报告断定TBE的优势，赛拉嗪/氯胺酮在白内障的形成而言，无论最终导致晶状体混浊的发展，如果操作者不迅速14工作。到时间白内障发展之前延伸的一种方式是维持眼睛的水化，中提到的详细的协议，通过应用人工泪液25。该方法中，不管使用麻醉剂的物质，应该帮助延缓白内障的形成，并给操作者更多的时间来完成该过程。
激光的设置可以在可靠诱导CNV的一个主要因素。校准激光功率和持续时间都在进行对实验动物手术前的重要第一步。激光枪这引起出血或失焦没有形成气泡应排除计算，因为这破坏了CNV的发展过程。如果多个血管破裂引起弥漫性出血，整个眼睛应排除在外。理想的情况下，最低的功率和激光的时间最短，始终破裂Bruch膜导致与明确的划分泡沫的形成和病变，应使用4。协议与不同的功率设置实验已经证明，提高功率和持续时间导致过度的组织损伤和CNV形成4，14,17随后低利率。此外，激光损伤的位置也可以影响CNV的发展。影响从视盘递送约1盘直径（DD）得到显著更大面积的CNV体积比递送<1的DD或2个或更多的DD远23。根据不同的激光后分析，病变部位可能或可能不是至关重要的。例如，如果OCT图像是所有病灶来获得，视神经周围中央位置是至关重要的。与此相反，如果病变是通过平片待分析，病变位置不是至关重要。最后，保证最后的投篮不放在太靠近彼此，否则两支病变可能“成长”起来。
在CNV检测是一种可靠的方法通过实验研究新生血管性AMD。从激光诱导产生的血管生成是在位置和整体外观在人类AMD患者中观察到的血管生成类似。然而，这是很不理想的模型。不同于人眼，小鼠不具有定义的黄斑和急性损伤相关的血管生成的出现在激光诱导的CNV模型从根本上不同于AMD 7,8,14的遗传影响，慢性病理。鼠标视网膜环境是健康的，所得到的血管生成发生作为反应所造成的激光的影响，而非遗传/ E的创伤环境中的物体的因素和年龄，作为在人的AMD。与此相反，人的视网膜环境，AMD是在慢性炎症状态，异常VEGF的表达等细胞因子引起的CNV 3其间。显然，在这两种环境的新血管发育是明显不同。
最后，激光诱导的CNV协议是一个最初是难以进行，但最终有益掌握。需要按住鼠标和盖玻片，以及操纵盖玻片和鼠标头形象化视神经微细灵巧是需要的耐心和实践，特别是因为它们需要执行良好使用操作的任手练习。然而，一旦技术了解到它可以实现实验CNV的有效方法，并可以应用到新生血管性AMD的研究的大多数方面。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
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