Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 2. Algemene Practices

Abstract

Het werk in een bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) containment laboratorium vergt tijd en veel aandacht voor detail. Hetzelfde werk dat wordt gedaan in een BSL-2 laboratorium met non-high-gevolg ziekteverwekkers zullen aanzienlijk langer duren in een BSL-4 setting. Deze verhoogde keer eis is te wijten aan een veelheid van factoren die gericht zijn op het beschermen van de onderzoeker van het laboratorium verworven infecties, de werkomgeving tegen mogelijke besmetting en de lokale gemeenschap van mogelijk vrijkomen van high-gevolg ziekteverwekkers. Binnen het laboratorium, wordt beweging beperkt door luchtslangen aan de verplichte full-body veiligheid past. Daarnaast wordt ontsmet elk item dat uit klasse II Bioveiligheidskasten (BSC) wordt verwijderd vereist. Laboratorium specialisten worden opgeleid in de praktijken van de BSL-4 laboratorium en moet een hoge vaardigheid in de vaardigheden die ze presteren tonen. De focus van dit artikel is om de juiste procedures en technieken om het laboratorium b garanderen schetseniosafety en experimentele nauwkeurigheid met behulp van een standaard virale plaque assay als een voorbeeld procedure. In het bijzonder, de juiste technieken om veilig in een BSL-4 omgeving werken bij het uitvoeren van een experiment visueel worden benadrukt. Deze technieken zijn onder meer: ​​het opzetten van een klasse II BSC voor experimenten, een goede reiniging van de klasse II BSC als u klaar bent werken, afvalbeheer en veilige verwijdering van afval dat wordt gegenereerd in een BSL-4 laboratorium, en het verwijderen van geïnactiveerde monsters van binnen uit een BSL- 4 laboratorium naar de BSL-2 laboratorium.

Introduction

Als de veiligheid van het laboratoriumpersoneel in de behandeling van high-gevolg ziekteverwekkers (geen infectie profylaxe of behandeling opties bestaan) voorop staat, heeft het Amerikaanse Department of Health and Human Services richtlijnen voor facility bouw en best practices voor de veilige uitvoering van het werk gelegd met pathogenen in biomedische en klinische laboratoria vanuit een perspectief bioveiligheid ^1. Door middel van wet- en regelgeving, veel van de praktijken en procedures hebben dwingende voorschriften die moeten worden gevolgd voor het werken met deze pathogenen worden. In de VS, ziekteverwekkers die gemakkelijk worden overgedragen van persoon tot persoon, resulteren in een hoge case-fataliteit tarieven, en / of het potentieel voor grote gevolgen voor de volksgezondheid en bioterrorisme, zijn gecategoriseerd als National Institute of Health / Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Disease (NIH / NIAID) Prioriteit A Pathogens en of de Centers for Disease control and Prevention (CDC) Bioterrorisme categorie A Agents ^2. Bovendien, hoge-gevolg ziekteverwekkers worden geclassificeerd als Tier 1 Selecteer Agents als deze pathogenen zijn potentiële bioterrorisme agenten, hebben potentieel voor slachtoffers of grote verwoestende gevolgen voor de economie, kritieke infrastructuur, of vertrouwen van het publiek ^3.

BSL-4 operaties, waaronder toegang tot instituten met BSL-4 laboratoria, zijn hoger gecontroleerd dan BSL-2/3 operaties. Zo is het aanzienlijk moeilijker om toegang tot een BSL-4 laboratorium vergeleken met een BSL-2 of BSL-3 laboratorium verkrijgen als gevolg van aanzienlijke pak opleidingseisen, uitgebreide mentorship eisen en bijkomende medische bioveiligheid vereisten. Daarnaast zijn er meestal meer fysieke veiligheid barrières in een BSL-4 faciliteit versus een BSL-2 of BSL-3 faciliteit ^4-6. Zoals uiteengezet in ons eerste artikel over BSL-4 entry en exit procedures, laboranten ondergaan een uitgebreide opleiding en psychologische screening in aanmerking te komen voor de toegang tot de BSL-4 laboratorium ^7. within de BSL-4 laboratorium, het risico van infectie en fouten worden vermeden of beperkt door het volgen van vastgestelde procedures. Onderzoek moet zorgvuldig en weloverwogen te werk gaan, met minimale multitasking of afleiding. Bukken in positieve druk pak is moeilijk, en het gezicht schild kunnen procedures zoals microscopie te beperken. Grof handschoenen belemmeren de prestaties van de fijne motorische taken, zoals het hanteren van kleine voorwerpen of het labelen van buizen. Om de tijd doorgebracht in BSL-4 laboratoria zoveel mogelijk te beperken, moet het laboratorium specialisten beoordelen procedures werken om stappen vooruit te kunnen worden gedaan in een BSL-2 laboratorium te identificeren en vervolgens te transporteren van deze materialen in de BSL-4 laboratorium voor de voltooiing van de taak (s). Bij het verwijderen van materialen voor verdere verwerking in BSL-2 laboratorium worden materialen bevestigd en verwijderd uit de BSL-4 laboratorium in een afgesloten secundaire container. Voorbeelden van monsters die moeten worden verwijderd omvatten: vaste platen of buizen van besmet materiaal wordt geanalyseerd door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescentietest (IFA), of polymerasekettingreactie (PCR).

Naast de grotere fysieke beperkingen opgelegd door persoonlijke beschermingsmiddelen nodig in BSL-4 laboratoria in vergelijking met die in BSL-2 laboratoria, procedures voor inactivatie van high-gevolg pathogenen in celkweek platen en afvalverwerking strenger zijn dan die nodig zijn voor minder pathogene virussen onderzocht in een BSL-2 laboratorium. Op een minimum, moet deze methoden voldoen aan CDC eis. Zo kan verontreinigd celkweekplaten en andere materialen worden geïnactiveerd met chemische reagentia, zoals neutraal gebufferde formaline. Behandelde celkweek platen of buizen zijn via een dunk tank gevuld met een vloeibaar ontsmettingsmiddel in heatseal zakjes met formaline worden geplaatst en verwijderd uit het laboratorium. Afval emmers gevuld met desinfecterende oplossingen en spray ontsmettingsmiddelen worden gebruikt voor het tijdelijk ontvangen van afval dat ontstaat tijdens het experiment en voor Disinfecting handschoenen, het schoonmaken van bioveiligheid kast oppervlakken en instrumenten, respectievelijk. Quaternaire ammonium desinfecterende oplossing bij de genoemde concentratie wordt beschouwd als de gouden standaard voor alle US BSL-4 laboratoria (Barr J, persoonlijke mededeling, 2015). Vast afval uit een emmer wordt geautoclaveerd om mogelijke verontreiniging te elimineren.

In een poging om visueel te tonen de workflow en beperkingen van algemene BSL-4 procedures, gebruikten we een standaard virale plaquetest als voorbeeld van een veelgebruikte virale procedure. Terwijl de virale assay procedure wordt beschreven in het algemeen, benadrukken we de bioveiligheid procedures die worden gebruikt om de veiligheid van het laboratorium personeel te waarborgen in dit protocol. Raadpleeg de vorige klassieke plaque assay visualisaties voor extra achtergrondinformatie over de plaque assay techniek ^8,9.

De hier gepresenteerde procedures volgen BMBL specificaties geschetst door CDC ^1. De gepresenteerde protocollenspecifiek voor de IRF-Frederick. Elke BSL-4 faciliteit heeft verschillende Standard Operating Procedures (SOP's) en werkmethoden die de uitvoering van experimenten invloed binnen de BSL-4 laboratorium. Alternatieve procedures voor de afvalstroom beheer en de uitvoering van plaque assays kunnen verschillen op basis van het beheer en de exploitatie van deze laboratoria. Toch zal een algemeen begrip van de opzet van een BSL-4 pak laboratorium en procedures voor het uitvoeren van werkzaamheden met klasse II kasten in de BSL-4 milieu te helpen wetenschappers begrijpen van de beperkingen en de gevolgen voor de veiligheid als een patiënte overweegt studies met een hoog risico ziekteverwekkers. Het toegenomen bewustzijn van externe medewerkers van de problemen rond het werk in een BSL-4 laboratorium kan leiden tot aangepaste verwachtingen en meer gemak bij het ontwikkelen van medische tegenmaatregelen in de onderzoekswereld.

Protocol

1. Laboratorium Entry

1. Verzamel alle benodigdheden van een BSL-2 laboratorium voor het experiment (bijvoorbeeld cellen, media, en verbruiksgoederen) voorafgaand aan binnenkomst in de BSL-4 laboratorium.
2. Vul het BSL-4 binnenkomst procedure (in detail beschreven in referentie ^7).

2. Voorbereiding van een klasse II bioveiligheid kast in de BSL-4 Laboratory

1. Eenmaal in de BSL-4 laboratorium zorgen de dagelijkse interne checklist (figuur 1) is afgesloten. Voltooi de controlelijst als de checklist niet eerder is ingevuld en aan welke virussen worden gebruikt. Als de controlelijst reeds is voltooid, voeg naa welk virus zal worden aan de lijst.
2. Reinig de Klasse II BSC door sproeien over de gehele binnenkant van de BSC (inclusief het raam) met dubbele 5% quaternaire ammonium desinfecterende oplossing (bijvoorbeeld n-alkyl dimethyl benzyl ammoniumchloride, n-alkyl dimethyl- ethyl benzyl ammoniumchloride of andere ontsmettingsmiddel geschikt is voor het middel dat wordt gebruikt) en veeg met keukenpapier ^10,11. Spray 70% ethanol-oplossing in de kast en de sjerp om de kleverige desinfecterende oplossing te verwijderen.
3. Indien gezet, zet de stoel voor de klasse II BSC op een comfortabele hoogte zodat de achterkant van de kast kan worden bereikt en dat het gezicht van de laboratoriumspecialist zich boven de frontopening (figuur 2) ^11.
4. Bereid een afvalcontainer voor de bioveiligheid kast. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van de dubbele quaternaire ammoniumverbindingen desinfecterende oplossing in de afvalcontainer is niet minder dan 5%. Dienovereenkomstig plannen en maak een 10% oplossing waarin afval wordt toegevoegd dat het desinfectiemiddel zal verdunnen. Plaats bovendien een spuitfles met 5% dual quaternaire ammonium desinfectiemiddel in de Klasse II BSC producten vóór verwijdering en handschoenen spuiten tijdens en na voltooiing van de test.
<li> Plaats de geschikte materialen voor de complete experiment in Klasse II BSC zover terug in de kast mogelijk herhaalde materiaal uitzetten van de Klasse II BSC en verstoring van de luchtstroom ¹¹ te voorkomen.

3. Voorbeeld: Plaque Assay

1. Ophalen virusbevattende monsters en controle virus uit de opslaglocatie handmatig ontdooien en materialen in een incubator bij 37 ° C.
2. Label de putjes van de 6-well platen voor gebruik volgens de virusverdunningen gepland. Markeer de deksels en het lichaam van de platen tot een succesvolle aanpassing te waarborgen wanneer de deksels en lichaam gescheiden zijn.
3. Breng materialen uit stappen 3,1-3,2 in de klasse II BSC. Plaats alle items die niet hebben of zullen niet in contact komen met het virus aan de ene kant ( "schone kant") en afval aan de andere kant ( "vuile kant"). Indien mogelijk houden "schone items" ten minste 30 cm, afgezien van "vuile items" tijdens aerosol-genererende activiteiten ¹1.
4. Werken als dichtbij de binnenwand midden van de klasse II BSC mogelijk, de binnencentrum is ontworpen om de meest effectieve positie om zich ¹¹ te beschermen.
5. Verwijder 50 ul virus monster en controle virus en plaats in 450 pl Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met 2% foetaal runderserum. Doorgaan met het maken van seriële verdunningen zoveel als nodig is (figuur 3A).
6. Tijdens de verdunningen, meng de virusmonsters minstens 5 maal met een pipetpunt langzaam en voorzichtig opgetreden bij luchtbel generatie minimaliseren in de monsters. Veranderen pipetpunten na elke toevoeging naar de volgende verdunning ook.
7. In de laatste verdunning, na het mengen van het monster 5 keer, gooi 50 ul van het virus monster in afvalcontainer om gelijke volumes verdunningen te waarborgen.
8. Bij het weggooien van tips, spoel elke tip met een ontsmettingsmiddel oplossing uit de emmer om de binnen- en buitenkant van de tip te ontsmetten voordat verdrijvening tip in de vuilbak.
9. Zodra de verdunningen worden gemaakt, stelt de verdunning putten opzij en beginnen opzuigen media uit de putjes van celkweek platen, waardoor er 500 ul van media in elk putje van een 6-wells plaat.
10. Wanneer afgewerkt met de pipetpunt, aspireren desinfecterende oplossing uit de emmer naar de top van de pipet met een handmatig, variabel volume, drukknop pipet, om een ​​goede reiniging van de binnenkant van de pipet waarborgen. Laat de tip in de afval bak tot aan het einde van het experiment.
11. Zodra de media van de platen verwijderd, voeg 100 ul van de juiste monster in de juiste putje in de gelabelde platen in tweevoud veranderende uiteinden elk voor elk monster.
12. Na voltooiing van de plaque assay inentingen, afspuiten handschoenen met de desinfecterende oplossing en gebruik een papieren handdoek gedrenkt in desinfecterende oplossing aan de buitenzijde van alle platen vegen voordat de plaat terug in de incubator hand. Opnieuwturf dit proces totdat alle platen zijn terug in de incubator.
13. Rock the plaatjes in een figuur-8 motion om een ​​goede verspreiding van de steekproef te waarborgen over de cellen elke 15 min gedurende 1 uur.
14. Na voltooiing van het schommelen platen terug platen in de klasse II BSC samen met een mengsel van 2 x Eagle's minimaal essentieel medium en 1,6% tragacanth, halfvaste overlay die gemakkelijker te manipuleren dan agarose, gebruikt voor de bekleding van de plaque assay.
15. Voeg 2 ml van de overlay mengsel aan elk putje in een 6-wells plaat en rock wederom in een figuur-8 ontwerp gelijkmatige verdeling van de overlay gehele oppervlak van de put. Herhaal dit proces tot alle goed gebruikt wordt bedekt met de overlay mengsel.
16. Zorg ervoor dat het uiteinde van serologische pipet geen vloeistof niet raakt in de putten om kruisbesmetting bij het uitvoeren van de overlay procedure te vermijden.

4. Afvalverwijdering en reiniging van de instrumenten en bioveiligheid Cabinet

<ol>

Volledig onderdompelen alle afvalmateriaal in 5% desinfecterende oplossing in de emmer voor een contacttijd van ten minste 10 min. Ontsmet pipetpunten, serologische pipetten en ander afval zoals hierboven beschreven. Bovendien, spuit de emmer (binnen en buiten) met 5% desinfecterende oplossing laat de oplossing in contact met het afval emmer voor een contacttijd van 10 min blijven.

Tijdens het wachten op het contact tijd te laten verlopen voor het afval, genieten van een papieren handdoek met 5% desinfecterende oplossing, vegen van instrumenten zoals micropipetten en verwijder ze uit de BSC. Spray gehandschoende handen met 5% desinfecterende oplossing alvorens gehandschoende handen uit de klasse II BSC.

1. Na het verwijderen van de micropipetten uit de BSC, veeg ze met een aparte papieren handdoek met 70% ethanol oplossing voor kleverige afzettingen op de instrumenten te voorkomen. Spray alle instrumenten die niet effectief worden afgenomen met 5% desinfectans en laat in contact met de oplossing in de BSC 10 min.

Na voldoende contacttijd, verwijdert u alle items uit de BSC. Neem items, met inbegrip van afval emmer met afvalstoffen, naar de gootsteen. Spoel de items die kunnen worden hergebruikt voor desinfectiemiddel resten te verwijderen. Terugkeren alle items om hun opslagplaatsen.

Reinig werkoppervlak de Klasse II BSC's, kabinet zijkanten en achterkant, het interieur van glas en sjerp ¹ met 5% desinfecterende oplossing, gevolgd door 70% ethanol-oplossing.

Trek en afvoer van de serologische pipetten uit het afval emmer en plaats-oppervlak gedesinfecteerd serologische pipetten in aparte pipet trays voor een autoclaaf (serologische pipetten kan een gevaar slijpsel presenteren en kan scheuren door de vuilniszak. Plaats deze pipetten in een harde-zijdige container vóór autoclaveren).

Giet de inhoud van de emmer in een zeef geplaatst in de bodem van de wasbak.

Breng een biologisch gevaarlijk afval container die is bekleed met een rode biohazard zak naar de gootsteen en dump de inhoud van de strainer in de rode biologisch gevaarlijk zak. Niet in de zeef om micropipet tips die kunnen kleven aan de binnenkant van de zeef te verwijderen. Hit de zeef langs de binnenkant van de afvalcontainer totdat alle tips worden verwijderd, of gebruik een pincet om tips van de zeef te verwijderen.

Spoel de emmer en plaats te drogen op het rek naast de gootsteen.

5. Autoclaveren Waste

1. Verwijder de biohazard zak uit de biologisch gevaarlijk afval container en plaats in een autoclaaf lade op een kar.
2. Laat biohazard zakken te openen en een stukje autoclaventape over de buitenzijde van de zak, verbindt de zijkanten van de autoclaaf lade naar de zak vastgezet in de bak te houden.
3. Plaats twee stukken van de autoclaaf tape op de serologische pipet tip tray en label het met zijn initialen en de datum. Plaats de serologische pipet dienblad op de kar met de autoclaaf lade.
4. Open de autoclaaf. Sluit de meegeleverde autoclaaf laden / lossen cart om de autoclaaf en brengen de intrekbare autoclaaf platform om te rusten op de kar.
5. Verwijder de metalen staaf uit de autoclaaf en open de top. Plaats een biologische indicator flacon met sporen van Geobacillus stearothermophilus in de metalen staaf om te controleren of de autoclaaf sterilisatie cyclus met succes is afgerond.
6. Plaats de metalen staaf in het midden van de afvalzak in de autoclaaf lade maar zorgen dat het draadmetaal nog gemakkelijk bereikbaar.
7. Plaats autoclaaf bak gevuld met afval en serologische pipet tray op de intrekbare autoclaaf platform en duw het terug in de autoclaaf.
8. Maak de autoclaaf laden / lossen wagen uit de autoclaaf en sluit de autoclaaf deur.
9. Start de autoclaaf.
10. Laat de autoclaaf niet verlaten totdat de cyclus is begonnen. Het bedrijfsresultaat scherm van de autoclaaf zal tijd te geven voor de resterende die run.
11. Nadat de autoclaaf run is voltooid, verwijdert u de biologische indicator en evalueren groei door verhitting in een gespecificeerde incubator. Als de groei wordt waargenomen op de biologische indicator, re-run de prullenbak in de autoclaaf, en te beoordelen opnieuw indicator. Als er geen groei wordt gedetecteerd, verwijder de prullenbak van de faciliteit.

6. Voorbeeld: Bevestiging en kleuring van Plaque Assays

1. Nadat het juiste aantal dagen (die afhankelijk is van het gebruikte virus) is verstreken, keren terug in het laboratorium en het uitvoeren van een steenworp afstand van de delen 1 en 2 weer.
2. Haal plaque assay platen uit de incubator in stap 3.1.2 voltooid, en plaats in de Klasse II BSC met de hand.
3. Pipet korting op alle van de media en overlay materiaal en afzien in desinfecterende oplossing container en te vervangen door een mengsel van 10% neutraal gebufferde formaline en 0,8% kristalviolet ^12,13. Laat het mengsel blijven de platen gedurende 30 min om het virus te inactiveren op de platen.
4. Na inactivatie, verwijder voorzichtig de neutralegebufferde formaline / kristalviolet mengsel en plaats in een aparte container afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering te worden geneutraliseerd.
5. Spray gehandschoende handen met een ontsmettingsmiddel en veeg de buitenkant van de platen voordat ze worden doorgegeven uit de klasse II BSC zoals hierboven beschreven.
6. Ga verder met de gootsteen, spoel de platen om overtollige vlek te verwijderen, en plaats de platen op een kar te drogen.
7. Zodra de platen helemaal droog zijn, gebruik dan een lichtbak aan de plaques tellen. Noteer alle tellingen en bereken virus titers van de standaard vergelijking (Figuur 3B).

7. verwijderen Monsters van de BSL-4 Laboratory

1. Inactiveren alle monsters die onder BSL-2 laboratoriumomstandigheden worden gemanipuleerd. Volg op twee manieren door de interne bioveiligheid kantoor aan de IRF-Frederick goedgekeurd middels 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) of Trizol LS (fenol, guanidine isothiocyanaat, ammoniumthiocyanaat, natriumacetaat, glycerol) ^1,14. Transfer samples naar een nieuwe schone buis of plaat buiten de BSC vóór het verpakken voor verwijdering uit de BSL-4 laboratorium.
2. Warm verzegelbaar geïnactiveerde monsters in buizen of platen in een warm verzegelbaar buidel bevattende 5% voldoende desinfecterende of fixatief aan de binnenkant van de zak en de buitenzijde van de monsterbuizen ondergaat overdracht uit de BSL-4 laboratorium desinfecteren. Plaats dit zakje in een ander zakje volgt dezelfde procedure.
3. Dicht de tweede buidel en plaats de warmte afgedichte zak in een dunk tank met 5% desinfecterende oplossing gedurende ten minste 10 min aan de buitenkant van de door warmte gelaste zak desinfecteren.
4. Vul een dunk tank logboek in het lab van de afbakening van het aantal en de grootte van buizen, volume in tubes, middel dat wordt gebruikt, inactivatie gebruikte methode, en de kamer waar de monsters zullen worden overgedragen.
5. Coördineren collega op de buitenkant van de BSL-4 laboratorium de buidel van de dunk tank halen bemonstering en de BSL-2 laboratorium.

Representative Results

Naar aanleiding van de juiste procedures binnen de BSL-4 laboratorium zijn van cruciaal belang voor het waarborgen van veilige en effectieve voltooiing van de assays. Onder verwijzing naar de voltooide dagelijkse interne checklist (figuur 1), laboratoriumpersoneel zorgen dat apparatuur volledig operationeel. Juiste positionering van het lichaam in het midden van de BSC zorgt ervoor dat het experiment werd uitgevoerd onder optimale luchtstroom omstandigheden (figuur 2). Het virus monster serieel verdund tot platen die 30-300 plaques per plaat (Figuur 3A) en te bepalen virustiter (figuur 3B) zijn verkregen. Een aantal factoren hebben invloed op de vorming van plaques, met inbegrip van virus tropisme voor host cellijnen, enten techniek, de voorwaarden voor groei van het virus, de juiste verdunning range, en overlay selectie ^8. Afvalstoffen die in de BSC tijdens de procedure correct is ontsmet vóór verwijdering uit de BSC en opnieuw door de autoclaaf voorafgaand aanwaarbij de BSL-4 omgeving. Door het volgen van deze procedures, zijn no-laboratorium verworven infecties zijn opgenomen tijdens BSL-4 onderzoek aan de IRF-Frederick.

Figuur 1:. Sample dagelijkse interne systemen checklist Daily voltooiing van deze checklist zorgt ervoor dat laboratorium personeel apparatuur heeft gecontroleerd in het laboratorium (vooral de BSC) voorafgaand aan de start van het werk. Als de BSC is gevonden buiten het gekalibreerde bereik te zijn, moet dit BSC niet worden gebruikt, en het onderhoud moeten worden gemeld. Alle BSC's moeten goed worden gekalibreerd en werkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2:. Achter- en zijaanzicht van een laboratoriumspecialist pipetteren monsters in een Klasse II bioveiligheid kast (A) Afvalverwerking emmer met gele ontsmettingsmiddel en gebruikte pipetten zijn rechts van de putjes (B) en de desinfecterende spray fles is het recht van de afval bak (a). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Berekening van virale titer van het monster virale titer is uitgedrukt in plaque vormende eenheden (pfu) per ml.. Om de virale titer te berekenen, tel het aantal duidelijk omschreven plaques (pfu) en delen door het product van de verdunningsfactor (d) maal het volume van de verdunde virus toegevoegd aan de bron (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het werk in een BSL-4 laboratorium vergt veel tijd en extra aandacht voor detail. Elk type van het werk in deze omgeving vereist goed opgeleid, grondig, en gewetensvolle individuen. De standaard virale plaque assay biedt een nauwkeurig model van een gemeenschappelijke procedure voor het werken met high-gevolg ziekteverwekkers in het BSL-4 laboratorium, als de test bestaat uit verschillende belangrijke concepten waarin laboratorium werknemers moet worden getraind.

De eerste belangrijke concept is het juiste gebruik en de toepassing van veilige praktijken in klasse II BSC, die functioneert als primaire containment voor high-gevolg ziekteverwekkers. Inzicht in hoe een klasse II BSC functies praktijken die de blootstelling risico's voor individuen sterk te beperken zal dicteren. Workflow van een schone ruimte ( "clean side") om besmette ( "vuile kant") in de werkzone in Klasse II BSC helpt ook om kruisbesmetting te ¹¹ voorkomen. Schone en verontreinigde materialen en supplies moeten worden gescheiden om de beweging van besmette items meer dan schone items te beperken.

De tweede belangrijke concept is het beheer van fysieke en biologisch afval. Juiste stappen in de afzet beide soorten afval zijn van essentieel belang om ervoor te zorgen dat het laboratorium specialisten veilig blijft en het milieu niet verontreinigd. Stappen tijdens een experiment zijn ontworpen om te inactiveren en ziekteverwekkers te vernietigen voordat monsters van BSL-4 laboratorium worden gebracht. Voorbeelden van dergelijke kritische stappen zijn onder meer: ​​pipetteren ontsmettingsmiddel in elk tip, waardoor ten minste een 10 min contacttijd van mogelijk besmette materialen met ontsmettingsmiddelen, een autoclaaf afval, en valideren van steriliteit tijdens autoclaaf cycli. Deze stappen zijn bedoeld redundant tot de vernietiging van high-consequentie pathogenen te verzekeren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Chem Plus	National Chemical Laboratories	255
Ethanol	Fisher	BP2818500
2 ml 96-Deep Well Plates	Fisher	278743
10 ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11E
25 ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11
6-well plates	Fisher	140675
Crystal Violet	Sigma	HT90132-1L
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	22-050-105
Tragacanth	Fisher	50-702-2000
20 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-550
200 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-561
1,000 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-581
DMEM	Lonza	12-604Q
FBS	Sigma	F2442-500mL
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
2x EMEM	Quality Biological	115-073-101
Pipettor	Drummond	4-000-101
1,000 μl Pipette	Rainin	L-1000XLS+
200 μl Pipette	Rainin	L-200XLS+
12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor	Rainin	L12-200XLS+
8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor	Rainin	LA8-1200XLS
Attest	Express Medical Supplies	MMM12192
Autoclave	Getinge	GEB 2404 AMB-2
Autoclave Bag	Fisher	01-828E
2,000 ml Beaker	Fisher	02-591-10H
Autoclave Tray	Fisher	13-359-20B
Pipette Tray	Fisher	13-361-5
37 °C Incubator	Fisher	WU-39321-00
Biohazard Can	Rubbermaid Commercial	FG614500 RED
Autoclave Tape	Fisher	15-903
Autoclave Rod	Made by IRF Facility	N/A
Light Box	Fisher	S11552
Heat Sealer	Fisher	NC9793612
Heat Seal Pouches	Fisher	01-812-25H
Biohazard Bag	Fisher	01-828E